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Medicine

Endothelin-1 induzierte Middle Cerebral Artery Occlusion Modell für ischämischen Schlaganfall mit Laser Doppler Flowmetrie Guidance in Rat

Published: February 16, 2013 doi: 10.3791/50014
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 4, 1, 3
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran, 3Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida, 4Department of Neurology, University of Florida

Summary

Mehrere Tiermodelle von zerebraler Ischämie wurden entwickelt, um den menschlichen Zustand des Schlaganfalls simulieren. Dieses Protokoll beschreibt die Endothelin-1 (ET-1) induzierte mittlere Zerebralarterie (MCAO) Modell für ischämischem Schlaganfall bei Ratten. Darüber hinaus sind wichtige Erwägungen, Vorteile und Nachteile dieses Modells diskutiert.

Abstract

Der Schlaganfall ist die häufigste Ursache von Behinderung und dritte führende Todesursache in der Welt, kostet schätzungsweise 70 Milliarden Dollar der Vereinigten Staaten im Jahr 2009 1, 2. Mehrere Modelle von zerebraler Ischämie wurden entwickelt, um den menschlichen Zustand des Schlaganfalls imitieren. Es wurde vorgeschlagen, dass bis zu 80% aller Striche ergeben sich aus ischämischem Schaden in der mittleren zerebralen Arterie (MCA) Bereich 3. In den frühen 1990ern, Endothelin-1 (ET-1) 4 wurde verwendet, um Ischämie durch die Anwendung direkt angrenzend an die Oberfläche des MCA nach Kraniotomie induzieren. Später wurde dieses Modell 5 mit einem stereotaktische Injektion von ET-1 neben dem MCA zu fokaler zerebraler Ischämie zu produzieren geändert. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind die Fähigkeit, die Verfahren rasch durchzuführen, die Fähigkeit zur Arterie Verengung durch Änderung der Dosis von ET-1 unter Kontrolle bringen, keine Notwendigkeit, die extrakraniellen Gefäße mit Blut versorgt das Gehirn als auch schrittweise reperfusi manipulierenauf Raten, dass mehr ahmt die Reperfusion beim Menschen 5-7. Auf der anderen Seite hat die ET-1-Modell Nachteile, die die Notwendigkeit eines Kraniotomie, sowie höhere Variabilität in Hubvolumen 8 umfassen. Diese Variabilität kann durch die Verwendung von Laser-Doppler-Flußmessung (LDF) nach zerebraler Ischämie während ET-1 Infusion verifizieren reduziert werden. Faktoren, Schlaganfall Variabilität beeinflussen, gehören Präzision der Infusion und der Charge des ET-1 verwendet 6. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass, obwohl ein gemeinsames Auftreten Reperfusion in menschlichen Schlaganfall ist, kann die Dauer der Okklusion für ET-1-induzierten MCAO nicht genau imitieren, dass menschlicher Schlaganfall wo viele Patienten partielle Reperfusion über einen Zeitraum von Stunden bis Tagen haben nach einem Verschluss 9, 10. Dieses Protokoll wird im Detail die ET-1-induzierten MCAO Modell für einen ischämischen Schlaganfall bei Ratten zu beschreiben. Es wird auch die Aufmerksamkeit auf besondere Überlegungen und mögliche Nachteile während des gesamten Verfahrens.

Protocol

Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der University of Florida zugelassen und ist in Übereinstimmung mit dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (achte Auflage National Academy of Sciences, 2011).

Materialien

  1. Tiere: Acht-Wochen-alt, männlich, Sprague Dawley Ratten (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) mit einem Gewicht von 250-300 g zum Zeitpunkt der Operation.
  2. Anästhesie
    1. Inhalationsanästhesie System (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
    2. Isofluran Narkose (Baxter Pharmazie, Deerfield, IL, USA)
  3. Stereotaktische System (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
    1. Kleintier stereotaktischen Systems
    2. Non-Ruptur Ohr Bars für Ratten
    3. Gas Anästhesie Kopfhalter für Ratten
  4. Temperatur-Regelung
    1. BAT-12 Mikrosonde Thermometer (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. T / PUMP, TP600 Thermal Decke (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
  5. Chirurgische Instrumente
    1. Skalpellgriff und # 11 Klinge, Iris Pinzette, Graefe Pinzette, bulldog clamp Retraktoren, Schraubendreher, 10 ul Spritze mit 26 Gauge abgeschrägte Nadel (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. Mikromotor Bohrer und stereotaktischen Halter, Quintessential Stereotaktische Injector (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
    3. 1,0 mm Rosenbohrer bur, 1,0-mm-Upside Konusbohrer bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
  6. Surgical Supplies
    1. Befestigungsschrauben 0-80 X 3/32 mit 2,4 mm Schaftlänge, 21-Gauge Führungskanüle [4mm lang unterhalb des Sockels] und Kanüle dummy (Kunststoffe ein, Roanoke, VA, USA)
    2. Jet Prothesenkunststoff und Flüssigkeit (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA)
    3. 3,0 Nylonnaht (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    4. Wattestäbchen, Puralube Augensalbe (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)
    5. Haarschneidemaschine (Oster, Providence, RI, USA)
  7. Chemicals
    1. Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Chlorhexidin 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
    3. Buprenorphin HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA)
  8. Visualisierung Ausrüstung
    1. Operationsmikroskop (Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA)
    2. Fiber Optic Illuminator (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA)
  9. Laser-Doppler-Flussmessung System (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA)
    1. StAndard Bleistift Probe
    2. Sondenhalter
    3. Blutflußmesser
    4. Powerlab 4/30 mit LabChart 7
  10. Messung Infarktvolumen
    1. Rattenhirn Matrix (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) und 0,05% in PBS verdünnt
    3. Flachbett-Scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA)
    4. Image J Software (ImageJ 1.42q Software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

Ein. Präoperative Steps

  1. Vor der Operation werden die Ratten unter einem 12:12 Hell / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Nagetierfutter untergebracht.
  2. Narkose mit Isofluran in 4% 100% O 2-Gasgemisch in einer Ansaugkammer, bis der Ratte nicht mehr Abhebungen Hinterpfote Pinch induziert.
  3. Aseptischem Technik sollte bei diesem Verfahren einschließlich der Verwendung von sterilen Handschuhe, sterilen chirurgischen Instrumenten, und einem sterilen chirurgischen Abdecktuchs 11 aufgehoben.
  4. Die Krone des Kopfes mit elektrischen Haarschneidemaschinen rasiert.
  5. Die Ratte wird in Bauchlage auf einem saugfähigen Kissen, das auf einer Temperatur-gesteuerten Bedienfläche (Wärmedecke) platziert.
  6. Der Kopf ist in der stereotaktischen Vorrichtung beginnend mit Plazierung des Gases Anästhetikum Gesichtsmaske platziert.
  7. Anschließend werden die Stäbe Ohr eingesetzt und verschlossen.
  8. Während des Verfahrens Anästhesie mit 2% Isofluran in 100% O 2-Gasgemisch aufrechterhalten wird.
  9. Schmiermittel Augensalbe ist mit beiden Augen aufgetragen und die Augenlider geschlossen sind, um Austrocknung Auges während des chirurgischen Verfahrens zu verhindern.
  10. Rektale Temperatursonde eingeführt wird, um eine konstante tierischen Kerntemperatur von 37 ± 0,5 ° C zu halten
  11. Mit dem Kopf fest in der stereotaktischen stattVorrichtung ist das Operationsgebiet mit alternierenden gereinigt 2% Chlorhexidin und Kochsalzlösung dreimal.

2. Chirurgische Steps

  1. Verwendung eines Skalpells wird eine Inzision auf der Haut über dem Schädeldach aus den caudalen Aspekte der Augen (Nasion), um zwischen den Ohren (superior nuchal Linie) hergestellt.
  2. Die Haut wird dann seitlich mit 3 Bulldogklemmen eingefahren.
  3. Bindegewebe aus dem Schädel mit trockenen Wattestäbchen, so dass mehrere Strukturen deutlich zu erkennen, entfernt werden kann. Dazu gehören Bregma, die Kranznaht und das Recht lateralen Schädelbasis Kamm. Wattestäbchen werden verwendet, um Blut aus dem Operationsbereich entfernt werden.
  4. Verwendung des Operationsmikroskops wird Bregma befindet, und die stereotaktische Manipulatoren werden eingestellt, bis der Bohrer rund 1,0 mm Bohrer bei Bregma genullt wird.
  5. Der Bohrer Bohrer wird dann auf 1,6 mm anterior und 5,2 mm lateral bregma verschoben.
  6. A bur Loch, das den Schädel eindringt für cann gebohrtula Platzierung (Abbildung 1). Excess Schmutz und Blut sind ständig gelöscht wird, Wattestäbchen.

An diesem Punkt kann ein Führer Kanüle eingeführt (Schritt 7) oder eine direkte ET-1 Injektion durch die bur Loch durchgeführt (gehen Sie direkt zu Schritt 16) werden.

  1. Anschließend bur Löcher für Befestigungsschrauben 3 sind durch partielle Dicke des Schädels unter Verwendung eines 1,0 mm Bohrer bur umgekehrten Kegels (Abbildung 1) gebohrt. Ein Loch ist in jedem Stirnbeins etwa 1-2 mm ventral der Kranznaht und 1-2 mm seitlich von der Sagittalnaht gebohrt. Ein Loch ist in der Scheitelbein etwa 2-3 mm hinter der Kranznaht und 2-3 mm seitlich von der Sagittalnaht ipsilateral zur Führungskanüle bur Loch gebohrt. Drei 0-80 x 3/32 Befestigungsschrauben sind in diesen bur Löchern platziert und wird die Unterstützung für die Zement-Holding in der Kanüle bieten. Die Schrauben sind nur fortgeschrittene 2 oder 3 Umdrehungen, um nicht die Dura Materie beschädigen. Die Führungskanüle in der stereotaktischen Kanülenhalter platziert und bregma befindet.
  2. Die stereotaktische Manipulatoren werden eingestellt, bis die Führungskanüle bei bregma Null ist. Die Kanüle wird der Bohrer Loch befindet 1,6 mm anterior und 5,2 mm lateral bregma verschoben.
  3. Schließlich wird die Führungskanüle in die Fräse Loch mit der endgültigen Position der Spitze von 4,5 mm ventral von Bregma abgesenkt.
  4. Laser-Doppler-Sonde Platzierung (optional)
    1. Um zerebralen Blutflusses mittels LDF überwachen, kann eine Sonde Halter in Position gebracht werden, bevor die Anbringung der Führungskanüle mit Zahnzement.
    2. Der Sondenhalter Basis getrimmt bündig mit dem Sockel außer für kleine keilförmige Registerkarte.
    3. Die Sonde wird dann Halter platziert posterior der Führungskanüle und nur medial der lateralen Schädelbasis Grat mit der Lasche ausgerichtet medial (Abbildung 1).
    4. Der Sondenhalter und guide Kanüle zusammen mit Zahnzement befestigt.
  5. Dentalzement wird dann verwendet, um die Kanüle an Ort und Stelle zu sichern. Der Zement in Kontakt mit allen drei Schrauben und umgibt die gesamte Basis der Kanüle.
  6. Der Zement sollte vollständig trocken vor der Entfernung des Kanülenträgers. Dieser Vorgang dauert ca. 5 min.

Nach diesen Schritten kann der Operationswunde geschlossen und die Kanüle Dummy in die Führungskanüle geschraubt werden. Alternativ kann ET-1 induzierten MCAO an der Ratte nach einer Erholungsphase von der Kanüle Implantationschirurgie durchgeführt werden. Für dieses Verfahren aus, muss Schritt 19 weiter durchgeführt werden und die Schritte 14-18 können zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden. Um Führungskanüle Implantation und ET-1 Einspritzung während der gleichen Operation durchzuführen, muss Schritt 14 weiter durchgeführt werden.

  1. Die Infusionsspritze mit ET-1 geladen (verdünnt auf 80 pM in PBS) und dann montiert in der stereotaktischen Injektors.
  2. Diestereotaxischen Manipulatoren werden eingestellt, bis die Spitze der Nadel am Rand der Führungskanüle genullt wird.
  3. Die Nadelspitze wird durch die Führungskanüle zu einer Position von 17,2 mm ventral von der Felge des Führungskanüle abgesenkt. Wenn eine Führungskanüle nicht verwendet wird, wird die Spitze der Nadel Bregma genullt und abgesenkt durch den Bohrer in eine Stellung Loch 8,7 mm ventral von Bregma.
  4. 3 ul von 80 uM ET1 wird mit einer Rate von 1 ul pro min infundiert.
  5. Die Spritze wird an Ort und Stelle für 3 min verlassen nachdem die Infusion beendet ist und dann langsam entfernt.
  6. Der Schnitt wird mit 3,0 Nylonnaht und die Kanüle Dummy in die Kanüle verschraubt.
  7. Eine Dosis von geeigneten Schmerzmitteln (zB Buprenorphin bei 0.05-0.1 mg / kg) sollte nach der Operation verwendet werden, um Schmerzen und Beschwerden während der Erholungsphase zu minimieren.
  8. Die Ratte wird von der OP entfernt und in einem warmen, trockenen Recovery-Bereich auf Unterkühlung zu verhindern, mit kostenlosen, einfachen Zugriff auf weiche Nahrung und Wasser.

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Representative Results

Ein. Post-Op neurologischen Untersuchung

Nachdem das Tier wieder zu sich, kann eine Vielzahl von Tests verwendet werden, um neurologische Defizite einschließlich Balance, Griffstärke paw Platzierung, Haltungsschäden Asymmetrie und Treppen steigen zu bewerten. Die Sonnenblumenkerne Aufgabe ist eine grobe Einschätzung der motorischen und sensorischen Funktion, die signifikante Korrelation hat mit Infarktvolumen 7, 12. Während dieser Aufgabe werden Ratten Zeitüberschreitung beim Öffnen und verbrauchen 5 Sonnenblumenkerne. Die fünf Samen werden in einer Ecke eines leeren, Trocken, Kunststoffkäfig platziert und der Zeitaufwand für die Manipulation der Samen wird aufgezeichnet. Darüber hinaus wird die Anzahl der Schalenstücke im Käfig, nachdem alle Samen geöffnet wurden und verbrauchte aufgezeichnet. Ratten, die mit größeren neurologisches Defizit wird länger dauern, zu öffnen und zu konsumieren, die Samen und die Schalen in mehr Stücke brechen. Obwohl keine formelle Teil dieser Aufgabe, ist es leicht zu häufigen Misshandlung und Ablegen der Sonnenblumenkerne zu beobachtens von Ratten nach experimentellem Schlaganfall. Dies schließt die Verwendung von überwiegend ein Vorderpfote und ineffektiv Beißen der Shell während der Versuche zu öffnen.

2. Anfärbung und quantitativen Messung von Gehirn Infarktvolumen

Nach Okklusion und Reperfusion des MCA, um transiente zerebrale Ischämie zu etablieren, sind die Tiere eingeschläfert und ihre koronal geschnittene Gehirn werden mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) gefärbt, um die Infarktvolumen (Abbildung 2), wie in unseren früheren Publikationen diskutiert evaluieren 7, 13.

Abbildung 1
Abbildung 1. Dorsale Ansicht der Ratte Schädels darstellen Hardware Platzierung. Dieser dorsale Ansicht der Ratte Schädel mit vorderen orientiert sich an der linken Seite zeigt die Lage der bregma und Lambda in Bezug auf die Nähte, die visualisiert werden können nach dem Löschen BindeGewebe aus der Kopfoberfläche. Die laterale Rippe Schädels, Führungskanüle, LDF Sondenhalter und Verankerungsschrauben werden ebenfalls auf dem Diagramm mit den relativen Beziehungen Schädels Landmarken und nebeneinander angezeigt.

Abbildung 2
Abbildung 2. TTC-gefärbten seriellen koronalen Gehirnschnitte (2 mm) von der Ratte auf ET-1 induzierten MCAO unterzogen. Ein Vertreter aus Gehirn einer Ratte nach ET-1 induzierten MCAO gezeigt. Das Gehirn wurde entfernt und in eiskaltem PBS gespült, bevor sie geschnitten koronal in 2 mm dicke Abschnitte beginnend unmittelbar kaudal der Riechkolben. Die Scheiben wurden dann in 0,05% inkubiert TTC in PBS bei 37 ° C verdünnt, bevor sie in PBS abgeschreckt und dann kurz in Formalin fixiert. Tissue rot gefärbt nach der Exposition gegenüber TTC stellt tragfähige grauen Substanz. Die lebensfähige grauen Substanz in der Hemisphäre ipsilateral zur ET-1 Injektion kann mit dem grauen m verglichen werdenatter des kontralateralen, um den Bereich der Hirninfarkt berechnen.

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Discussion

Die ET-1-induzierten MCAO ist ein etabliertes Modell der experimentellen ischämischen Schlaganfall, die regelmäßig in mehreren Rattenstämmen verwendet wird. Viele Variablen, wie Rattenstamm, Alter der Tiere, die Körpertemperatur, Anästhesie-Methode und Betreiber Expertise kann zu einer erhöhten Variabilität Infarkt Volumina führen, wenn man dieses Modell 5, 14. Jedoch haben mehrere Forscher gezeigt, dass Vorteile dieses Modell die relativ nicht-invasive Ansatz Dosis des zerebralen Blutflusses an ET-1, und die Fähigkeit zur Anästhesie ganz zu vermeiden durch Infusion von ET-1 in wachen Ratten 14, 15 gehören. Es ist bemerkenswert, dass es viele Unterschiede in Rattenstamm und Alter in der Literatur verwendet und es ist nicht überraschend, dass verschiedene stereotaktischen Koordinaten gemeldet werden abhängig von diesen Variablen. Die Koordinaten verwendet in unserem Protokoll für 8 Wochen alten männlichen Sprague Dawley Ratten optimiert. Jede Abweichung von dieser Sorte, Geschlecht oder Alter wird wahrscheinlich verlangen intrazerebrale Injektionion von Farbstoff gefolgt von der Obduktion gültige Koordinaten für dieses Verfahren zu identifizieren. Zusätzlich ist ET-1-induzierte Verminderung des zerebralen Blutflusses dosisabhängig. Die Dosis Verwendung in diesem Verfahren verursacht einen Infarkt von etwa 30-40% der grauen Substanz in der Hemisphäre ipsilateral zur Injektion mit einer Standardabweichung vom Mittelwert von etwa 4-5% innerhalb eines Experiments 7, 16. Direkte Visualisierung proximalen Abschnitte des MCA zeigt einen luminalen Durchmesser aufweist, auf 0% der Basislinie geht innerhalb von 3 min und kehrt zum Ausgangswert von ca. 30 min 7. Mit LDF wurde maximalen Durchfluss gezeigt, auf ca. 10% des Ausgangswertes Strömung in 5-7 min zu verringern mit allmähliche Rückkehr zu 60% des Ausgangswertes nach 1 Std. die Überwachung 16 eingestellt wurde.

Weitere technische Details, die Haftbefehl erwähnt sind nachfolgend aufgelistet:

  1. Richtig Ortung und Nullstellung der stereotaktischen Geräte am bregma (unter mikroskopischer Führung) ist entscheidend für die inducing ein erfolgreicher Schlag. Die stereotaktischen Koordinaten für die ET-1-Infusion für den speziellen experimentellen Geräte und Rattenstamm vor den Experimenten bestätigt werden. Es ist wahrscheinlich, dass keine Läsion wird auftreten, wenn die Infusion nicht innerhalb von 0,5 mm der MCA 6.
  2. Achten Sie darauf, nicht zu Schädigungen des Gehirns führen, wenn das Bohren des Vorkörner Loch für die Führungskanüle. Es wird empfohlen, dass eine langsame Bohrgeschwindigkeit verwendet werden, um den Bohrer Loch beginnen und gegen Ende wieder, so dass die Chancen des Eindringens in das Gehirn zu minimieren.
  3. Beim Bohren bur Löcher für die Befestigungsschrauben, verwenden Sie den umgekehrten Kegel Bohrer bur eine bur Loch, das nur teilweise durchdringt den Schädel zu schaffen. Nur tief genug, so dass die Schrauben stabil sind bohren.
  4. Wenn Zementierung der Kanüle an Ort und Stelle sicher sein, um den Zement weg von der Haut sowie die stereotaktischen Arm zu halten. Der Zement kann vor dem Trocknen mit einem Wattestäbchen manipuliert werden.
  5. Seien Sie sicher, dass der Zement ist komplett dry und der Kanüle ist stabil vor der Entfernung des Kanülenträgers. Es ist wichtig, dass die Kanüle nicht vor ET-1 Injektion zu bewegen.
  6. Nach unserer Erfahrung ist die ET-1 Hubmodell eine etwa 20% Sterblichkeit aufgrund des chirurgischen Eingriffs. Es ist wichtig zu Mortalitätsraten zwischen Behandlungsgruppen und auch Plan Experimente vergleichen, so dass ausreichende Stichprobengröße für neurologische und histologische Endpunkte verwendet werden.
  7. Richtlinien für die vorklinischen Studien für die akute Schlaganfall-Therapie empfehlen Hirndurchblutung Überwachung und physiologischen Überwachung von Blutdruck, Temperatur, Glukose und Blutgase der Variabilität während der Experimente 17 zu reduzieren. LDF ist eine Methode, die zur Echtzeit-Überwachung des Blutflusses in verschiedenen anatomischen Bereichen verwendet werden kann, um eine vorbestimmte Schwelle für die Verringerung der Strömung zu überprüfen wurde erreicht.
  8. Achten Sie darauf, die Infusion Spritze und Nadel mit Ethanol und Kochsalzlösung zwischen den Injektionen zu reinigen, und Ethanol vorLagerung. Dieses Verfahren geben konsequente Rückzug und Injektion von ET-1Ohne Luftblasen oder Verstopfungen während des Betriebs.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem American Heart Association Großraum Southeast Affiliate (09GRNT2060421), die American Medical Association, und von der University of Florida Clinical and Translational Science Institute unterstützt. Adam Mekka ist eine NIH / NINDS, NRSA Chemiefonds fellow (F30 NS-060.335). Robert Regenhardt erhalten Promotionsstipendium Unterstützung von der University of Florida Multidisziplinäre Training Program in Hypertension (T32 HL-083810).

Materials

  1. Animals: Eight-week-old, male, Sprague Dawley rats (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) weighing 250-300 g at the time of surgery.
  2. Anesthesia:
    1. Inhalation anesthesia system (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
    2. Isoflurane anesthetic (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
  3. Stereotaxic system (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA):
    1. Small animal stereotaxic system
    2. Non-rupture ear bars for rats
    3. Gas anesthesia head holder for rats
  4. Temperature regulation:
    1. BAT-12 microprobe thermometer (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. T/PUMP, TP600 Thermal blanket (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
  5. Surgical instruments
    1. Scalpel handle and #11 blade, iris forceps, Graefe forceps, bulldog clamp retractors, screwdriver, 10 μl syringe with 26 gauge beveled needle (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. Micromotor drill and stereotaxic holder, Quintessential Stereotaxic Injector (St–lting, Wood Dale, IL, USA)
    3. 1.0 mm round drill bur, 1.0 mm inverted cone drill bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
  6. Surgical Supplies
    1. Mounting screws 0-80 X 3/32 with 2.4 mm shaft length, 21-gauge guide cannula [4mm long below the pedestal] and cannula dummy (Plastics one, Roanoke, VA, USA)
    2. Jet denture acrylic and liquid (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA)
    3. 3.0 nylon suture (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    4. Cotton swabs, Puralube eye ointment (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
    5. Electric hair clippers (Oster, Providence, RI, USA)
  7. Chemicals:
    1. Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Chlorhexidine 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
    3. Buprenorphine HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA)
  8. Visualization Equipment
    1. Surgical microscope (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA)
    2. Fiber Optic illuminator (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)
  9. Laser Doppler flowmetry system (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA)
    1. Standard Pencil Probe
    2. Probe holder
    3. Blood FlowMeter
    4. Powerlab 4/30 with LabChart 7
  10. Measurement of infarct volume:
    1. Rat brain matrix (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) diluted to 0.05% in PBS
    3. Flatbed scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA)
    4. Image J software (ImageJ 1.42q software, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  17. Fisher, M., et al. Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations. Stroke. 40, 2244-2250 (2009).

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