Anvendelse af en Cranial vindue for at visualisere den midterste cerebrale arterie Under endothelin-1-induceret mellem-cerebral arterieokklusion

Summary

I denne artikel beskrives en metode til at visualisere rotte-cerebrale arterier gennem en kranial vindue ved hjælp tidsmæssige kraniektomi for at se proximale dele af den midterste cerebrale arterie (

Abstract

Oprettelse af en kraniel vindue er en fremgangsmåde, der giver mulighed for direkte visualisering af strukturer på den kortikale overflade af hjernen ^1-3. Denne teknik kan udføres på mange steder ligger over rotte-cerebrum, men lettest udføres ved at skabe en kraniektomi i de let tilgængelige frontale og parietale knogler. Oftest har vi anvendt denne teknik i kombination med endothelin-1 mellem-cerebral arterieokklusion model af iskæmisk slagtilfælde at måle ændringer af arteria cerebri media kardiameter, der opstår med injektion af endothelin-1 i hjerneparenkymet støder op til den proksimale MCA ^{4, 5.} For at visualisere den proximale del af MCA under endothelin -1 induceret MCAO, bruger vi en teknik til at skabe en kraniel vindue gennem tindingebenet på den laterale del af rotte kraniet (figur 1). Cerebrale arterier kan visualiseres enten med dura intakte eller med dura indsnit og retraCTED. Mest almindeligt, forlader vi dura intakt under visualisering siden endothelin-1-induceret MCAO indebærer levering af karsammentrækkende peptid ind i hjernen parenkym. Dette omgår behovet for at incise dura mater direkte over de visualiserede skibe til lægemiddelafgivelse. Denne protokol vil beskrive, hvordan du opretter en kraniel vindue til at visualisere cerebrale arterier i en trinvis måde, samt hvordan man kan undgå mange af de potentielle faldgruber vedrørende denne metode.

Protocol

Denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care og Use Committee (IACUC) ved University of Florida og er i overensstemmelse med "Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr" (ottende udgave, National Academy of Sciences, 2011).

Materialer

1. Dyr: Otte uger gamle, Sprague Dawley hanrotter (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA), som vejede 250-300 g på tidspunktet for kirurgi.
2. Anæstesi
   1. Inhalationsanæstesi system (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
   2. Isofluran bedøvelsesmiddel (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
3. Stereotaktisk system (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
   1. Små dyr stereotaktisk-system
   2. Ikke-brud øre stænger for rotter
   3. Gas anæstesi hoved holder til rotter
4. Temperatur regulering
   1. BAT-12 mikrosonde termometer (WorldPrecision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
   2. T / PUMP, TP600 Termisk tæppe (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
5. Kirurgiske instrumenter
   1. Metzenbaum saks, iris pincet, bulldog clamp retraktorer, 10 pi sprøjte med 26 gauge skrå nål, Bovie cautery kit (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
   2. Mikromotorer boremaskine (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
   3. 0,8 mm round drill bur (Roboz Surgical Instrument Co, Inc., Gaithersburg, MD, USA)
   4. STORZ Bonn suturering Tang (Bausch og Lomb, Inc., Rochester, NY, USA)
6. Kirurgiske Supplies
   1. 3,0 nylonsutur (Oasis, Mettawa, IL, USA)
   2. Vatpinde, Puralube øjensalve (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
   3. Kirurgiske punkter og strimler (Medtronic Xomed, Inc., Jacksonville, FL, USA)
   4. Elektriske hårklippere (Oster, Providence, RI, USA)
   Kemikalier
   1. Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
   2. Chlorhexidin 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
7. Visualisering Udstyr
   1. Kirurgisk mikroskop (Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokyo, Japan)
   3. Fiber Optic illuminator (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA)
8. Måling af kardiameter
   1. VLC media player (Paris, Frankrig)
   2. Billede J software (ImageJ 1.42q software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

1. Prækirurgiske Steps

1. Før kirurgi blev rotterne anbragt under en 12:12 lys / mørke-cyklus med fri adgang til vand og gnaverfoder.
2. Anæstesi induceres med 4% isofluran i _100% O2 gasblanding i et induktionskammer.
3. Kragen n af hovedet er barberet med elektriske hårklippere.
4. Rotten anbringes i liggende stilling på en absorberende pude liggende på en temperaturstyret drift overflade (termisk tæppe) og hovedet anbringes i det stereotaktiske apparat startende med anbringelse af gassen anæstetiske ansigtsmaske.
5. Dernæst øre stænger indsat og strammet.
6. Under proceduren anæstesi opretholdes med 2% isofluran i _100% O2 gasblanding.
7. Ophthalmisk smøremiddel salve påføres på begge øjne, og øjenlågene er lukket for at forhindre udtørring øjet under det kirurgiske indgreb.
8. Rektal Temperatursonden indsættes at opretholde en konstant dyre-kernetemperatur på 37 ± 0,5 ° C.
9. Med lederen af ​​den bedøvede rotte holdt fast i stereotaksiske enhed det kirurgiske område er renset med skiftevis chlorhexidin og saltvand tre gange.

2. Pre-kraniale Window Preparation

NDHOLDET "> Før skabe en kraniel vindue, bør rotten være forberedt på alle eksperimenter ved implantering af andre nødvendige hardware og bør modtage eventuelle nødvendige kirurgiske procedurer. Til denne protokol, har vi tidligere implanteret en guide kanyle for endothelin-1 (ET- 1) induceret MCAO som vist i en ledsagende publikation med titlen "endothelin-1-induceret mellem-cerebral arterieokklusion Model for iskæmisk slagtilfælde med laser-doppler-flowmetri Vejledning i Rat".

3. Oprettelse af Cranial Window

Efter anbringelse af en guide kanyle eller udstyr til forsøg, er et kraniel vindue skabt til direkte at visualisere proximale dele af den midterste cerebrale arterie under et slag procedure.

1. Første er sakse anvendes til at incise huden ligger over temporalis musklen begynder medialt og arbejder lateralt.
2. Temporalis musklen er bisected anvendelse elektrokirurgi og derefter trukket tilbage under anvendelse af 3,0 nylonsutur til visua lize den skællede del af tindingebenet.
3. En tilnærmelsesvis 3-4 mm square tegnes på skællede del af tindingebenet caudalt til kredsløb og overlegen i forhold til bunden af ​​zygomatic processen, da det reflekteres af tindingebenet.
4. Et bor anvendes til gradvist at skære den skitserede stykke knogle fri tindingebenet. Der bør udvises omhu for at undgå at anvende for meget tryk til boret, da det er muligt at beskadige dura eller hjernebarken.
5. Hyppige skylninger med sterilt saltvand udføres for at forbedre visualisering af det kirurgiske område og forhindre overophedning af kraniet.
6. Starter ved en løs hjørne, er det stykke temoporal knogle omhyggeligt fjernes med fin rotte-tandede tang samtidig sikre på ikke at rive nogen skibe i forbindelse med dura.
7. Den dura efterlades intakt og snavs skylles væk med sterilt saltvand.

4. Registrering af cerebral arterie Konstriktion

telt "> For at vise, hvordan man tage billeder i realtid, en rotte, der er under ET-1-induceret MCAO bruges til denne protokol.

1. Forud for anvendelse af vasoaktive stoffer, bør en baseline video optages i mindst 1 min. For ET-1-induceret MCAO er baseline optagelse foretages, når nålen er blevet sænket ned i hjerneparenkymet men før ET-1 injektion.
2. Sprøjtepumpen startes til injektion og registreres i 1 time eller indtil det ønskede slutpunkt. Nålen bliver siddende under videooptagelse for at undgå forstyrrelser af brændplanet.
3. Rotten skal være dybt bedøvet og aflivet i henhold til en godkendt protokol efter denne procedure.

5. Billedanalyse

Kardiameter kan bestemmes til enhver del af visualiseret MCA. Som et eksempel vil vi anvende en gren af ​​MCA for at måle kardiameteren på tidspunkter med før og efter ET-1 injektion. Still frames fra videoen er optaget med 1 min intervaller ved hjælp af VLC media player (VideoLAN).

1. VLC afspiller er installeret og åbnet.
2. Ved at vælge værktøjer og derefter præferencer, er indstillingen ændres til "All" under "Vis indstillinger".
3. Den "video-menu" er udvidet i venstre side bar og "output-moduler" er derefter udvidet. "Scene filtre" er valgt for at hente scene videofilter menu.
4. "Scene" er skrevet ind i feltet for filnavn præfiks.
5. En mappe sti præfiks er defineret. Det er her stillbilleder gemmes.
6. En optagelse forholdet er udvalgt på grundlag af den ønskede hastighed af stadig frame capture. Hvis en video blev optaget med 29 frames per sekund, derefter "1749" (29 billeder / sek x 60 sek / min) skal indtastes i boksen at redde et stillbillede hver 1 min. Alle ændringer gemmes derefter.
7. Den ønskede video bliver så åbnet i VLC afspiller til automatisk at gemme stillbilleder gang hver 1 min.
8. Kardiameter måles derefter ved hjælp af dissebilleder. For det første er ImageJ software (NIH) åbnes.
9. Så stillbilleder, du vil måle åbnes i ImageJ.
10. Ved at vælge "analysere" menu, "sæt målinger" åbnes derefter, og alle bokse er markeret.
11. Dernæst lige linje værktøjet valgt.
12. Tastaturgenvejen "Ctrl +" anvendes til at zoome ind efter behov, og en linie er placeret vinkelret på karbane til måling af kardiameter.
13. Endelig er fartøjslængde opnås ved at vælge "analysere" menuen og derefter "foranstaltning" (ctrl + M) for at få fartøjets længde.
14. Denne proces gentages mindst tre gange og gennemsnit for hvert målt fartøj målt i hver stillestående billede.
15. Kardiameter på hvert tidspunkt normaliseres til den hidtidige beholderen diameter, således at sammenligninger kan foretages ved hjælp af flere rotter. For at gøre dette, skal du bruge formlen aktuelle diameter / baseline diameter x 100% til at beregne% baseline diameter for hvert fartøj.

Representative Results

Stillbilleder taget fra optagne video viser, at ændringen i cerebrale arterie diameter efter ET-1 injektion kan let forstås ved hjælp af den kraniale vindue teknik (fig. 2). Inden for få minutter af ET-1 injektion, vil fartøjet begynde at snøre. Til sidst skibene vil være vanskeligt at visualisere og hjernevæv bliver bleg. Efter ca 20 min virkningerne af ET-1 mindskes og skibene begynder at udvide sig, gradvist vendte tilbage til udgangsværdien diameter efter omkring 45 min. Ud over de mere indlysende vasokonstriktion, der opstår, bliver den kortikale overflade blegere efter ET-1 administration. Det er muligt at beregne den absolutte ændring i kardiameter med et kalibreret mikroskop trådkors om ønsket. Til sammenligning mellem flere rotter vi beregne den relative ændring i kardiameter, som forekommer under en procedure. Disse målinger udføres under anvendelse ImageJ software (NIH). Derefter en graf, som repræsenterer reltive ændringer i kardiameter over tid kan derefter konstrueret (fig. 3).

Figur 1. Diagram over placeringen af tidsmæssige kraniektomi. Dette diagram viser skelet anatomi af rotte kraniet med anterior orienteret til venstre. Den temporalis musklen har sin oprindelse langs den laterale kraniet højderyg. Denne muskel skal afmonteres fra denne ryg og gennemskæres for at visualisere den skællede del af tindingebenet. En tilnærmelsesvis 3-4 mm kraniektomi kan udføres på dette sted lige posteriort for kredsløb og overlegen i forhold til bunden af ​​zygomatic processen, da det reflekteres af tindingebenet. Den store pil angivne placering at udføre kraniektomi. De 3 små pile angiver MCA og dets filialer. Alle arterieri denne placering vil være grene af MCA og arterier kan skelnes fra vener ved både deres ikke snoet udseende og følsomhed over for vasoaktive forbindelser.

Figur 2. Kraniale vindue før ET-1 injektion, efter ET-1 injektion, og efter reperfusion. Fra venstre, er et repræsentativt billede af MCA grene som set gennem en kranial vinduet vist. Arterier kan identificeres ved deres morfologi. Den relativt lige MCA kommer ind i feltet nederst til venstre, og har en stor gren punkt i billedet. Andre fartøjer i disse billeder er cerebrale vener, som kan identificeres ved deres dybere tone og indviklede udseende. Under okklusion arterier vil hurtigt snøre og vævet bliver bleg. Langsomt, vil arterien spile og vende tilbage til basislinjen diameter.

Figur 3. Repræsentative kardiameter over tid for en enkelt rotte. Procent baseline diameter kan beregnes over tid ved hjælp af enkel formel aktuelle diameter / baseline diameter x 100%. Dette kan gøres med enhver vasoaktivt forbindelse.

Discussion

Sammenfattende er det kraniel vindue fremstillingsteknik meget fleksibel, som den kan ændres til at imødekomme behovene hos mange eksperimenter med mindre modifikationer ^{4, 5.} For eksempel har vi med succes overvåget cerebral blodgennemstrømning i bestemte MCA brancher bruger laser-doppler flowmetri at fokusere direkte på en cerebral arterie visualiseres gennem et kranie vindue (Mekka AP 2009 og 2011). Endvidere kan et lignende præparat med dura indsnit anvendes med topisk administration af vasoaktive forbindelser for at skabe en in vivo vaskulær reaktivitet bath ^3. Adskillige faktorer skal tages i betragtning ved fremstilling af en kranial vindue for at reducere fejlrate for denne teknik. Mange af disse faktorer er relateret til opnåelse af en god visualisering af cerebrale arterier. Først skal man passe på, når du opretter kraniektomi så dura eller blodkar overliggende det ikke forstyrres med borehovedet. Dette opnås bedstved hyppige vask med sterilt saltvand for at fjerne snavs og afkøle kraniet. For det andet bør knoglefragment løftes forsigtigt, når det fjernes. Hvis fragmentet ikke trække væk let, så at borekronen skal anvendes til at skære mere knogle. Endelig kan små mængder af blod eller CSF let ændre udseendet af den kraniale vinduet under denne procedure. Den udførte kraniektomi tilvejebringer en åbning i kraniet som er større end nødvendigt for visualisering. Derfor er det let at placere flere absorberende svampe i den afhængige del af det kirurgiske sted for at forhindre fluid i at akkumuleres. Disse svampe kan ændres efter behov, hvis pleje er ikke plejede at blokere vinduet med kirurgiske redskaber.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inhalation anesthesia system	VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA	901806
Isoflurane anesthetic	Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA	1001936060
Small animal stereotaxic system	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	900
Non-rupture ear bars, rat	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	957
Rat gas anesthesia head holder	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	1929
BAT-12 microprobe thermometer	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	BAT-12
T/PUMP, Thermal blanket	Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA	T/PUMP, TP600
Metzenbaum Scissors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	501254
Iris forceps	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	15915
Bulldog clamp retractors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	14119-G
10 μl syringe 26-gaugue	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	SGE010RNS
Bovie, high temperature cautery kit	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	500392
Rat tooth forceps 0.12	Stotz	E1811
Micromotor drill	Stoelting, Wood Dale, IL, USA	51449
0.8 mm round drill bur	Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA	RS-6280C-1
STORZ Bonn suturing forceps	Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA
Nylon Suture, size 3.0	Oasis, Mettawa, IL, USA	MV-663
Cotton swabs	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	22-029-488
Puralube eye ointment	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	NC0138063
Electric hair clippers	Oster, Providence, RI, USA	78005-301
ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS	American Peptide, Sunnyvale, CA, USA	88-1-10A
Chlorhexidine, 2%	Agrilabs, St. Joseph, MO, USA	1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322
Surgical microscope	Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA	Evolution xR6
Sony Handycam	Sony, Minato, Tokyo, Japan	HDR-SR12
Fiber optic illuminator	TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA	FO1–150
VLC media Player	(Paris, France)
Image J software	U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA