Använda en Kranial fönster för att visualisera den mellersta cerebrala artären under Endotelin-1 inducerad Middle cerebral artärocklusion

Summary

I den här artikeln beskrivs en metod för att visualisera råtta cerebrala artärer genom ett kranial fönster med temporal kraniektomi för att visa proximala delar av mellersta cerebrala artären (

Abstract

Skapande av en kranial fönster är en metod som tillåter direkt visualisering av strukturer på den kortikala ytan av hjärnan ^1-3. Denna teknik kan utföras på många platser överliggande råtta storhjärnan, men lättast utförs genom att skapa en kraniektomi över de lättillgängliga framifrån eller parietalbenen. Oftast har vi använt denna teknik i kombination med endotelin-1 arteria cerebri media ocklusion modell av ischemisk stroke att kvantifiera förändringar i arteria cerebri media kärldiameter som uppträder med injektion av endotelin-1 i hjärnparenkymet intill den proximala MCA ^{4, 5.} För att visualisera den proximala delen av MCA under endotelin -1 inducerad MCAO, använder vi en teknik för att skapa en kraniell fönster genom tinningbenet på den laterala aspekten av rått skallen (figur 1). Hjärnans kärl kan visualiseras antingen med dura intakt eller med dura anskäras och retracted. Oftast lämnar vi dura intakt under visualisering eftersom endotelin-1-inducerad MCAO innebär leverans av kärlsammandragande peptiden i hjärnparenkymet. Detta kringgår behovet att incise dura direkt över visualiserade fartyg för drug delivery. Detta protokoll beskriver hur du skapar en kraniell fönster för att visualisera cerebrala artärer i en stegvis sätt, samt hur man kan undvika många av de potentiella fallgropar som rör denna metod.

Protocol

Detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Florida och är i överensstämmelse med "Guide för vård och användning av försöksdjur" (åttonde upplagan, National Academy of Sciences, 2011).

Material

1. Djur: Åtta veckor gamla, manlig, Sprague Dawley-råttor (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) vägande 250-300 g vid tidpunkten för operation.
2. Anestesi
   1. Inhalationsanestesi system (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
   2. Isofluran anestesi (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
3. Stereotaxiska systemet (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
   1. Små djur stereotaxiska systemet
   2. Icke-ruptur örat barer för råttor
   3. Gasanestesi huvudet innehavaren för råttor
4. Temperaturreglering
   1. BAT-12 mikrosondanalys termometer (WorldPrecision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
   2. T / PUMP, TP600 värmefilt (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
5. Kirurgiska instrument
   1. Metzenbaum sax, iris pincett, bulldog klämma upprullningsdon, 10 pl spruta med 26 gauge avfasade nål, Bovie diatermi kit (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
   2. Mikromotorer borr (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
   3. 0,8 mm rund borr bur (Roboz Kirurgiska Instrument Co, Inc., Gaithersburg, MD, USA)
   4. STORZ Bonn suturering Tång (Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA)
6. Kirurgiska Supplies
   1. 3,0 nylon sutur (Oasis, Mettawa, IL, USA)
   2. Bomullstoppar, Puralube ögonsalva (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
   3. Kirurgiska punkter och band (Medtronic Xomed, Inc., Jacksonville, FL, USA)
   4. Elektriska hårklippningsmaskiner (Oster, Providence, RI, USA)
   Kemikalier
   1. Endotelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
   2. Klorhexidin 2% (Agrilabs, St Joseph, MO, USA)
7. Visualisering Utrustning
   1. Operationsmikroskop (Seiler Instrument och tillverkning, St Louis, MO, USA)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokyo, Japan)
   3. Fiber Optic Illuminator (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA)
8. Mätning av kärldiameter
   1. VLC media player (Paris, Frankrike)
   2. Bild J programvara (ImageJ 1.42q programvara, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

1. Pre-kirurgiska steg

1. Före operation, är råttorna inrymda under en 12:12 ljus / mörker-cykel med fri tillgång till vatten och gnagare.
2. Anestesi induceras med 4% isofluran i 100% O ₂ gasblandning i en induktion kammare.
3. Kråkan n av huvudet är rakat med elektriska hårklippningsmaskiner.
4. Råttan placeras i en liggande position på en absorberande dyna som ligger på en temperatur-kontrollerad drift yta (värmefilt) och huvudet placeras i den stereotaktiska anordningen börjar med placering av gasen anestetikum ansiktsmasken.
5. Därefter örat barer in och dras åt.
6. Under förfarandet anestesi upprätthålls med 2% isofluran i 100% O ₂ gasblandning.
7. Oftalmiska smörjmedel salva appliceras på båda ögonen, och ögonlocken är stängda för att förhindra uttorkning öga under den kirurgiska proceduren.
8. En rektal temperatursond införs för att upprätthålla en konstant temperatur djur kärna av 37 ± 0,5 ° C.
9. Med chefen för den sövda råttan hålls stadigt i den stereotaxisk anordning operationsområdet renas med omväxlande klorhexidin och saltlösning tre gånger.

2. Pre-kranial fönster Förberedelser

ontent "> Innan skapa en kraniell fönster, bör råttan förberedas för några experiment genom implantation av andra nödvändiga hårdvara och bör erhålla nödvändigt kirurgiska procedurer. För detta protokoll, har vi tidigare implanterad en guide kanyl för endotelin-1 (ET- 1) inducerad MCAO visas i ett följe publikation med titeln "Endotelin-1 inducerad Middle cerebral artärocklusion modell för ischemisk stroke med laser Doppler Flowmetry Vägledning i Rat."

3. Skapandet av Kranial fönster

Efter placering av en styrning kanyl eller utrustning som krävs för experiment, är en kraniell fönster skapas för att direkt visualisera proximala delarna av den mellersta cerebrala artären under en stroke procedur.

1. Först saxar för att incise huden överliggande temporalis muskeln börjar medialt och arbeta i sidled.
2. Den temporalis muskeln tudelas användning diatermi och sedan tillbaka med 3,0 nylonsutur till visua Lize den skvamösa delen av tinningbenet.
3. En ca 3-4 mm i fyrkant ritas på skvamösa delen av tinningbenet kaudalt om bana och överlägsen bas zygomatic process eftersom det reflekteras av tinningbenet.
4. En borr används för att gradvis skära skisserade benbit fri från tinningbenet. Försiktighet bör vidtas för att undvika att tillämpa för mycket tryck till borren eftersom det är möjligt att skada dura eller hjärnbarken.
5. Täta sköljningar med steril koksaltlösning utförs för att förbättra visualiseringen av det kirurgiska området och förhindra överhettning av skallen.
6. Börjar på en lös hörn är bit temoporal ben försiktigt bort med fina råtta-tandade tång samtidigt se till att inte riva några fartyg i samband med dura.
7. Dura lämnas intakt och skräp sköljs bort med steril saltlösning.

4. Inspelning av cerebral artär Sammandragning

tält "> För att visa hur att ta bilder i realtid, en råtta som genomgår ET-1-inducerad MCAO används för detta protokoll.

1. Före applicering av vasoaktiva ämnen, bör en baslinje video spelas in i minst 1 minut. För ET-1-inducerad MCAO, är baslinjen inspelningen gjorts när nålen har sänkts i hjärnparenkymet men före ET-1 injektion.
2. Sprutpumpen startas för injektion och registreras för 1 timme eller tills önskad slutpunkt. Nålen lämnas på plats under videoinspelning för att förhindra störningar av fokalplanet.
3. Råttan bör vara djupt sövd och avlivas enligt godkänd protokoll efter denna procedur.

5. Bildanalys

Kärldiameter kan bestämmas för någon del av visualiseras MCA. Som exempel kommer vi att använda en del av MCA för att mäta kärlets diameter vid tidpunkter före och efter ET-1 injektion. Still bildrutor från video fångas med 1 min intervaller med VLC media player (VideoLAN).

1. VLC spelaren är installerad och öppnas.
2. Genom att välja verktyg och sedan inställningar är inställningen ändras till "Alla" under "Visa inställningar".
3. Den "videomenyn" expanderas till vänster baren och "utgångsmoduler" expanderas sedan. "Scene filter" väljs för att få upp scenen Videofilter meny.
4. "Scene" skrivs in i rutan för filnamnsprefix.
5. En katalog sökvägsprefix definieras. Det är där stillbilder sparas.
6. En inspelning förhållande väljs baserat på den önskade graden av stillbild infångning. Om ett videoklipp fångades på 29 bilder per sekund, och sedan "1749" (29 bilder / sek x 60 sek / min) bör föras in i rutan för att rädda en stillbild varje 1 minut. Alla ändringar sparas.
7. Önskad video öppnas därefter i VLC spelaren att automatiskt spara stillbilder gång 1 minut.
8. Kärldiameter mäts sedan använda dessabilder. Först ImageJ programvara (NIH) öppnas.
9. Då stillbilder som du kommer att mäta öppnas i ImageJ.
10. Genom att välja "analysera"-menyn, "sätta mätningar" öppnas därefter och alla lådor är okontrollerat.
11. Därefter är den räta linjen markerat.
12. Kortkommandot "Ctrl +" används för att zooma in efter behov och en linje placeras vinkelrätt mot kärlets väg att mäta kärlets diameter.
13. Slutligen fartygets längd erhålls genom att välja "analysera"-menyn och sedan "mått" (Ctrl + M) för att erhålla fartygets längd.
14. Denna process upprepas åtminstone tre gånger och medelvärdet för varje uppmätt fartyg mätt i varje stillbild.
15. Kärldiameter vid varje tidpunkt normaliserades till baslinjen kärlets diameter, så att jämförelser kan göras med hjälp av flera råttor. För att göra detta, använd formeln aktuell diameter / baslinjen diameter x 100% för att beräkna diametern% baslinjen för varje fartyg.

Representative Results

Stillbilder tagna från video som tagits visar att förändringen i cerebral artär diameter efter ET-1 injektion kan lätt inses att använda denna kraniell fönster teknik (figur 2). Inom några minuter av ET-1 injektion fartyget börjar sammandra. Så småningom fartygen kommer att vara svårt att visualisera och hjärnvävnaden blir blek. Efter ca 20 minuter effekterna av ET-1 kommer att minska och fartygen kommer att börja vidga, gradvis återvända till baslinjen diameter efter ca 45 min. Förutom de mer uppenbara vasokonstriktion som inträffar blir den kortikala ytan blekare efter ET-1 administrering. Det är möjligt att beräkna den absoluta förändringen i kärldiameter med en kalibrerad mikroskop riktmedel om så önskas. För jämförelse mellan flera råttor vi beräkna den relativa förändringen i kärldiameter som inträffar under en procedur. Dessa mätningar utfördes med användning av ImageJ mjukvara (NIH). Sedan en graf som representerar reltiva förändringar i kärldiameter över tiden kan sedan konstrueras (figur 3).

Figur 1. Diagram över placeringen av tidsmässiga kraniektomi. Detta diagram visar skelett anatomi av rått skalle med främre orienterad till vänster. Den temporalis muskeln har sitt ursprung längs den laterala skalle åsen. Denna muskel måste lösgöras från denna ås och genomskärs i syfte att visualisera skvamös delen av tinningbenet. En ungefär 3-4 mm kraniektomi kan utföras vid denna plats bara posteriort om bana och överlägsen bas zygomaticus process eftersom det reflekteras på tinningbenet. Den stora pilen indikerade platsen att utföra kraniektomi. De 3 små pilarna visar MCA och dess filialer. Alla artäreri detta läge kommer att vara grenar av MCA och artärer kan särskiljas från vener från såväl deras icke-slingrande utseende och känslighet för vasoaktiva föreningar.

Figur 2. Kranial fönstret innan ET-1 injektion efter ET-1 injektion och efter reperfusion. Börjar på vänster, är en representativ bild av MCA grenar sett genom ett kranial fönster visas. Artärer kan identifieras genom sin morfologi. Den relativt raka MCA in i fältet längst ner till vänster och har en stor gren punkt i bilden. Andra fartyg i dessa bilder är cerebrala vener som kan identifieras genom sin djupare ton och slingrande utseende. Under ocklusion artärer kommer snabbt ihop och vävnaden blir blek. Sakta kommer artären vidgas och återgå till utgångsläget diameter.

Figur 3. Representant kärldiameter över tiden för en enda råtta. Procent baslinje diameter kan beräknas över tiden med enkel formel, aktuell diameter / baslinjen diameter x 100%. Detta kan göras med någon vasoaktiv förening.

Discussion

Sammanfattningsvis är detta kraniala fönster framställningsteknik är mycket mångsidig, eftersom det kan ändras för att möta behoven hos många experiment med mindre modifieringar ^{4, 5.} Till exempel har vi övervakas framgångsrikt cerebralt blodflöde i specifika MCA grenar med laser Doppler flowmetry att fokusera direkt på en cerebral artär visualiseras genom ett kraniell fönster (Mecka AP 2009 och 2011). Dessutom, kan en liknande beredning med dura snittade användas med topisk administrering av vasoaktiva föreningar för att skapa en in vivo vaskulär reaktivitet bad ^3. Flera faktorer bör tas i beaktande vid framställning av en kranial fönster för att minska felfrekvensen för denna teknik. Många av dessa faktorer är relaterade till att få god visualisering av hjärnans kärl. Först måste man vara försiktig när du skapar kraniektomi så att dura eller blodkärlen överliggande inte störs med borrkronan. Detta uppnås bästav täta tvättningar med steril koksaltlösning för att rensa skräp och kyla skallen. Andra bör benfragmentet lyftas försiktigt när den avlägsnas. Om fragmentet inte dra bort lätt, då borrkronan bör användas för att skära bort mer ben. Slutligen, kan små mängder blod eller CSF ändra lätt utseendet av den kraniala fönstret under denna procedur. I kraniektomi utförs ger en öppning i skallen som är större än vad som krävs för visualisering. Därför är det enkelt att placera flera absorberande svamp i den beroende delen av den kirurgiska platsen för att hindra fluid från att ansamlas. Dessa svampar kan bytas ut vid behov om omsorg används inte hindra fönstret med kirurgiska verktyg.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inhalation anesthesia system	VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA	901806
Isoflurane anesthetic	Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA	1001936060
Small animal stereotaxic system	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	900
Non-rupture ear bars, rat	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	957
Rat gas anesthesia head holder	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	1929
BAT-12 microprobe thermometer	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	BAT-12
T/PUMP, Thermal blanket	Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA	T/PUMP, TP600
Metzenbaum Scissors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	501254
Iris forceps	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	15915
Bulldog clamp retractors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	14119-G
10 μl syringe 26-gaugue	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	SGE010RNS
Bovie, high temperature cautery kit	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	500392
Rat tooth forceps 0.12	Stotz	E1811
Micromotor drill	Stoelting, Wood Dale, IL, USA	51449
0.8 mm round drill bur	Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA	RS-6280C-1
STORZ Bonn suturing forceps	Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA
Nylon Suture, size 3.0	Oasis, Mettawa, IL, USA	MV-663
Cotton swabs	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	22-029-488
Puralube eye ointment	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	NC0138063
Electric hair clippers	Oster, Providence, RI, USA	78005-301
ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS	American Peptide, Sunnyvale, CA, USA	88-1-10A
Chlorhexidine, 2%	Agrilabs, St. Joseph, MO, USA	1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322
Surgical microscope	Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA	Evolution xR6
Sony Handycam	Sony, Minato, Tokyo, Japan	HDR-SR12
Fiber optic illuminator	TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA	FO1–150
VLC media Player	(Paris, France)
Image J software	U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA