Utilizando uma janela craniana para Visualizar a artéria cerebral média Durante endotelina 1 Induzida por oclusão da artéria cerebral média

Summary

Este artigo descreve um método para a visualização de artérias cerebrais de rato através de uma janela craniana via craniectomia temporal, a fim de visualizar partes proximais da artéria cerebral média (

Abstract

Criação de uma janela craniana é um método que permite a visualização directa das estruturas sobre a superfície cortical do cérebro ^1-3. Esta técnica pode ser realizada em diversos locais do cérebro de rato que se sobrepõem, mas é mais facilmente realizado através da criação de uma craniectomia sobre os ossos de fácil acesso frontal ou parietal. Mais frequentemente, temos usado esta técnica, em combinação com o modelo de oclusão endotelina-1 na artéria cerebral média de AVC isquémico para quantificar as alterações no diâmetro dos vasos da artéria cerebral média, que ocorrem com a injecção de endotelina-1 para o parênquima cerebral adjacente ao MCA proximal ^{4, 5.} A fim de visualizar a porção proximal da MCA, durante endotelina -1 induzida MCAO, usamos uma técnica para criar uma janela craniana no osso temporal na face lateral do crânio de rato (Figura 1). Artérias cerebrais pode ser visualizada quer com a dura intacta ou com a dura-máter e incisa RetraCTED. Mais comumente, deixamos a dura intacta durante a visualização desde a endotelina-1 induzida por MCAO envolve a entrega do péptido vasoconstritor para o parênquima cerebral. Isto evita a necessidade de incisão na dura directamente sobre os vasos visualizado para a entrega da droga. Este protocolo irá descrever como criar uma janela craniana para visualizar artérias cerebrais de uma forma faseada, bem como a forma de evitar muitas das armadilhas potenciais referentes a este método.

Protocol

Este protocolo foi aprovado pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) da Universidade da Flórida e está em conformidade com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" (oitava edição, a National Academy of Sciences, 2011).

Materiais

1. Animais: Oito semanas de idade, macho, Sprague Dawley (Farms Charles River, Wilmington, MA, EUA) pesando 250-300 g no momento da cirurgia.
2. Anestesia
   1. Sistema de anestesia por inalação (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, EUA)
   2. Anestésico isoflurano (Baxter Farmacêutica, em Deerfield, Illinois, EUA)
3. Estereotáxico sistema (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EUA)
   1. Sistema estereotáxico de pequenos animais
   2. Não-ruptura de ouvido barras para ratos
   3. Gás titular cabeça anestesia para ratos
4. Regulação da temperatura
   1. BAT-12 termômetro microssonda (WorldPrecision Instruments, Inc., Sarasota, Flórida, EUA)
   2. T / BOMBA, TP600 manta térmica (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, EUA)
5. Instrumentos cirúrgicos
   1. Metzenbaum tesoura, íris fórceps, afastadores braçadeira bulldog, seringa de 10 ul com agulha de calibre 26 chanfrado, Bovie cautério kit (Precision Mundial Instruments, Inc., Sarasota, Flórida, EUA)
   2. Micromotor broca (Stoelting, Wood Dale, IL, EUA)
   3. 0,8 milímetros rodada broca broca (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, EUA)
   4. STORZ Bonn Sutura Pinças (Bausch e Lomb, Inc., Rochester, NY, EUA)
6. Material cirúrgico
   1. 3,0 nylon sutura (Oasis, Mettawa, IL, EUA)
   2. Cotonetes, pomada Puralube (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA)
   3. Pontos cirúrgicos e tiras (Medtronic Xomed, Inc., Jacksonville, FL, EUA)
   4. Elétrica de cortar cabelo (Oster, Providence, RI, EUA)
   Produtos químicos
   1. A endotelina-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, EUA)
   2. Clorexidina 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, EUA)
7. Equipamento de visualização
   1. Microscópio cirúrgico (Seiler Instrumento e Manufatura; St. Louis, MO, EUA)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokyo, Japão)
   3. Iluminador de fibra óptica (TechniQuip Corp, Livermore, CA, EUA)
8. Medição do diâmetro do vaso
   1. VLC media player (Paris, França)
   2. Image J software (ImageJ 1.42q software, EUA National Institutes of Health, Bethesda, MA, EUA)

1. Pré-cirúrgicos Passos

1. Antes da cirurgia, os ratos são alojados sob um ciclo de luz / escuridão 12:12, com livre acesso à água e à ração de roedores.
2. A anestesia é induzida com 4% de isoflurano em 100% de mistura de gás _O2, em uma câmara de indução.
3. O corvo n da cabeça é raspada com cortar cabelo elétrica.
4. O rato é colocado numa posição de bruços sobre uma almofada absorvente encontra-se sobre uma superfície de funcionamento com temperatura controlada (manta térmica) e a cabeça é colocada no aparelho estereotáxico de partida com a colocação da máscara de gás anestésico.
5. Em seguida, as barras de orelha são inseridos e apertados.
6. Durante o procedimento de anestesia é mantida com isoflurano a 2% em 100% de mistura de gás de O _2.
7. Pomada lubrificante oftálmico é aplicada em ambos os olhos e as pálpebras são fechadas para evitar ressecamento dos olhos durante o procedimento cirúrgico.
8. Uma sonda de temperatura rectal é inserido para manter uma temperatura constante de animais núcleo de 37 ± 0,5 ° C.
9. Com a cabeça do rato anestesiado firmemente mantido no dispositivo estereotáxico da área cirúrgica é lavada com a alternância de clorexidina e solução salina três vezes.

2. Pré-craniana Preparação Janela

ONTEÚDO "> Antes de criar uma janela craniana, o rato deve estar preparado para todas as experiências de implantação de hardware necessário outro e deve receber quaisquer procedimentos necessários cirúrgicos. Para este protocolo, já implantada uma cânula guia para endotelina-1 (ET- 1) induzida OACM como mostra uma publicação companheiro intitulado "A endotelina-1 Induzida Médio modelo de oclusão da artéria cerebral para AVC isquêmico com Laser Orientação dopplerfluxometria em rato."

3. Criação da Janela craniana

Após a colocação de uma cânula guia ou equipamento necessário para a experimentação, uma janela craniana é criado para visualizar diretamente porções proximais da artéria cerebral média, durante um procedimento de acidente vascular cerebral.

1. Em primeiro lugar, são utilizadas tesouras a incisão da pele que cobre o músculo temporal e medialmente começando a trabalhar lateralmente.
2. O músculo temporal é cortada utilizando o eletrocautério, e depois recuou 3,0 utilizando fio de náilon ao vi lize a escama do osso temporal.
3. Um quadrado de aproximadamente 3-4 milímetros é desenhada na parte escamosa do osso temporal caudal para a órbita e superior para a base do processo zigomático uma vez que reflecte para fora do osso temporal.
4. Uma broca é utilizada para reduzir gradualmente o pedaço de osso esboçada livre a partir do osso temporal. Deve ser tomado cuidado para evitar a aplicação de pressão excessiva ao perfuração uma vez que é possível danificar a dura ou no córtex cerebral.
5. Lavagens freqüentes com solução salina estéril são realizadas para melhorar a visualização do campo cirúrgico e evitar o superaquecimento do crânio.
6. A partir de um canto solto, o pedaço de osso temoporal é cuidadosamente removido usando finas rato de dentes fórceps enquanto tomando cuidado para não rasgar os vasos associados com a dura.
7. A dura-máter é deixada intacta e detritos é lavado com solução salina estéril.

4. Gravação de constrição da artéria cerebral

> tenda "Para demonstrar como a captura de imagens em tempo real, um rato que está passando por ET-1 induzida OACM é usado para esse protocolo.

1. Antes da aplicação de compostos vasoactivos, uma linha de base de vídeo deve ser registada durante pelo menos 1 min. Para ET-1 induzida por MCAO, a gravação é feita referência, uma vez que a agulha tenha sido baixada para dentro do parênquima do cérebro, mas antes da injecção de ET-1.
2. A bomba de seringa é iniciado por injecção e registados durante 1 hora ou até que o ponto final desejado. A agulha é deixada no local durante a gravação de video, a fim de evitar perturbações no plano focal.
3. O rato deve ser profundamente anestesiados e sacrificados de acordo com um protocolo aprovado seguindo este procedimento.

5. Análise de Imagem

Diâmetro do vaso pode ser determinada para qualquer parte do MCA visualizado. Como exemplo, vamos usar um ramo da MCA para medir o diâmetro dos vasos em tempo-pontos antes e depois da injeção de ET-1. Still quadros do vídeo são capturados em intervalos de 1 min usando VLC media player (VideoLAN).

1. VLC player está instalado e aberto.
2. Ao selecionar ferramentas e, em seguida, as preferências, o cenário é alterado para "Todos" em "Mostrar configurações".
3. O menu "vídeo" é ampliado na barra do lado esquerdo e "Módulos de saída" é então expandido. "Filtros de Cena" é selecionado para abrir o menu de vídeo cena filtro.
4. "Scene" é digitado na caixa de prefixo do nome.
5. Um prefixo caminho do diretório está definido. Este é o lugar onde ainda quadros são salvos.
6. Um rácio de gravação é seleccionado com base na taxa desejada de captura de quadros. Se um vídeo foi capturado em 29 frames por segundo, em seguida, "1749" (29 frames / seg x 60 seg / min) deve ser inserido na caixa para salvar uma ainda enquadrar cada 1 min. Todas as mudanças são salvos.
7. O vídeo desejado é então aberto em player VLC para salvar automaticamente quadros ainda uma vez a cada 1 min.
8. Diâmetro do vaso é então medida utilizando estesimagens. Em primeiro lugar, o software ImageJ (NIH) é aberta.
9. Em seguida, os quadros ainda que você vai medir são abertos no ImageJ.
10. Ao selecionar a "analisar" menu ", definir medidas" é então aberto e todas as caixas estão desmarcadas.
11. Em seguida, a ferramenta de linha reta é selecionada.
12. O atalho "Ctrl +" é usado para fazer zoom conforme necessário e uma linha é colocado perpendicularmente ao caminho vaso para medir o diâmetro do vaso.
13. Finalmente, comprimento do vaso é obtida selecionando a "analisar" no menu e, em seguida, "medida" (ctrl + M) para obter comprimento do vaso.
14. Este processo é repetido pelo menos três vezes, e calculada a média para cada recipiente de medição medidos em cada fotograma.
15. Diâmetro do vaso em cada ponto de tempo é normalizado para o diâmetro do vaso de linha de base de modo a que possam ser feitas comparações múltiplas utilizando ratos. Para fazer isso, utilizar a fórmula diâmetro diâmetro / corrente de linha de base x 100% para calcular o diâmetro da linha de base% de cada vaso.

Representative Results

As imagens fixas tiradas do programa de vídeo captada que a mudança de diâmetro da artéria cerebral após a injecção de ET-1 pode ser facilmente observado utilizando esta técnica janela craniana (Figura 2). Poucos minutos após a injeção de ET-1, o navio começará a se contrair. Eventualmente, os vasos será difícil de visualizar o tecido cerebral e irá tornar-se clara. Após cerca de 20 min os efeitos de ET-1 irá diminuir e os vasos começará a dilatar gradualmente voltando ao diâmetro de linha de base, após cerca de 45 min. Além da vasoconstrição mais óbvio que ocorre, a superfície torna-se mais pálida cortical ET-1 após administração. É possível calcular a variação absoluta no diâmetro dos vasos com um retículo microscópio calibrado, se desejado. Para a comparação entre os ratos múltiplos nós calcular a variação relativa de diâmetro do vaso, que ocorre durante um procedimento. Estas medições são realizadas utilizando o software ImageJ (NIH). Em seguida, um gráfico que representa o relalterações operatória no diâmetro do vaso ao longo do tempo pode então ser construído (Figura 3).

Figura 1. Diagrama do local da craniectomia temporal. Este diagrama ilustra a anatomia do esqueleto do crânio de ratos com orientado anterior para a esquerda. O músculo temporal tem a sua origem ao longo da orla lateral do crânio. Este músculo pode ser separada desta cumeeira e dividido em dois de modo a visualizar a parte escamosa do osso temporal. Uma craniectomia mm aproximadamente 3-4 pode ser realizada neste local apenas posterior à órbita e superior para a base do processo zigomático uma vez que reflecte para fora do osso temporal. A seta grande indica a localização para efectuar a craniectomia. As três pequenas setas indicam a MCA e seus ramos. Todas as artériasneste local será ramos da MCA e as artérias podem ser distinguidas das veias por tanto a sua aparência não tortuoso e sensibilidade aos compostos vasoactivos.

Figura 2. Janela craniana antes da injecção de ET-1, ET-1 após a injecção, e após a reperfusão. Começando no lado esquerdo, uma imagem representativa de ramos MCA como visto através de uma janela craniana é mostrado. As artérias podem ser identificados pela sua morfologia. A MCA relativamente simples entra em campo no canto inferior esquerdo e tem um ponto de ramificação principal nesta imagem. Outras embarcações nestas imagens são veias cerebrais que podem ser identificadas pelo seu tom mais profundo e aparência tortuosa. Durante artérias oclusão rapidamente contraem eo tecido vai tornar-se pálida. Lentamente, a artéria se dilatar e retornar ao diâmetro basal.

Figura 3. Diâmetro representante navio ao longo do tempo para um diâmetro de linha de base única ratazana. Percent pode ser calculada ao longo do tempo utilizando a fórmula simples, diâmetro do diâmetro / corrente de linha de base x 100%. Isto pode ser feito com qualquer composto vasoactivo.

Discussion

Em resumo, esta técnica de preparação de janela craniana é muito versátil uma vez que podem ser alterados para satisfazer as necessidades das várias experiências com pequenas modificações, ^{4, 5.} Por exemplo, conseguimos monitorado o fluxo sanguíneo cerebral em ramos específicos MCA usando a dopplerfluxometria a laser para se concentrar diretamente em uma artéria cerebral visualizado através de uma janela de crânio (Meca AP 2009 e 2011). Além disso, uma preparação semelhante com a incisão dura pode ser utilizada com a administração tópica de compostos vasoativos para criar um in vivo banho reactividade vascular ^3. Vários factores devem ser tidos em consideração quando da preparação de uma janela craniana, a fim de diminuir a taxa de insucesso desta técnica. Muitos desses fatores estão relacionados com a obtenção de uma boa visualização das artérias cerebrais. Em primeiro lugar, deve ser tomado cuidado durante a criação da craniectomia de modo que os vasos dura ou sangue sobrejacente, não são interrompidas com a broca. Este é o melhor conseguidopor lavagens freqüentes com solução salina estéril para retirar os escombros e esfriar a cabeça. Em segundo lugar, o fragmento de osso deve ser levantado suavemente quando é removido. Se o fragmento não se afastar facilmente, então a broca deverá ser utilizado para cortar mais osso. Por último, de pequenas quantidades de sangue ou CSF pode facilmente alterar a aparência da janela craniana durante este procedimento. A craniectomia efectuado proporciona uma abertura no crânio que é maior do que o necessário para a visualização. Portanto, é fácil de colocar várias esponjas absorventes na porção dependente do local cirúrgico, para evitar a acumulação de fluido. Estas esponjas pode ser mudado quando necessário se o cuidado é usado para não obstruir a janela com instrumentos cirúrgicos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inhalation anesthesia system	VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA	901806
Isoflurane anesthetic	Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA	1001936060
Small animal stereotaxic system	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	900
Non-rupture ear bars, rat	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	957
Rat gas anesthesia head holder	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	1929
BAT-12 microprobe thermometer	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	BAT-12
T/PUMP, Thermal blanket	Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA	T/PUMP, TP600
Metzenbaum Scissors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	501254
Iris forceps	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	15915
Bulldog clamp retractors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	14119-G
10 μl syringe 26-gaugue	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	SGE010RNS
Bovie, high temperature cautery kit	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	500392
Rat tooth forceps 0.12	Stotz	E1811
Micromotor drill	Stoelting, Wood Dale, IL, USA	51449
0.8 mm round drill bur	Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA	RS-6280C-1
STORZ Bonn suturing forceps	Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA
Nylon Suture, size 3.0	Oasis, Mettawa, IL, USA	MV-663
Cotton swabs	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	22-029-488
Puralube eye ointment	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	NC0138063
Electric hair clippers	Oster, Providence, RI, USA	78005-301
ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS	American Peptide, Sunnyvale, CA, USA	88-1-10A
Chlorhexidine, 2%	Agrilabs, St. Joseph, MO, USA	1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322
Surgical microscope	Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA	Evolution xR6
Sony Handycam	Sony, Minato, Tokyo, Japan	HDR-SR12
Fiber optic illuminator	TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA	FO1–150
VLC media Player	(Paris, France)
Image J software	U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA