ניצול חלון גולגולת לדמיין עורק המוח האמצעי במהלך ספיג אנדותלין-1 מושרה מזרח מוחות עורקים

Summary

מאמר זה מתאר שיטה להמחשת עורקי חולדות מוחיים דרך חלון גולגולתי באמצעות craniectomy הזמני כדי להציג חלקים הפרוקסימלי של עורק המוח האמצעי (

Abstract

יצירת חלון גולגולתי היא שיטה המאפשרת הדמיה ישירה של מבנים על פני קליפת המוח של המוח ^1-3. טכניקה זו ניתן לבצע במקומות רבים המונחים על מוח החולדה, אבל מתבצעת בקלות על ידי יצירת craniectomy מעל העצמות הקדמיות או הקודקודית הנגישות בקלות. בתדירות הגבוהה ביותר, יש לנו להשתמש בטכניקה זו בשילוב עם מודל אנדותלין-1 עורק המוח האמצעי, החסימה של שבץ איסכמי לכמת את השינויים בקוטר כלי דם עורק מוח אמצעי, המתרחשים עם הזרקה של אנדותלין-1 לparenchyma המוח הסמוכים לMCA הפרוקסימלי ^{4, 5.} על מנת להמחיש את החלק הפרוקסימלי של MCA במהלך אנדותלין -1 המושרה MCAO, אנו משתמשים בטכניקה כדי ליצור חלון גולגולתי דרך העצם הטמפורלית בצד הלטרלי של גולגולת החולדה (איור 1). עורקי מוח יכולים להיות חזותי או עם דורה שלמה או עם הדורה החרוטה וretracted. בדרך כלל, אנו משאירים את הדורה שלמה במהלך ההדמיה מאז אנדותלין-1 המושרה MCAO כרוך מסירה של פפטיד vasoconstricting לparenchyma המוח. זה עוקף את הצורך לחתוך דורה ישירות לעבר הספינות דמיינו למשלוח סמים. פרוטוקול זה יתאר כיצד ליצור חלון גולגולתי לדמיין עורקים מוחיים באופנת צעד חכמה, כמו גם כיצד להימנע מרבות מהמלכודות הפוטנציאליות הנוגעות לשיטה זו.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי בעלי החיים והטיפול המוסדי ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת פלורידה ועומד ב" מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה "(8 מהדורה, האקדמיה הלאומית למדעים, 2011).

חומרים

1. בעלי חיים:, זכר, ספראג Dawley חולדות שמונה בן שבועות (River חוות צ'ארלס, Wilmington, מסצ'וסטס, ארה"ב) שוקלים 250-300 ג'בעת הניתוח.
2. הרדמה
   1. מערכת הרדמת משאיפת (VetEquip Inc, Pleasanton, קליפורניה, ארה"ב)
   2. הרדמת isoflurane (רוקחות בקסטר, Deerfield, IL, ארצות הברית)
3. Stereotaxic המערכת (דוד קופף מכשירים, Tujunga, קליפורניה, ארה"ב)
   1. מערכת stereotaxic חיה קטנה
   2. ברים ללא קרע אוזן לחולדות
   3. בעל ראש הרדמת גז לחולדות
4. ויסות טמפרטורה
   1. 12-BAT מדחום microprobe (העולםPrecision מכשירים, Inc, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב)
   2. T / משאבה, TP600 שמיכת תרמית (Gaymar תעשיות, Inc, אורצ'רד הפרק, ניו יורק, ארה"ב)
5. מכשירי ניתוח
   1. מספרי צנבאום, איריס מלקחיים, מפשק מהדק בולדוג, 10 מזרק עם מחט μl 26 מד קטומה, Bovie כוויית ערכה (עולם Precision מכשירים, Inc, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב)
   2. Micromotor תרגיל (Stoelting, עץ דייל, אילינוי, ארה"ב)
   3. 0.8 מ"מ סיבוב מקדחת הספחת (Roboz כירורגי Instrument ושות, Inc, גייתרסבורג, מרילנד, ארה"ב)
   4. Storz בון תפירת מלקחיים (באוש וLomb, Inc, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב)
6. ציוד כירורגי
   1. 3.0 ניילון תפר (אואזיס, Mettawa, אילינוי, ארה"ב)
   2. ספוגיות כותנה, משחת העין Puralube (הפישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב)
   3. נקודות ורצועות כירורגיות (מדטרוניק Xomed, Inc, ג'קסונוויל, פלורידה, ארה"ב)
   4. קוצץ שיער חשמלי (אוסטר, פרובידנס, רוד איילנד, ארה"ב)
   כימיקלים
   1. אנדותלין-1 (האמריקאי פפטיד, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב)
   2. כלורהקסידין 2% (Agrilabs, סנט ג'וזף, מיזורי, ארה"ב)
7. ציוד הדמיה
   1. מיקרוסקופ הניתוחי (כלי סיילר וייצור; סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (סוני, מינאטו, טוקיו, יפן)
   3. פנס סיבים אופטי (TechniQuip קורפ, ליברמור, קליפורניה, ארה"ב)
8. מדידת קוטר כלי
   1. VLC Media Player (פריז, צרפת)
   2. תמונת J תוכנה (ImageJ 1.42q תוכנה, מכוני בריאות הלאומי של ארה"ב, Bethesda, מסצ'וסטס, ארה"ב)

1. צעדים טרום ניתוחיים

1. לפני הניתוח, החולדות הם שוכנו במחזור 12:12 אור / חושך עם גישה חופשיה למים והמכרסם צ'או.
2. הרדמה מושרה עם 4% isoflurane ב% תערובת 100 O ₂ גז בתא אינדוקציה.
3. העורב n של ראשו מגולח עם קוצץ שיער חשמלי.
4. העכברוש שם בתנוחת שכיבה על משטח סופג שוכב על משטח טמפרטורה מבוקרת הפעלה (שמיכת תרמית) והראש ממוקם במנגנון stereotactic מתחיל עם מיקום של מסיכת הרדמת הגז.
5. בשלב בא, בארי האוזן מוכנסים והתהדקו.
6. במהלך הרדמת ההליך נשמר עם 2% isoflurane ב% תערובת גז 100 O _2.
7. משחת הסיכה Opthalmic מוחלת על שתי העיניים והעפעפיים סגורים כדי למנוע התייבשות עין במהלך ההליך הכירורגי.
8. בדיקה רקטלית טמפרטורה מוכנסת לשמור על טמפרטורת ליבת חיה קבועה של 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס
9. עם הראש של החולדה המורדמת בחוזקה במכשיר stereotaxic אזור הניתוח מתנקה עם לסירוגין שלוש פעמי כלורהקסידין ומלוחות.

2. הכנה מראש חלון גולגולתי

ontent "> לפני יצירת חלון גולגולתי, העכברוש צריך להיות מוכן לכל ניסויים על ידי השתלה של חומרה הנדרשת אחרת וצריך לקבל את כל ניתוחים דרושים. לפרוטוקול זה, יש לנו מושתל צינורית מדריך בעבר לאנדותלין-1 (ET- 1) המושרה MCAO כפי שמוצג בפרסום לוויה תחת כותרת "מודל אנדותלין-1 מושרה מזרח מוחות עורקים ספיגים לשבץ איסכמי עם הדרכת Flowmetry ליזר דופלר בחולדה".

3. יצירת חלון הגולגולת

לאחר מיקום של צינורית או ציוד דרוש לשם ניסויי מדריך, חלון גולגולתי נוצר ישירות לדמיין חלקים הפרוקסימלי של עורק המוח האמצעי במהלך הליך שבץ.

1. ראשית, מספריים משמשים לחתוך עור שמעל שריר temporalis מתחיל מדיאלית ועבודה רוחבית.
2. שרירי temporalis הוא נחצה באמצעות electrocautery ולאחר מכן חזרו בו באמצעות תפר ניילון 3.0 ל visua ליזה חלק הקשקש של העצם הטמפורלית.
3. כיכר מ"מ כ 3-4 נמשכת על חלק הקשקש של עצם הזנב למסלול וינעל על הבסיס של תהליך הזיגומטית הזמני שכן הוא משקף הנחה של העצם הטמפורלית.
4. קידוח משמש לחתוך חתיכה התוותה של עצם בהדרגה חופשיה מהעצם הטמפורלית. יש להקפיד להימנע מיישום יותר מדי לחץ לתרגיל שכן הוא עלול להינזק הדורה או קליפת מוח.
5. שטיפות תכופות עם תמיסת מלח סטרילית מבוצעות כדי לשפר את ההדמיה של שדה הניתוח ולמנוע התחממות יתר של הגולגולת.
6. החל בפינה רופפת, חתיכת עצם temoporal מוסרת בזהירות בעזרת מלקחיים עדינים עכברוש שיניים תוך הקפדה שלא לקרוע שום כולים קשורים בדורה.
7. הדורה נותרה בשלמותו והפסולת שטפה באמצעות סליין סטרילי.

4. הקלטה של ​​התכווצות עורק המוח

> אוהל "כדי להדגים כיצד ללכוד תמונות בזמן אמת, עכברוש שעובר ET-1 המושרה MCAO משמש עבור פרוטוקול זה.

1. לפני היישום של תרכובות vasoactive, וידאו בסיסי צריך להיות מוקלט לדקות לפחות 1. לET-1 המושרה MCAO, ההקלטה הבסיסית נעשית פעם אחת המחט הופחתה לparenchyma המוח אבל לפני הזרקת ET-1.
2. משאבת המזרק הוא התחיל להזרקה ונרשמה ל1 שעה או עד לנקודת הסיום הרצוי. המחט נשארה במקומו בזמן הקלטת וידאו על מנת למנוע הפרעות במישור המוקד.
3. החולדה צריכה להיות עמוק מורדמת ולהרדים פי פרוטוקול שאושר בעקבות הליך זה.

5. ניתוח תמונה

קוטר כלי ניתן לקבוע לכל חלק של MCA דמיין. כדוגמה, אנו נשתמש בסניף אחד של MCA למדוד קוטר כלי בזמן נקודות לפני ולאחר הזרקת ET-1. Stiמסגרות ll מהווידאו שנתפסו במרווחי 1 דקות באמצעות VLC Media Player (VideoLAN).

1. VLC הנגן מותקן ונפתח.
2. על ידי בחירת כלים ואז העדפות, ההגדרה משתנית "כל" תחת "הגדרות צג".
3. "תפריט הווידאו" מתרחב בסרגל השמאלי ו" מודולים פלט "הוא לאחר מכן הרחיב. "מסנני Scene" נבחרו כדי להעלות את תפריט מסנן וידאו הסצנה.
4. "סצנות" שהוקלדה לתוך התיבה לקידומת שם קובץ.
5. קידומת נתיב ספרייה מוגדרת. זה המקום בו עדיין נשמרות מסגרות.
6. יחס הקלטה נבחר בהתבסס על השיעור הרצוי של מסגרת ללכוד עדיין. אם וידאו נכבש ב 29 מסגרות לשנייה, ואז "1749" (29 פריימים / שני x 60 שניות / דקות) יש להזין בתיבה כדי להציל אחד עדיין למסגר כל 1 דקות. כל השינויים ואז נשמרים.
7. אז וידאו הרצוי נפתח בנגן VLC כדי לשמור באופן אוטומטי עדיין מסגרות פעם בדקות 1.
8. אז קוטר כלי נמדד באמצעות אלהתמונות. ראשית, ImageJ תוכנה (NIH) נפתחה.
9. אז עדיין מסגרות שתמדדו נפתחות בImageJ.
10. על ידי בחירה בתפריט "לנתח", "להגדיר מדידות" ואז הוא נפתח וכל התיבות אינן מבוקרות.
11. בשלב הבא, כלי הקו הישר מסומן.
12. קיצור המקשים "Ctrl +" משמש כדי להגדיל בהתאם לצורך וקו ממוקם בניצב לשביל הכלי למדידת קוטר כלי.
13. לבסוף, אורך כלי מתקבל על ידי בחירה בתפריט "לנתח" ולאחר מכן "מדד" (Ctrl + M) כדי להשיג אורך כלי.
14. תהליך זה חוזר על עצמו לפחות שלוש פעמים בממוצע עבור כל כלי נמדד נמדד בכל מסגרת עדיין.
15. קוטר כלי בכל נקודת זמן מנורמל לקוטר הכלי הבסיסי כל כך שניתן לעשות שימוש בחולדות השוואות מרובות. כדי לעשות זאת, השתמש בקוטר הקוטר / בסיס הנוסחא הנוכחי x 100% כדי לחשב את קוטר בסיס% מכל כלי.

Representative Results

עדיין תמונות שנלקחו מתכנית הווידאו שנתפס כי השינוי בקוטר עורק מוח לאחר הזרקת ET-1 יכולה להיות מוערכת בקלות באמצעות טכניקה זו גולגולת חלון (איור 2). בתוך דקות של הזרקת ET-1, הכולים יתחילו להתכווץ. סופו של דבר את הכולים קשים יהיו לדמיין ורקמת המוח תהפוך חיוורת. לאחר כ 20 דקות את ההשפעות של ET-1 תקטנה והכולים יתחילו להתרחב, חוזרים בהדרגה לקוטר בסיס לאחר כ 45 דקות. בנוסף לvasoconstriction הברור יותר שמתרחש, את פני השטח של קליפת המוח הופכים חיוורים יותר לאחר מתן ET-1. ניתן לחשב את השינוי המוחלט בקוטר כלי עם reticle מיקרוסקופ מכויל אם רוצה. לשם השוואה בין חולדות רבות אנו לחשב את השינוי היחסי בקוטר כלי שמתרחש במהלך הליך. מדידות אלה מבוצעות באמצעות ImageJ תוכנה (NIH). אז גרף המייצג את relשינויים בקוטר הכולים ative לאורך זמן אז יכולים להיות בנויים (איור 3).

איור 1. תרשים של מיקום craniectomy הזמני. תרשים זה מתאר את האנטומיה השלד של גולגולת החולדה עם אורינטציה קדמית בצד השמאל. שרירי temporalis מקורו לאורך רכס גולגולת לרוחב. שריר זה חייב להיות מנותק מהרכס הזה ונחצה כדי להמחיש חלק הקשקש של העצם הטמפורלית. Craniectomy מ"מ כ 3-4 יכול להתבצע במיקום רק האחורי למסלול וינעל על הבסיס של תהליך הזיגומטית הזה כפי שהוא משתקף מהעצם הטמפורלית. החץ הגדול הצביע על מיקום לביצוע craniectomy. את 3 החיצים הקטנים מצביעים MCA וענפיו. כל העורקים במיקום זה יהיה ענפי MCA והעורקים ניתן להבחין בין ורידים בהופעה החיצונית והן הרגישות לתרכובות vasoactive שאינה המפותלת שלהם.

איור 2. חלון גולגולתי לפני הזרקת ET-1, לאחר הזרקת ET-1, ולאחר reperfusion. החל בשמאל, תמונה מייצגת של ענפי MCA כפי שנצפה דרך חלון גולגולתי מוצג. עורקים יכולים להיות מזוהים על ידי המורפולוגיה שלהם. MCA יחסית הישר נכנס לתחום בפינה השמאלית התחתונה ויש נקודת סניף אחד מרכזית בתמונה זו. כולים אחרים בתמונות האלה הם ורידים מוחיים הניתן לזיהוי על ידי הקול העמוק וחזותם מפותלת. במהלך חסימת עורקים יהיה במהירות מתכווץ והרקמות תהפוכנה חיוורות. לאט לאט, העורק יתרחב ולחזור לקוטר בסיס.

עמודים דקים = ​​"תמיד">
איור 3. קוטר כלי נציג לאורך זמן לקוטר בסיס יחיד חולדה. אחוזים ניתן לחשב לאורך זמן תוך שימוש בנוסחה הפשוטה, קוטר קוטר / תחילת מחקר הנוכחי x 100%. ניתן לעשות זאת עם כל תרכובת vasoactive.

Discussion

לסיכום, חלון טכניקת הכנת גולגולת זו היא מגוונת מאוד כפי שניתן לשנות כדי לענות על הצרכים של ניסויים רבים עם שינויים קלים ^{4, 5.} לדוגמה, יש לנו מעקב זרימת דם במוח בהצלחה בענפים ספציפיים MCA באמצעות flowmetry דופלר הליזר להתמקד ישירות בעורק מוח דמיין דרך חלון גולגולתי (מכת AP 2009 ו 2011). בנוסף, הכנה דומה עם הדורה החרוטה ניתן להשתמש עם ממשל מקומי של תרכובות vasoactive ליצור באמבטית תגובתיות כלי דם vivo ^3. כמה גורמים צריכים להילקח בחשבון בעת ​​הכנת חלון גולגולתי כדי להקטין את שיעור הכישלון של טכניקה זו. רבים מהגורמים הללו קשורים לקבלת הדמיה טובה של עורקי מוח. ראשית, יש להקפיד בעת יצירת craniectomy כך שכלי דם או הדורה המונחים זה לא שבש עם המקדח. המטרה זו מושגת טובה ביותרעל ידי שטיפות תכופות עם תמיסת מלח סטרילית לפינוי הריסות ולקרר את הגולגולת. שנית, בר העצם יש להסיר בעדינות כאשר הוא הוסר. אם הבר לא להתרחק בקלות, ואז המקדח יש להשתמש כדי לחתוך יותר עצם. לבסוף, כמויות קטנות של דם או CSF יכולות בקלות לשנות את המראה של החלון גולגולתי במהלך הליך זה. Craniectomy בוצע מספק פתח בגולגולת, שהוא גדול יותר מנדרש להדמיה. לכן, קל למקום כמה ספוגים סופגים בחלק התלוי של האתר כירורגית כדי למנוע מצבירת נוזלים. ספוגים אלו ניתנות לשינוי בהתאם לצורך, אם טיפול נעשה שימוש שלא הסתיר את החלון עם כלים כירורגיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inhalation anesthesia system	VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA	901806
Isoflurane anesthetic	Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA	1001936060
Small animal stereotaxic system	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	900
Non-rupture ear bars, rat	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	957
Rat gas anesthesia head holder	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	1929
BAT-12 microprobe thermometer	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	BAT-12
T/PUMP, Thermal blanket	Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA	T/PUMP, TP600
Metzenbaum Scissors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	501254
Iris forceps	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	15915
Bulldog clamp retractors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	14119-G
10 μl syringe 26-gaugue	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	SGE010RNS
Bovie, high temperature cautery kit	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	500392
Rat tooth forceps 0.12	Stotz	E1811
Micromotor drill	Stoelting, Wood Dale, IL, USA	51449
0.8 mm round drill bur	Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA	RS-6280C-1
STORZ Bonn suturing forceps	Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA
Nylon Suture, size 3.0	Oasis, Mettawa, IL, USA	MV-663
Cotton swabs	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	22-029-488
Puralube eye ointment	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	NC0138063
Electric hair clippers	Oster, Providence, RI, USA	78005-301
ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS	American Peptide, Sunnyvale, CA, USA	88-1-10A
Chlorhexidine, 2%	Agrilabs, St. Joseph, MO, USA	1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322
Surgical microscope	Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA	Evolution xR6
Sony Handycam	Sony, Minato, Tokyo, Japan	HDR-SR12
Fiber optic illuminator	TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA	FO1–150
VLC media Player	(Paris, France)
Image J software	U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA