Utilizando una ventana craneal para visualizar la arteria cerebral media Durante la endotelina-1 inducida por oclusión de la arteria cerebral media

Summary

Este artículo describe un método para la visualización de las arterias cerebrales de rata a través de una ventana craneal mediante craniectomía temporal con el fin de ver las partes proximales de la arteria cerebral media (

Abstract

Creación de una ventana craneal es un método que permite la visualización directa de las estructuras en la superficie cortical del cerebro ^1-3. Esta técnica se puede realizar en muchas localizaciones que recubren el cerebro de rata, pero es más fácil de llevar a cabo mediante la creación de una craniectomía sobre los huesos de fácil acceso frontal o parietal. Con más frecuencia, se ha utilizado esta técnica en combinación con la endotelina-1 medio modelo oclusión de la arteria cerebral del accidente cerebrovascular isquémico para cuantificar los cambios en el diámetro medio vaso cerebral arteria que se producen con inyección de endotelina-1 en el parénquima cerebral adyacente a la MCA proximal ^{4, 5.} Con el fin de visualizar la parte proximal de la MCA durante endotelina -1 inducida MCAO, se utiliza una técnica para crear una ventana craneal a través del hueso temporal en el aspecto lateral del cráneo de rata (Figura 1). Arterias cerebrales puede ser visualizado o bien con la duramadre intacta o con la duramadre y incisa RetraDirección Ejecutiva. Por lo general, dejamos la duramadre intacta durante la visualización desde la endotelina-1 inducida por MCAO implica la entrega del péptido vasoconstrictor en el parénquima cerebral. Esto evita la necesidad de una incisión en la duramadre directamente sobre los vasos visualizado para la administración de fármacos. Este protocolo se describe cómo crear una ventana craneal para visualizar las arterias cerebrales de una forma gradual, así como la manera de evitar muchos de los problemas potenciales relacionados con este método.

Protocol

Este protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Florida y está en conformidad con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" (octava edición de la Academia Nacional de Ciencias, 2011).

Materiales

1. Animales: Ocho semanas de edad, macho, Sprague Dawley (Charles River Farms, Wilmington, MA, EE.UU.) con un peso de 250-300 g en el momento de la cirugía.
2. Anestesia
   1. Inhalación sistema de anestesia (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, EE.UU.)
   2. El isoflurano anestesia (Farmacia Baxter, Deerfield, IL, EE.UU.)
3. Estereotáxica sistema (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE.UU.)
   1. Animal Pequeño sistema estereotáxico
   2. Para no romper los oídos barras para ratas
   3. Anestesia Gas cabeza titular para ratas
4. Regulación de la temperatura
   1. BAT-12 termómetro microsonda (WorldPrecision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.)
   2. T / PUMP, TP600 manta térmica (Industrias Gaymar, Inc., Orchard Park, Nueva York, EE.UU.)
5. Los instrumentos quirúrgicos
   1. Metzenbaum tijera iris pinzas, separadores bulldog abrazadera, jeringa de 10 ml con aguja de calibre 26 biselado, Bovie cauterización kit (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.)
   2. Micromotor de perforación (Stoelting, Wood Dale, IL, EE.UU.)
   3. 0,8 mm redondo taladro fresa (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.)
   4. STORZ Bonn sutura Pinzas (Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, EE.UU.)
6. Suministros Quirúrgicos
   1. 3,0 nylon sutura (Oasis, Mettawa, IL, EE.UU.)
   2. Hisopos de algodón, pomada ocular Puralube (Fisher Científico, Pittsburgh, PA, EE.UU.)
   3. Puntos quirúrgicos y tiras (Medtronic Xomed, Inc., Jacksonville, FL, EE.UU.)
   4. Máquinas de cortar el cabello (eléctricas Oster, Providence, Rhode Island, EE.UU.)
   Químicos
   1. La endotelina-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, EE.UU.)
   2. La clorhexidina al 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, EE.UU.)
7. Visualización de equipos
   1. Microscopio quirúrgico (Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, EE.UU.)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokio, Japón)
   3. Iluminador de fibra óptica (TechniQuip Corp., Livermore, CA, EE.UU.)
8. Medición del diámetro de los vasos
   1. VLC media player (París, Francia)
   2. Image J software (software ImageJ 1.42q, EE.UU. Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MA, EE.UU.)

1. Pre-quirúrgicos Pasos

1. Antes de la cirugía, las ratas se alojaron en un 12:12 luz / oscuridad ciclo con acceso libre a comida y agua roedores.
2. La anestesia se indujo con 4% de isoflurano en 100% de mezcla de gas O ₂ en una cámara de inducción.
3. El cuervo n de la cabeza rapada con cortar el pelo eléctricas.
4. La rata se coloca en posición de decúbito prono sobre una almohadilla absorbente tendido en una superficie de operación de temperatura controlada (manta térmica) y la cabeza se coloca en el aparato estereotáctico de partida con la colocación de la máscara facial gas anestésico.
5. A continuación, las barras del oído se inserta y se aprieta.
6. Durante el procedimiento de anestesia se mantiene con 2% de isoflurano en 100% de mezcla de gas O _2.
7. Pomada oftálmica lubricante se aplica a ambos ojos y los párpados están cerrados para prevenir la desecación del ojo durante el procedimiento quirúrgico.
8. Una sonda de temperatura rectal es insertado para mantener una temperatura constante animales núcleo de 37 ± 0,5 ° C.
9. Con la cabeza de la rata anestesiada mantiene firmemente en el dispositivo estereotáxico el área quirúrgica se limpia con alternancia de clorhexidina y solución salina tres veces.

2. Pre-craneal Ventana Preparación

ONTENIDO "> Antes de la creación de una ventana craneal, la rata debe estar preparado para cualquier experimento mediante la implantación de hardware requerida y debe recibir ningún procedimientos quirúrgicos requeridos. Para este protocolo, se han implantado previamente una cánula guía para la endotelina-1 (ET- 1) inducida por MCAO como se muestra en una publicación que titula "La endotelina-1 inducida cerebral media oclusión arterial Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en la rata".

3. Creación de la ventana craneal

Después de la colocación de una cánula guía o el equipo requerido para la experimentación, una ventana craneal se crea para visualizar directamente las porciones proximales de la arteria cerebral media durante un procedimiento de accidente cerebrovascular.

1. En primer lugar, las tijeras se utilizan para incisión en la piel que recubre el músculo temporal medial de partida y trabajar lateralmente.
2. El músculo temporal es atravesada con electrocauterio y luego se retractó utilizando 3,0 sutura de nylon para visua lizar la porción escamosa del hueso temporal.
3. Un cuadrado aproximadamente 3-4 mm se dibuja sobre la porción escamosa del hueso temporal caudal a la órbita y superior a la base del proceso cigomático como se refleja fuera del hueso temporal.
4. Un taladro se utiliza para cortar gradualmente la pieza resumidas de hueso libre del hueso temporal. Se debe tener cuidado para evitar la aplicación de demasiada presión a la broca, ya que es posible dañar la dura o corteza cerebral.
5. Enjuagues frecuentes con solución salina estéril se realizan para mejorar la visualización del campo quirúrgico y evitar el sobrecalentamiento del cráneo.
6. A partir de una esquina suelta, el trozo de hueso temoporal se retira cuidadosamente con finos dientes de rata pinzas asegurándose de no romper ningún buque asociados con la duramadre.
7. La duramadre se deja intacto y escombros se enjuaga con solución salina estéril.

4. Grabación de constricción de las arterias cerebral

tienda de campaña "> Para demostrar cómo capturar imágenes en tiempo real, una rata que está pasando por ET-1 inducida por MCAO se utiliza para este protocolo.

1. Antes de la aplicación de compuestos vasoactivos, un vídeo de línea de base debe ser registrada por lo menos durante 1 min. Para ET-1 inducida por MCAO, la grabación de línea de base se realiza una vez que la aguja ha sido bajada en el parénquima cerebral, pero antes de la inyección de ET-1.
2. La bomba de jeringa se inicia por inyección y grabado durante 1 hora o hasta que el punto final deseado. La aguja se deja en su lugar durante la grabación de vídeo con el fin de evitar perturbaciones en el plano focal.
3. La rata debe ser profundamente anestesiados y sacrificados de acuerdo con un protocolo aprobado siguiendo este procedimiento.

5. Análisis de Imagen

El diámetro del vaso se puede determinar para cualquier parte de la visualizaron MCA. Como ejemplo, vamos a utilizar una rama de la MCA para medir el diámetro del vaso en los puntos de tiempo antes y después de la inyección de ET-1. Stimarcos ll del video se capturan a intervalos de 1 min utilizando VLC media player (VideoLAN).

1. VLC jugador está instalado y se abrió.
2. Mediante la selección de herramientas y luego preferencias, el ajuste cambia a "All" en "Mostrar valores".
3. El "menú de vídeo" se expande en la barra lateral izquierda y "módulos de salida" se expande entonces. "Los filtros de Escena" está seleccionado para que aparezca el menú de vídeo escena filtro.
4. "Escena" se escribe en el cuadro de nombre de archivo para el prefijo.
5. Un prefijo de ruta del directorio está definido. Aquí es donde se guardan imágenes fijas.
6. Una relación de grabación se selecciona basándose en la velocidad deseada de captura de imagen fija. Si un vídeo se capturó a 29 fotogramas por segundo, a continuación, "1749" (29 cuadros / seg x 60 seg / min) se consignarán en la casilla para guardar una imagen fija cada 1 min. Todos los cambios se guardarán.
7. El vídeo deseado se abrió en el reproductor VLC para guardar automáticamente imágenes fijas una vez cada 1 min.
8. El diámetro del vaso se mide entonces usando estosimágenes. En primer lugar, el software ImageJ (NIH) se abre.
9. A continuación, los cuadros fijos que se va a medir se abren en ImageJ.
10. Seleccionando la opción "analizar" menú ", establecer medidas" se abrió y todas las casillas estén marcadas.
11. A continuación, la herramienta de la línea recta se selecciona.
12. La combinación de teclas "Ctrl +" se utiliza para hacer un zoom según sea necesario y se coloca una línea perpendicular a la trayectoria recipiente para medir el diámetro del vaso.
13. Por último, la eslora del buque se obtiene seleccionando la opción "analizar" y haga "medida" (Ctrl + M) para obtener la eslora del buque.
14. Este proceso se repitió al menos tres veces y se promediaron para cada recipiente de medida se mide en cada trama todavía.
15. El diámetro del vaso en cada punto de tiempo se normaliza al diámetro del vaso de referencia de modo que se pueden hacer comparaciones múltiples utilizando ratas. Para ello, utilice la fórmula actual Diámetro / diámetro basal x 100% para calcular el diámetro basal% de cada buque.

Representative Results

Las imágenes fijas tomadas de la serie de vídeo capturado que el cambio en el diámetro de la arteria cerebral después de la inyección de ET-1 se puede apreciar fácilmente utilizando esta técnica de ventana craneal (Figura 2). Pocos minutos después de la inyección de ET-1, el recipiente comienza a constreñir. Eventualmente los vasos será difícil de visualizar y el tejido cerebral se convertirá pálido. Después de unos 20 min de los efectos de ET-1 disminuye y los vasos comenzará a dilatarse, volviendo gradualmente a diámetro de línea base después de aproximadamente 45 min. Además de la vasoconstricción más obvio que se produce, la superficie cortical se vuelve más pálida después de la administración de ET-1. Es posible calcular la variación absoluta en el diámetro del vaso con una retícula de microscopio calibrado si se desea. Para la comparación entre las ratas múltiples que calcular el cambio relativo en el diámetro del vaso que se produce durante un procedimiento. Estas mediciones se realizaron utilizando el software ImageJ (NIH). A continuación, un gráfico que representa la relcreativas cambios en el diámetro del vaso en el tiempo puede ser construida (Figura 3).

Figura 1. Diagrama de la ubicación de la craniectomía temporal. Este diagrama representa la anatomía del esqueleto del cráneo de rata con orientación anterior a la izquierda. El músculo temporal tiene su origen en la cresta lateral del cráneo. Este músculo se deben remover de esta cresta y atravesada con el fin de visualizar la porción escamosa del hueso temporal. Una craniectomía mm aproximadamente 3-4 se pueden realizar en esta ubicación justo posterior a la órbita y superior a la base de la apófisis cigomática, ya que refleja fuera del hueso temporal. La flecha grande indica la ubicación para realizar la craniectomía. Las 3 flechas pequeñas indican la CRM y sus ramas. Todas las arteriasen esta ubicación será ramas de la MCA y las arterias se pueden distinguir de las venas por tanto su no tortuoso apariencia y sensibilidad a compuestos vasoactivos.

Figura 2. Ventana craneal antes de la inyección de ET-1, ET-1 después de la inyección, y después de la reperfusión. Comenzando desde la izquierda, una imagen representativa de ramas MCA como se ve a través de una ventana craneal se muestra. Las arterias pueden ser identificados por su morfología. El relativamente sencillo MCA entra en el campo en la parte inferior izquierda y tiene un punto de ramificación importante en esta imagen. Los demás barcos en estos cuadros son venas cerebrales que pueden ser identificados por su tono más profundo y el aspecto tortuoso. Durante la oclusión arterias se contraen rápidamente y el tejido se volverá pálida. Poco a poco, la arteria se dilata y volver al diámetro basal.

Figura 3. Diámetro representante recipiente con el tiempo para un diámetro de base única rata. Porcentaje se puede calcular en el tiempo utilizando la fórmula simple, diámetro actual / de referencia de diámetro x 100%. Esto se puede hacer con cualquier compuesto vasoactivo.

Discussion

En resumen, esta técnica de ventana craneal preparación es muy versátil ya que puede modificarse para satisfacer las necesidades de muchos experimentos con modificaciones menores ^{4, 5.} Por ejemplo, hemos logrado controlarse el flujo sanguíneo cerebral en determinadas ramas de MCA con la flujometría láser Doppler para centrarse directamente en una arteria cerebral visualizada a través de una ventana craneal (Meca AP 2009 y 2011). Además, una preparación similar con el incisa duramadre puede ser utilizado con la administración tópica de compuestos vasoactivos para crear un baño en la reactividad vascular in vivo ^3. Varios factores deben ser tomados en consideración en la preparación de una ventana craneal con el fin de disminuir la tasa de fracaso de esta técnica. Muchos de estos factores están relacionados con la obtención de una buena visualización de las arterias cerebrales. En primer lugar, se debe tener cuidado al crear la craniectomía para que los vasos dura o sangre suprayacentes no se interrumpen con la broca. Esto se logra mejorpor lavados frecuentes con solución salina estéril para eliminar los residuos y enfriar el cráneo. En segundo lugar, el fragmento de hueso debe ser levantado suavemente cuando se retira. Si el fragmento no separarse fácilmente, entonces la broca debe ser utilizado para cortar más tejido óseo. Por último, pequeñas cantidades de sangre o LCR puede fácilmente alterar la apariencia de la ventana craneal durante este procedimiento. La craniectomía realizado proporciona una abertura en el cráneo que es mayor que el requerido para la visualización. Por lo tanto, es fácil de colocar varias esponjas absorbentes en la parte dependiente de la zona quirúrgica para evitar la acumulación de líquido. Estas esponjas se puede cambiar según sea necesario si se utiliza cuidado de no tapar la ventana con herramientas quirúrgicas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inhalation anesthesia system	VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA	901806
Isoflurane anesthetic	Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA	1001936060
Small animal stereotaxic system	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	900
Non-rupture ear bars, rat	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	957
Rat gas anesthesia head holder	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	1929
BAT-12 microprobe thermometer	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	BAT-12
T/PUMP, Thermal blanket	Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA	T/PUMP, TP600
Metzenbaum Scissors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	501254
Iris forceps	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	15915
Bulldog clamp retractors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	14119-G
10 μl syringe 26-gaugue	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	SGE010RNS
Bovie, high temperature cautery kit	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	500392
Rat tooth forceps 0.12	Stotz	E1811
Micromotor drill	Stoelting, Wood Dale, IL, USA	51449
0.8 mm round drill bur	Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA	RS-6280C-1
STORZ Bonn suturing forceps	Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA
Nylon Suture, size 3.0	Oasis, Mettawa, IL, USA	MV-663
Cotton swabs	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	22-029-488
Puralube eye ointment	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	NC0138063
Electric hair clippers	Oster, Providence, RI, USA	78005-301
ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS	American Peptide, Sunnyvale, CA, USA	88-1-10A
Chlorhexidine, 2%	Agrilabs, St. Joseph, MO, USA	1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322
Surgical microscope	Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA	Evolution xR6
Sony Handycam	Sony, Minato, Tokyo, Japan	HDR-SR12
Fiber optic illuminator	TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA	FO1–150
VLC media Player	(Paris, France)
Image J software	U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA