Summary
Här beskriver vi en Schwann-cell (SC) migration analys i vilken kaster kan utveckla tillsammans sträcker axoner.
Abstract
Utvecklingen av perifera nerver är en spännande process. Nervceller skickar ut axoner att innerverar specifika mål, vilka hos människor är ofta mer än 100 cm från soma av neuron. Neuronal överlevnad under utveckling är beroende av mål-härledda tillväxtfaktorer, men också på stöd från Schwann celler (SCS). Till detta syfte SC ensheath axoner från regionen av det neuronala soma (eller övergången från centrala till perifera nervsystemet) till synaps eller neuromuskulära förbindelsen. Schwann-celler är derivat av neurallisten och migrera som prekursorer längs framväxande axoner tills hela axonet är täckt med SCS. Detta visar hur viktigt det är SC migration för utveckling av det perifera nervsystemet och understryker behovet av att undersöka denna process. För att analysera SC utveckling, en inställning som behövs som bredvid SCS även deras fysiologiska substrat för migration, axonet. Grund intrauterin utveckling
Protocol
1. Beredning av kollagengeler
- Förbered ett lager medium innehållande 455 ul 10x MEM, 112 ul 7,5% NaHCO 3, 50 pl glutamin och NaOH. Koncentrationen och mängden av NaOH beror på råtta-svans kollagen beredning (se 1,2), den slutliga volymen av beståndet mediet är 1.000 il.
- Förbered råtta-svans kollagen enligt Ebendals (1). Förvara Kollagen lösningen vid 4 ° C. En nedbrytning av kollagenlösningen kunde inte observeras. Efter beredning av en ny sats, uppskatta NaOH-koncentrationen som krävs för beståndet mediet (se 1,1). Använd pH-indikatorn i mediet för titrering av mängden och koncentrationen av NaOH. 800 ul sura råtta-tail kollagen måste vända en nyans av rött när de blandas med 210 pl av beståndet mediet. Om koncentrationen av NaOH är alltför låg kollagenlösningen blir gul, beroende på pH-indikatorn i mediet. Lägg kollagen till mediet och blanda utan produkterucing bubblor. Utför dessa steg på is. Polymerisationen sker inom 2 h efter kollagenlösningen och beståndet mediet har blandats och den nya lösningen inkuberas vid 37 ° C. Testa detta innan ett experiment. 1,3) Blanda 800 pl av kollagen lösning med 210 | il av lager-medium (se 1,2). Placera 100 pl av denna lösning i brunnar i en 8 väl kammare bild. Inkubera glasen vid 37 ° C, 5% CO 2 och fuktiga betingelser i en cellkultur inkubator. Förbered kollagengeler i en cellkultur bänk och sterila förhållanden. Kollagenet gelatinerar inom 2 timmar.
2. Dissektion av embryonala SCGs
- Harvest embryon tid dräktiga möss (E16-18) från livmodern och hålla dem i PBS tills vidare behövs.
- Dissekera ett embryo från amnion. Halshugga embryot kaudala av klavikulära nivå. Fäst huvudet på en kisel botten skålen med "insekt-nålar". Den ventrala sidan av huvudet står inför dig enskulle du måste se submandibular regionen. Fixeringen möjliggör enklare framställning.
- Avlägsna hud submandibulära regionen vänster och höger och med den sub-kutan bindväv.
- Ta bort submandibulära spottkörtlarna från sin plats för att rensa vyn på hyoid de infrahyoidal muskler och sternocleidomastoideus.
- Ta bort dessa muskler försiktigt för att rensa vyn på struphuvudet och luftstrupen. Avlägsna luftstrupen och struphuvudet. Halspulsåder därefter synlig på båda sidor om de prevertebral muskler. SCG är belägen i bifurkationen av halspulsåder och har en oval form. Ta försiktigt bort ganglierna och placera dem i PBS. Ta bort ganglierna försiktigt från dissekering verktyg om de fastnar på dem. Det är fördelaktigt att använda pincetter samt en nålhållare monterad med en "insekt nål" för SCG avlägsnande.
- En gång i PBS, förvara ganglierna i rumstemperatur i PBS tills du dissekerade enough ganglier. Rengör ganglierna från blodkärl och bindväv. Utför SCG dissektion och rengöring under ett dissektionsmikroskop placeras under ett laminärt flöde bänk.
- Slutligen, placera den explanterade ganglier på de gelatinerade kollagengeler med hjälp av kanyler monterade på en spruta för enklare hantering.
- Inkubera SCG explantaten på den gelatiniserade kollagen i en cellkultur inkubator vid 37 ° C, med 5% CO 2 och fuktiga förhållanden.
3. Behandling av SCG Explantat
- Efter 1-2 timmars inkubering, täcker SCG explantatet innehållande kollagen med 100 pl Neurobasal cellodlingsmedium innehållande B27-komplement, glutamin och antibiotika. Nu brunnarna av kammaren bilderna innehåller en volym av 200 | il (100 | il gel och 100 ul medium). Lägga till ytterligare 200 pl av mediet, men nu innehåller NGF (60 ng / ml) för att underlätta axonal tillväxt. I den slutliga koncentrationen NGF är 30 ng / ml.
- För att undersöka uppkomsten av SC migration, lägga till ytterligare faktorer direkt på dag in vitro 0 (DIV0). Lös de faktorer i NGF innehållande mediet i behövs dubbla koncentrationen (2).
- För att analysera effekterna på SCS, som redan börjat migrera längs axoner, lägga till ytterligare faktorer vid DIV3 till DIV4 (potentiell stopp av experimentet). I detta syfte försiktigt bort 180 ul av lösningen på DIV3 och tillsätt 200 pl nytt medium innehållande NGF och ytterligare faktorer av intresse vid den dubbla koncentrationen (2).
4. Time-lapse avbildning
Använd ett inverterat mikroskop för analyser. Olika mål kan användas, definierar synfältet och förstoring. En viktig aspekt är emellertid arbetsavståndet av den använda målet, eftersom avbildning av SCG explantaten sker genom glasskivan och kollagengel. Inspelningen bildhastighet 1/10-30 minuter visade goda resultat (2). Har dock denna aspekt justeras till den vetenskapliga frågan. En normal CCD-kamera kan användas för bildtagning. För tid lapse avbildning en cellkultur inkubationskammaren måste fästas till det stadium av mikroskopet. Inkubera vävnaden under avbildning vid 37 ° C, med 5% CO 2 och fuktiga förhållanden. Starta inkubationen timme systemet en före avbildning. Detta gör att mikroskop delar (t.ex. mål) inklusive kammaren bilden för att anpassa sig till temperaturen och förhindrar temperaturinducerade drivor. Definiera specifika områden av analyser (inom på explantation och mellan olika explantat) med hjälp av mikroskop programvara och en programvara kontrollerad motoriserad stadium (multiposition inställning) för samtidiga analyser av olika tillämpade villkor för SCG explantaten. För tidsförlopp avbildning vildtyp vävnad samt vävnad från transgena djur kan användasmärkning SCS (S100B: GFP) (3). För avbildning fluoroforer en fluorescerande ljuskälla måste genomföras i micropscope setup. Använd vanliga filter.
5. Kvantifiering av migration SC avstånd
- Vid slutpunkten (DIV4 till exempel), fastställa kollagengeler med 4% PFA i kammaren bilden för 3-4 timmar. Konsekutivt Tvätta kollagengeler 5 gånger under 10 minuter med PBS. Applicera standardprotokoll för immuncytokemi (2). Om du är ny till utarbetandet av SCGs, kontrollera identitet ganglion som en sympatisk ganglion genom immunohistokemi mot tyrosinhydroxylas (TH) en gemensam markör för katekolaminerga celler. Under immunohistokemi (efter den primära antikroppen), överför explantatet innehåller kollagen geler till 24 brunnar, som har en större volym, vilket är bra för att tvätta gelerna.
- Efter immunohistokemi, försiktigt placera kollagengeler på glasskivor. Försiktigtavlägsna kvarvarande lösningen och låt torka kollagen / krympa till två dimensioner. Detta gör enkla mätningar av avstånd (2). Efter detta, monterar proverna.
- Slutligen, mäta migration avstånd med hjälp av Fiji (NIH) mjukvara. Inga speciella insticksmoduler behövs för detta ändamål. För att möjliggöra korrekta mätningar i um, kontrollera rätt avbildning metadata och inställningar under Fiji, bild och skala. Använd Fiji också för kvantifiering av celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Axonal tillväxt underlättas av SCG explantat vid behandling med NGF (4) (film schema S1 Figur 1 system). Denna process är väl synlig på något inverterat mikroskop och kan följas av time-lapse avbildning (film S2). Om en forskare är nytt för dissekera SCG från musembryon rekommenderar vi en validering av tekniken genom en enkel anti-tyrosinhydroxylas (TH) immunohistokemi. TH är en vanlig markör för katekolaminerga neuroner (i detta fall sympatiska nervceller) och gör även märka axoner (Figur 2B). På detta sätt axonala längder kan analyseras i detta system (2).
Viktigare, efter axonal tillväxt har inducerats, kan en våg av migrerande celler observeras (film S2 och S3). Migrera celler validerats som S100 immuno positiv SC (2). Dessutom en transgen mus, på vilken GFP är under kontroll av den humana S100B promotorfragmentet (3) kan användas för att direkt analysera den märkta SC populationen (2) (film S4 och S5). Med hjälp av denna transgen linje dessa experiment kan också utföras med konfokal-eller ljus ark mikroskopi (ej utförts här).
För analyser av SC under flyttningen, rekommenderar vi ett område av analys med en låg axonal densitet (figur 1 närbild DIV3 och DIV4) och därmed en liten population av SC per område analys. Detta underlättar bästa möjligheterna att se cell morfologi och cellulära beteende (film S3).
SC migration avstånd kan mätas vid slutet av ett försök (t.ex. DIV4). För detta ändamål DAPI kärnkraft märkning kan utföras på fasta vävnad och avstånd från de ledande SC kärnorna till gränsen av explantatet kan mätas med hjälp av Fiji (NIH programvara) (Figur 2 system och DAPI märkning) (2).Dessutom även SC proliferation eller SC död kan analyseras. För detta ändamål immunohistokemi för phh3 eller för aktiverad kaspas 3 kan utföras exempelvis identifiering mitotiska eller apoptotiska celler respektive (2).
Figur 1 A:. Schema som visar axonal tillväxt från en explanterade SCG över tid (DIV0-DIV4). B / C: brightfield bilder, som registrerats under time-lapse avbildning visar närbilder av en region av en SCG explantat vid DIV3 (B) och DIV4 (C) (skala bar = 100 nm).
Figur 2 A:. System visar SC (blå) längs förlängda axoner (grå), vuxit från en explanterade SCG (ljusblå) på DIV3 och DIV4. Migration avstånd kan mätas på DAPI kärnvapen märkta prover genom att mäta avståndet från kärnan av den ledande SC till gränsen av den explanterade SCG på flera platser (C). TH immunohistokemi (DIV4) bör utföras om en vetenskapsman är nytt för SCG dissektion. En positiv märkning identifierar klart explanterad ganglion som en sympatisk ganglion (B). TH immunohistokemi möjliggör också analyser av axoner vuxit från explanterade SCGs.
Film S1. Schema som visar axonal tillväxt från en explanterade SCG under flera dagar in vitro. Klicka här för att se filmen .
Film S2. Axonal tillväxt och SC migration från en NGF behandlad SCG explantat. Imaging började på DIV2. Inspelning bildhastighet var 1/30 minut. Skala-bar = 100 nm. Klicka här för att se filmen .
ntent "> Film S3. Närbild på ett perifert område av en SCG explantat. På grund av en låg axonal densitet enstaka SC kan enkelt analyseras. Imaging start var DIV3. Inspelning bildhastighet var 1/10 minut. Skala-bar = 100 nm . Klicka här för att se filmen .Film S4. Kombinationen av ljusfält och fluorescens möjliggör visualisering av S100 GFP positiva kaster och axoner. Inspelning bildhastighet var 1/10 min. Skala-bar = 100 nm. Klicka här för att se filmen .
Film S5. SC migration på gränsen till en SCG explantat. Här endast fluorescens kanal visas möjliggör enklare tolkning av S100 GFP-positiva kaster. Inspelning bildhastighet var 1/10 min. Skala-bar = 100 nm./ 50016/50016movieS5.avi "target =" _blank "> Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvecklingen av det perifera nervsystemet är en spännande process. När utvecklingen är klar, axoner ensheathed av SCS utmed hela längden, vilket kan, i människor, ofta över 100 cm. För detta ändamål korrekta antalet erforderliga kaster måste fastställas under utveckling och SCS också att röra sig längs sträcker axoner till periferin för att garantera fullständig axonal täckning. Detta gäller för myeliniserade utan också för unmeylinated axoner. I båda fallen alla axoner är i kontakt med kaster och är beroende av deras stöd. För att studera SC utveckling, är analyser behövs som tar axonala utrymmet beaktas och därmed efterlikna in vivo-utvecklingen till en bättre utsträckning än scratch tester (5), kan Boyden analyser (6) eller analyser kammaren göra. I vissa analyser av axonal facket beaktades redan. Till exempel sektioner av ischiasnerver användes som rutter för SCS att migreratillsammans (7, 8), eller SCS samodlades med nervceller längs vilka axoner de observerades migrera (9).
SCG explantat SC migrering analys har emellertid ännu fler fördelar. Det är särskilt intressant eftersom kaster utvecklas längs egna fysiologiska axoner, och dessa är själva fortfarande växer. Dessutom tekniken är lätt att lära sig och kräver endast lite teknisk dissekering kompetens och inte kräver en komplex samodlingssystemet av neuroner och SCS. En ganska lika setup, dock inte med SCGs utan snarare DRG, har föreslagits av Gumy och kollegor (10). Men att utnyttja alla möjligheter i en sådan analys är en inverterad mikroskop installation behövs möjliggör time-lapse avbildning. Det är viktigt att ha möjlighet att göra "multi-läge experiment", för att kunna analysera differentiellt behandlas SCG explantat, som ligger i en kammare bild, samtidigttid, vilket möjliggör arbetet med optimal kontroll sida vid sida med de faktorer av intresse (2). För analyserar vi endast används konventionella ljus-och konventionell fluorescens (för transgen S100B: GFP möss) mikroskopi. Tekniken kan emellertid också lätt användas med konfokal-eller jämnt ljus ark mikroskopi (ej utförts här). Time-lapse inspelning kan användas för att identifiera specifika cellulära egenskaper / beteenden under migreringen. Hittills endast vildtyp och transgena möss har använts (2). Emellertid bör transfektion av SC och därmed förändring av vägar med RNAi exempelvis vara genomförbart. Med denna teknik kan det även vara möjligt att analysera SC-axon samspelet mellan normal och förändrad SC på samma eller angränsande axon. När det gäller migration avstånd, SC spridning och SC överlevnad, kan Slutpunkt analyser enkelt genom immunhistokemi med DAPI kärnkraft märkning och Fiji (NIH) mjukvara. Men så småningom även liv-reparter för proliferation (11) och celldöd (12, 13) kan användas, varigenom en direkt avläsning under avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Urmas Arumäe för att dela en kollagen-protokoll och Jutta Fey och Ursula Hinz för utmärkt tekniskt stöd. Dessutom vill vi tacka Christian F. Ackermann, Ulrike Engel och Nikon Imaging Center vid universitetet i Heidelberg, och även Joachim Kirsch för vänligt hjälp för video shoting. Arbetet var delvis finansieras via Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | Gibco | 21430 | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080 | |
| Glutamine | Gibco | 25030 | |
| NaOH | Merck | 109137 | |
| NGF | Roche | 1058231 | R&D#556-NG-100 |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504 | |
| antibiotics | Gibco | 15640 | |
| d-PBS | Gibco | 14040 | |
| insect needles | FST | 26002-20 | |
| syringe needle | Braun | BD # 300013 | |
| 8 well chamber slide | Lab tek | 177402 |
References
- Ebendal, T. Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).
- Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6 (12), e28692 (2011).
- Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).
- Levi-Montalcini, R., Booker, B. EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).
- Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway. Glia. 34 (1), 39-51 (2001).
- Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration. The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).
- Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2795-2799 (1994).
- Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
- Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).
- Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG. Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).
- Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).
- Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnology. 9, 24 (2009).
