Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

3D उन्नत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर भोजी के मात्रात्मक विश्लेषण

doi: 10.3791/50047 Published: May 3, 2013

Summary

भोजी कोशिकाओं को प्रोटीन और organelles नीचा और पुनरावृत्ति करने के लिए सक्षम बनाता है एक सर्वव्यापी प्रक्रिया है. हम कल्पना और छोटे यों को उन्नत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लागू होते हैं, लेकिन autolysosomes में गठन और autophagosomes और लाइसोसोम के वितरण, और उनके संलयन सहित भोजी की प्रेरण के साथ जुड़े आवश्यक, शारीरिक परिवर्तन,.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. भाग 1: सेल संस्कृति और इम्यूनो फ्लोरोसेंट लेबलिंग

  1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / glutamine युक्त RPMI (Mediatech, VA) के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटें में रखा कांच coverslips (# 1.5 या 170 माइक्रोन मोटाई), पर CWR22 Rv1 मानव प्रोस्टेट ट्यूमर कोशिकाओं को विकसित.
  2. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में आर्जिनिन deiminase (आदि, 0.3 ग्राम / एमएल) के साथ चयनित नमूनों के इलाज से भोजी प्रेरित.
  3. आरटी पर 10 मिनट के लिए, coverslip प्रति 100 μl, पीबीएस में पतला 4% paraformaldehyde (पीएफए, फिशर साइंटिफिक, राष्ट्रीय राजमार्ग) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें.
  4. 1 मिलीलीटर HBS / बीएसए के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें.
  5. आरटी पर 15 मिनट के लिए HEPES (HBS) / बीएसए, coverslip प्रति 100 μl में 0.05% सैपोनिन (सिग्मा, एमओ) के साथ कोशिकाओं Permeabilize.
  6. पिछले इम्युनो लेबलिंग, HBS / बीएसए, coverslip प्रति 100 μl में 2.5% कैसिइन (सिग्मा, एमओ) के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए ब्लॉक के नमूने लिए.
  7. 2.5% कैसिइन / HBS / बीएसए, coversl प्रति 100 μl में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ तय की कोशिकाओं को सेते4 में आईपी, ओ / एन डिग्री सेल्सियस
  8. 1 मिलीलीटर HBS / बीएसए के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें.
  9. आरटी पर 1 घंटे के लिए, 2.5% कैसिइन / HBS / बीएसए, coverslip प्रति 100 μl में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ तय की कोशिकाओं को सेते हैं.
  10. 1 मिलीलीटर HBS / बीएसए के साथ 3x कोशिकाओं को धो लें.
  11. SlowFade गोल्ड के साथ नियमित रूप से गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर तैयार coverslips के माउंट या 4 युक्त गोल्ड antifade अभिकर्मक (Invitrogen, सीए) ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) लम्बा.
  12. नेल पॉलिश के साथ सील coverslip किनारों. सबसे अच्छा इमेजिंग परिणामों के लिए, विरोधी फीका मीडिया के लिए समय (आदर्श हे / एन) अच्छी तरह से कोशिकाओं को तर करने के लिए अनुमति देते हैं.
  13. मेथनॉल और / या क्लोरोफॉर्म के साथ स्वच्छ coverslip सतह.
  14. विसर्जन के तेल (अपवर्तक सूचकांक 1.520 जब इमेजिंग 37 डिग्री सेल्सियस, या 1.516 जब आरटी पर इमेजिंग) 60X 1.42 एनए उद्देश्य लेंस (ओलिंप, जापान) के लिए. जोड़ें
  15. स्थिति खुर्दबीन मंच पर स्लाइड और ब्याज की कोशिकाओं के साथ ध्यान केंद्रित करने की स्थापना.

2. भाग 2: लाइव इमेजिंग के लिए तैयारी प्रकोष्ठों

  1. CWR बढ़ो35 मिमी पाली घ lysine लेपित गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन (MatTek, एमए) पर 10% FBS और 1% एंटीबायोटिक दवाओं युक्त RPMI संस्कृति मीडिया में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन युग्मित लाइट श्रृंखला 3 (LC3 GFP) व्यक्त 22 Rv1 कोशिकाओं. कोशिकाओं के तेजी से प्रसार की सुविधा के लिए पर्याप्त घनत्व पर चढ़ाया, लेकिन इतना नहीं कोशिकाओं ऊंचा हो गया और इमेजिंग के समय से clumped हैं कि किया जाना चाहिए.
  2. पीबीएस में आदि (0.3 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ चयनित कक्ष नमूने समझो.
  3. इमेजिंग से पहले लगभग 1 घंटा, LysoTracker साथ लाल DND-99 (Invitrogen, सीए) 20 मिलीलीटर RPMI के 1.5 μl पतला. 10% FBS और 1% एंटीबायोटिक दवाओं युक्त. चयनित नमूने लिए आदि से युक्त समाधान का प्रयोग करें. डिग्री सेल्सियस से पहले संस्कृति डिश में जोड़ने के लिए 37 के लिए सभी मीडिया गर्म.
  4. RPMI 37 डिग्री सेल्सियस से कम 15-45 मिनट के लिए LysoTracker लाल DND -99 युक्त के साथ कोशिकाओं को सेते
  5. इमेजिंग से पहले लगभग 30 मिनट, WeatherStation पर्यावरण बाड़े पर बारी और 37 को संतुलित करने की अनुमति डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 (humidif साथआइईडी हवा).
  6. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और मानक RPMI केवल 10% FBS और 1% एंटीबायोटिक दवाओं युक्त के साथ मीडिया की जगह. संकेत के रूप में नमूने के आदि जोड़ें.
  7. माउंट 35 मिमी coverglass नीचे संस्कृति अनुकूलित अनुकूलक (प्रेसिजन, इंक, वाशिंगटन एप्लाइड) में बर्तन, और खुर्दबीन मंच पर स्थिति. 60X 1.42 एनए उद्देश्य लेंस पर विसर्जन के तेल (अपवर्तक सूचकांक 1.520) का उपयोग करें, और मंच पर घुड़सवार संस्कृति पकवान की स्थिति.

3. भाग 3: Deconvolution माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण

इस खंड में प्रोटोकॉल DeltaVision व्यक्तिगत डीवी deconvolution माइक्रोस्कोप और संबद्ध SoftWorX आवेदन सुइट (एप्लाइड प्रेसिजन, इंक, वाशिंगटन) का उपयोग हो जाती है.

  1. अधिग्रहण के कार्य केंद्र और साधन नियंत्रक सहित, माइक्रोस्कोप प्रणाली पर बारी. क्सीनन प्रकाश स्रोत पर खुर्दबीन मंच और बदले प्रारंभ करने में Resolve3D आवेदन खोलें. गर्म और स्थिर शर्तों तक पहुँचने के लिए प्रकाश स्रोत के लिए 10 मिनट की अनुमति दें.
  2. एक जोड़ेंविसर्जन के तेल की बूंद 60X 1.42 एनए उद्देश्य लेंस, और उद्देश्य लेंस पर केंद्र स्लाइड नमूना (नीचे कवर पर्ची चेहरा) पर (37 पर रहते नमूने लिए अपवर्तक सूचकांक 1.520 डिग्री सेल्सियस या आरटी पर निश्चित नमूने के लिए 1.516).
  3. विसर्जन के तेल का मनका उल्टे कवर कांच के साथ संपर्क में आता है जब तक या तो उज्ज्वल क्षेत्र या बाहरी रोशनी और मोटे ध्यान समायोजित घुंडी का प्रयोग, धीरे उद्देश्य लेंस बढ़ा. (इस बिंदु से, सेल परत ठीक ध्यान घुंडी समायोजित की कुछ बदल जाता है के भीतर ध्यान में आना चाहिए). स्लाइड पर तय नमूनों के साथ काम कर रहे हैं, यह बुलबुले के साथ किसी भी क्षेत्र के भीतर या आसपास की कोशिकाओं से बचने के लिए सिफारिश की है. गिलास नीचे पकवान पर रहते नमूनों के साथ देखते समय, कांच coverslip की सीमा के बाहर उद्देश्य लेंस बढ़ रहा से बचें.
  4. Autophagosomes EGFP संकेत (हरा) से पहचाना जा सकता है. लाइसोसोम LysoTracker लाल जी (नमूना) या विरोधी Lamp1 फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (निश्चित नमूना) से पहचाने जाते हैं. सेल नाभिक DAPI के सेंट द्वारा पहचाने जाते हैं(फिक्स्ड नमूना) aining.
  5. देखने के वांछित क्षेत्र का चयन करें. आदर्श रूप में, कोशिकाओं को सभी उचित चैनलों में अच्छा फ्लोरोसेंट संकेत प्रदर्शन करना चाहिए, और पर्याप्त जुड़ी और intracellular सामग्री कल्पना करने के लिए आसान कर रहे हैं ताकि coverslip सतह पर फैल गए. पार्श्व एक्स, वाई, जेड और फोकस में छोटे समायोजन Acquire3D इंटरफ़ेस का उपयोग कर कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. देखने के वांछित क्षेत्र (अधिक कोशिकाओं binning 2x2 करने के लिए सेट कर दिया जाता है, जब क्षेत्र में देखा जा सकता है) पर निर्भर करता है, 1x1 या 2x2 को binning सेट करें.
  6. एक सेल के midsection के माध्यम से एक दिया छवि के लिए, अधिकतम पिक्सेल तीव्रता 3000 की गिनती के अधिक नहीं है कि इस तरह के प्रदर्शन के मानकों (जैसे% संचरण शक्ति और जोखिम समय) की स्थापना की. आम तौर पर,% संचरण 1 सेकंड से अधिक इसी समय जोखिम उठाने के बिना संभव के रूप में कम के रूप में स्थापित किया जाना चाहिए. उच्चतम गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए imaged किया जा करने के लिए हर प्रतिदीप्ति रंग के लिए और देखने का एक अलग क्षेत्र के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
  7. यू सेटक्रमशः, सेल नमूना के ऊपर और नीचे से बस थोड़ा ध्यान समायोजन द्वारा Z-ढेर के pper और निचली सीमा. में छवियों की कुल संख्या एक जेड के ढेर को देखते हुए इस प्रकार इन सीमाओं से और परतों (: 0.2 माइक्रोन डिफ़ॉल्ट मान) के बीच अंतर रखने के द्वारा निर्धारित किया जाएगा.
  8. छवि अधिग्रहण के दौरान गति कलाकृतियों को कम करने के लिए, हम निश्चित नमूने के लिए "तो तरंगदैर्ध्य z ढेर", और "फिर z ढेर तरंगदैर्ध्य" जी नमूने के लिए करने के लिए छवि अधिग्रहण मोड स्थापित करने की सलाह देते हैं.
  9. प्रतिदीप्ति छवियों SoftWorX (एप्लाइड प्रेसिजन, समाधान) का उपयोग कर deconvolved और बाद में (Perkin एल्मर, एमए, अब Improvision) Volocity का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं.

4. भाग 4: सुपर संकल्प, संरचित रोशनी (OMX) माइक्रोस्कोपी

इस खंड में प्रोटोकॉल OMX संरचित प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग (एप्लाइड प्रेसिजन, WA) के लिए लागू होता है.

  1. मुख्य शक्ति और वांछित लेजर (410 एनएम, 488 एनएम, और / या 532 एनएम) पर स्विच करें. 20 मील के लिए इंतजारएन लेज़रों के लिए thermally स्थिर हो.
  2. 60X 1.42 एनए उद्देश्य लेंस पर विसर्जन के तेल (आरटी पर निश्चित नमूने लिए अपवर्तक सूचकांक 1.516) जोड़ें. बुलबुले तेल छोटी बूंद में देखा जाता है, उद्देश्य साफ है और फिर से तेल जोड़ें.
  3. मंच पर और यदि आवश्यक हो तो नमूना स्लाइड प्लेस, कोशिकाओं के लिए 10 मिनट coverslip पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  4. अधिग्रहण कार्यक्रम प्रारम्भ करें. सेल का एक तेज रूपरेखा देखा जा सकता है जब तक ध्यान समायोजित प्रतिदीप्ति रोशनी का उपयोग करें. (केयर वास्तविक छवि अधिग्रहण तक, प्रतिदीप्ति उत्तेजना को कोशिकाओं के जोखिम को कम करने के लिए हर समय लिया जाना चाहिए).
  5. एक सर्पिल मोज़ेक स्कैन ब्याज की कोशिकाओं या क्षेत्रों का चयन करने के लिए नमूना के बड़े क्षेत्रों का पूर्वावलोकन करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है. यह नमूना स्कैनिंग या लक्ष्य पाने जबकि कम जोखिम बार (1-10 मिसे) और कम उत्तेजना शक्ति (0.1-1% संचरण) का उपयोग करने की सिफारिश की है.
  6. GFP-LC3 प्रतिदीप्ति द्वारा autophagosomes पहचानें. एलेक्सा Fluor 555 विरोधी दीपक द्वारा लाइसोसोम पहचानें(लाइसोसोम जुड़े झिल्ली प्रोटीन) और DAPI (फिक्स्ड नमूने) का उपयोग सेल नाभिक.
  7. उत्तेजना तरंगदैर्ध्य, छवि क्षेत्र (जैसे 512x512), ढेर मोटाई, जोखिम समय, और लेजर संचरण प्रतिशत सहित प्रयोगात्मक शर्तों चुनें. सुपर हल छवियों के लिए, संरचित रोशनी विकल्प सक्षम है यह सुनिश्चित. OMX पर deconvolution माइक्रोस्कोपी के लिए, पारंपरिक रोशनी विकल्प का चयन करें.
  8. सबसे अच्छा पुनर्निर्माण परिणामों के लिए, अधिकतम तीव्रता गिनती अधिग्रहण के दौरान 10,000 के बीच और 15,000 है कि इस तरह की प्रयोगात्मक शर्तों का चयन करें. Photobleaching एक चिंता का विषय है, एक कम जोखिम (5,000 और 10,000 के बीच में गिना जाता है) पर इमेजिंग इस्तेमाल किया जा सकता है. आदर्श रूप में, मायने रखता है पूरे अधिग्रहण के दौरान दो का एक पहलू से भी अधिक कमी नहीं होनी चाहिए, और चार का एक पहलू से अधिक घटने से बचा जाना चाहिए. यदि आवश्यक हो, एक निरंतर तीव्रता गिनती सुनिश्चित करने के लिए ढेर मोटाई कम. कैमरे में तो अधिकतम, 64,000 मायने रखता है पर संतृप्तपरेशानी इस से अधिक नहीं होना चाहिए. अच्छा नमूने लिए, हम 1% लेजर ट्रांसमिशन के साथ 10 होने की प्रयोगात्मक शर्तों ~ 50 मिसे जोखिम समय मिला. बार बार imaged किया जा सकता है कि तेज और photostable नमूने पसंद कर रहे हैं. एक स्थिर दाग समय चूक, सुपर हल छवियों के लिए आवश्यक है.
  9. शोर, एक 95MHz readout गति (मध्यम गति विकल्प) और 2 मिसे या उससे अधिक के अधिग्रहण के समय को कम करने के लिए सिफारिश की है. बढ़ी हुई कलाकृतियों नमूना अधिग्रहण के दौरान चलता है जब खंगाला छवि में प्राप्त कर रहे हैं. इस असर के कारण, कम जोखिम गैर पक्षपाती या तेजी से बढ़ कोशिकाओं के लिए सिफारिश कर रहे हैं.
  10. मल्टीचैनल इमेजिंग एक साथ या क्रमिक रूप से किया जा सकता है. अनुक्रमिक मोड पैदावार कम पार से बात करते हैं और इस प्रकार की सिफारिश की है.
  11. Photobleaching को कम करने के लिए, यह आम तौर पर पहले लंबे समय तक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (तब 532 एनएम, 488 एनएम और 410 एनएम) के साथ छवि की सिफारिश की है. हालांकि, 3 चित्र में दिखाया प्रयोगात्मक परिणामों के लिए, इस आदेश रिवर्स थाइस विशेष नमूना के photostability के कारण घ (यानी 48 एनएम, 532 एनएम और 410 एनएम).
  12. कोशिकाओं के ऊपर / नीचे ध्यान से बाहर थोड़ा है जब तक खुर्दबीन मंच ले जाकर Z-ढेर के ऊपरी / निचली सीमा निर्धारित करें. पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर डिफ़ॉल्ट रूप में यह मान लेने के रूप में प्रत्येक छवि के बीच वांछित दूरी, सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए 0,125 मीटर पर स्थिर आयोजित किया जाना चाहिए.
  13. SoftWorX (एप्लाइड प्रेसिजन, समाधान) का उपयोग कर छवि के ढेर के पुनर्निर्माण और Volocity 6.0 (Perkin एल्मर, एमए) का उपयोग का विश्लेषण.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

चित्र 1 में दिखाया छवि अनुक्रम भोजी प्रेरण के पहले 80 मिनट के दौरान CWR22 कोशिकाओं में होने वाले शारीरिक परिवर्तनों को दर्शाता है. इस और अन्य अध्ययनों (नहीं दिखाया गया है) में हम लगातार मनाया: दूर सेल सेंटर से नाभिक (1) के विस्थापन, फोकल आसंजन अंक (2) में कमी, और के केंद्र की ओर autophagosomes और लाइसोसोम की (3) सामान्य स्थानान्तरण सेल. इसके अलावा, हम भी बाद में समय बिंदुओं पर autophagosomes (हरा) और लाइसोसोम (लाल) के बीच colocalization में एक छोटे से वृद्धि (पीले रंग में संकेत दिया), मनाया.

छवि आधारित cytometry के एक प्रदर्शन के रूप में, हम, की पहचान गिनती, और में दिखाया CWR22 कोशिकाओं की छवियों में लेबल autophagosomes और लाइसोसोम पर सांख्यिकीय आंकड़े एकत्र करने के लिए Volocity डिजिटल इमेजिंग आवेदन सुइट (संस्करण 6.0, Improvision / Perkin-एल्मर) का उपयोग किया चित्रा 1. चित्रा 2 में चार्ट से दिखाया गया है, टी की संख्या और आकारवह autophagosome (उनकी प्रारंभिक गठन और उपस्थिति के बाद) समय के साथ बदलती है: भोजी प्रेरण के 80 मिनट के बाद, autophagosomes की संख्या में एक क्रमिक लेकिन शुद्ध कमी (2A चित्रा) autophagosomes के औसत आकार में एक इसी वृद्धि के साथ वहां गया था ( चित्रा 2 बी). इसके अलावा, पियर्सन की सहसंबंध गुणांक विश्लेषण (चित्रा -2) पर आधारित autophagosomes और लाइसोसोम की colocalization में एक measureable वृद्धि हुई थी. साथ में, इन निष्कर्षों भोजी की उत्तेजना पर, कई छोटे autophagosomes समय के साथ बड़ा autophagosomes (चित्रा 2 डी) के रूप में फ्यूज का सुझाव दिया. आंकड़े 1 और 2 में केवल एक ही इमेजिंग अध्ययन के परिणाम परिलक्षित होता है, और अधिक कठोर मात्रात्मक विश्लेषण एक फर्म निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा, वहीं यह मात्रात्मक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की विशेषताएं और लाभ को वर्णन किया. हम सक्रिय रूप से कहां में इस तकनीक का प्रयोग कर रहे हैंआर सेलुलर भोजी के आणविक तंत्र और प्रक्रिया की जांच जारी है.

चित्रा 3A हासिल कर लिया और OMX माइक्रोस्कोप (दाएं) का उपयोग DV मोड (नकली widefield deconvolution, बाएं) बनाम संरचित रोशनी मोड में खंगाला छवियों का एक पक्ष द्वारा साइड तुलना से पता चलता है. पार्श्व संकल्प 120 तक एनएम, पारंपरिक विवर्तन सीमित माइक्रोस्कोपी 14,15 की दो बार संकल्प करने के लिए सुधार किया गया था. वे पारंपरिक प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ शायद ही स्पष्ट थे जबकि autophagosomes और लाइसोसोम (तीर द्वारा संकेत 3B चित्रा) के छोटे पैमाने पर colocalization, सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के साथ स्पष्ट रूप से स्पष्ट थे.

Deconvolution माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के लाभ में से एक अलग अणुओं के बीच और अधिक सटीक स्थानिक जानकारी से पता चलता है कि एक 3 डी मॉडल में सभी छवियों को फिर से संगठित है. मूवी 1 एक CWR22 Rv1 सेल undergoi की एक समग्र तस्वीर दिखाता हैबाद में समय बिंदु, जहां autophagosome और लाइसोसोम के बीच colocalization की महत्वपूर्ण राशि घटित करने के लिए शुरू में एनजी भोजी. ई cadherin धुंधला (के रूप में सफेद रंग में संकेत दिया) लक्ष्य सेल की रूपरेखा का पता चलता है. मूवी 2, 3 डी खंगाला मॉडल autophagosomes और लाइसोसोम (के रूप में पीले रंग में संकेत दिया) के बीच विलय की अधिक स्थानिक जानकारी प्रदान करता है. हम स्पष्ट रूप से हरी LC3 संकेतों और लाल lysosome संकेतों, और पीला संकेत के उत्पादन के लिए दो संकेतों के मर्ज के बीच बातचीत को देख सकते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. आदि के साथ इलाज CWR22 Rv1 कोशिकाओं के समय चूक छवियों. 80 मिनट के लिए आदि के साथ इलाज CWR22 Rv1 कोशिकाओं दिखा छवि अनुक्रम. (अधिकतम जेड प्रक्षेपण से मूल छवि के ढेर से प्राप्त 2 डी छवियों). कite के बिंदीदार रेखा सेल की रूपरेखा का प्रतिनिधित्व करता है, और प्रकाश छायांकित क्षेत्र नाभिक की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. सांख्यिकीय विश्लेषण. सांख्यिकीय प्रवृत्तियों छवि डेटा मात्रात्मक है कि एक प्रदर्शन के रूप में चित्र 1 में दिखाया छवि अनुक्रम का विश्लेषण करके निकाले गए थे. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. सेल. ए में autophagosome और लाइसोसोम वितरण शीर्ष) पक्ष द्वारा साइड अधिग्रहण और OMX माइक्रोस्कोप (दाएं) का उपयोग DV मोड (नकली widefield deconvolution, बाएं) और संरचित रोशनी मोड में खंगाला छवियों की तुलना. स्केल बार 5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है. बी नीचे) autophagosomes और लाइसोसोम (तीर द्वारा संकेत) के छोटे पैमाने पर colocalization.

मूवी 1 और 2 मूवी. CWR22 Rv1 सेल के दौर से गुजर भोजी के 3D पुनर्निर्माण. इस फिल्म आदि के इलाज के बाद एक सामान्य भोजी प्रेरण दिखाता है. जेड ढेर छवियों के एक 3 आयामी मॉडल में खंगाला गया. इस फिल्म सेल ° क्षैतिज और 360 ° खड़ी 360 घूर्णन द्वारा उत्पन्न किया गया था. ग्रीन सिग्नल LC3 का प्रतिनिधित्व करता है, लाल संकेत लाइसोसोम का प्रतिनिधित्व करता है, सफेद संकेत ई cadherin का प्रतिनिधित्व करता है, और नीले संकेत नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है. 1 मूवी देखने के लिए यहां क्लिक करें या= "_blank"> 2 मूवी देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LC3 के खिलाफ जांच फ्लोरोसेंट के साथ लेबल कोशिकाओं का प्रत्यक्ष अवलोकन व्यापक रूप autophagic प्रतिक्रिया 6, मात्रात्मक 3 डी में एक ही प्रणाली (हम कुछ किया है के रूप में) की इमेजिंग सेलुलर भोजी की जटिल प्रक्रिया के बारे में अभूतपूर्व जानकारी और विस्तार प्रदान करता है, पुष्टि करने के लिए एक मानक पद्धति के रूप में स्वीकार किया जाता है, जबकि . विशेष रूप से, हम जीवित कोशिकाओं में autophagosomes के सैकड़ों (यदि नहीं हजारों) भोजी प्रेरण के 80 मिनट के भीतर का गठन कर रहे हैं कि निरीक्षण करते हैं. इसी तरह, हम भोजी प्रेरण दौरान लाइसोसोमल डिब्बों के वितरण में बहुत ही रोचक रूपात्मक परिवर्तन देखने. एक दिया सेल के भीतर, autophagosome संख्या में कमी और समय के साथ उनकी औसत आकार में इसी वृद्धि, कि autophagosomes फार्म autolysosomes को लाइसोसोम के साथ संयोजन से पहले, एक दूसरे के साथ fusing से बड़ा बनने का सुझाव देते हैं. जीवित कोशिकाओं के उच्च संकल्प 3 डी प्रतिदीप्ति इमेजिंग autophagosomes एक महत्वपूर्ण आकार befor पहुँचना होगा कि क्या जांच करने के लिए सक्षम बनाता हैलाइसोसोम के साथ ई fusing, या भोजी एक छोटे शारीरिक आकार पर बस आगे बढ़ सकते हैं. दरअसल, अभी deconvolution माइक्रोस्कोप का संकल्प सीमा पर जल्दी सक्रियण पर दिखाई देते हैं कि बहुत छोटे autophagosomes की संख्या को देखते हुए और अधिक स्पष्ट रूप से OMX संरचित रोशनी खुर्दबीन 13 पर हल हो, यह मामला हो सकता है कि वास्तव में autophagic गतिविधि के थोक इस स्तर पर होता है.

एक दिया सेल में autophagosomes की संख्या और आकार में परिवर्तन सेल के लिए सेल से इन मानकों में बदलाव करने के लिए रिश्तेदार, छोटा हो सकता है के रूप में भोजी के दौरान जीवित कोशिकाओं की निगरानी करने की क्षमता गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है. हम पालन कि morphological परिवर्तन प्रयोगात्मक शर्तों, बजाय सांख्यिकीय विचरण के कारण कर रहे हैं कि अधिक कुछ किया जा सकता - समय पर एक भी, जीवित कोशिका अध्ययन करके.

अंत में, विशिष्ट आणविक मार्कर के साथ, हम अध्ययन करने के लिए इन इमेजिंग तकनीक लागू कर सकते हैंautophagosomes के शीघ्र गठन, autophagosomal झिल्ली के मूल का पता लगाने के लिए, और विशेष रूप से भोजी प्रेरण दौरान autophagosomes में फंसे किया गया है कि संभव organelles और / या intracellular घटकों की पहचान करने के लिए. हम भी इस दृष्टिकोण हमें सेल अस्तित्व और कोशिका मृत्यु में भोजी की भूमिका की जांच, और बेहतर क्षमता दवाओं और भोजी पर अवरोधकों के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए सक्षम हो जाएगा उम्मीद है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

अनुदान का समर्थन: एनआईएच CA165263, एनआईएच CA150197, एनआईएच CA150197S1 (एच.जे. कुंग), एनआईएच CA150197S1 (सीए Changou), Biophotonics विज्ञान और प्रौद्योगिकी (डीएल वोल्फसन, FYS चुआंग), डीओडी PC073420 (आरजे बोल्ड) के लिए NSF बनावट-0120999 सेंटर, रिसर्च नॉर्वे की परिषद, Leiv Eiriksson यात्रा अनुदान 209286/F11 (बी एस अहलूवालिया). एच.जे. कुंग भी कपिश समुदाय कैंसर बंदोबस्ती कोष का समर्थन मानता है. आरजे बोल्ड भी जे मैकडॉनल्ड्स बंदोबस्ती का समर्थन मानता है.

हम आदि की उदार आपूर्ति के लिए डॉ. जेनी वी जेन कुंग और DesigneRx में डॉ. बोर-वेन वू धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arginine Deiminase (ADI) DesigneRx
HEPES Sigma H4034
Casein Sigma C5890
Paraformaldehyde Fisher 4042
Saponin Sigma S4521
Alexa anti-mouse 555 Invitrogen A21422
Alexa anti-rabbit 647 Invitrogen A21244
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L7528
anti-Lamp1 DSHB H4A3
anti-Cadherin Cell Signaling #3195
SlowFade Gold Invitrogen S36936
35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate MatTek P35GC-1.5-1.4-C
No.1, 22 mm coverslip Corning #2865-22
Microscope slides Globe Scientific 1324G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69, (2), 700-708 (2009).
  2. Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
  3. Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
  4. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
  5. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  6. Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
  7. Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
  8. Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
  9. Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
  10. Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
  11. Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10, (6), 551-562 (2011).
  12. Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171, (3), 382-388 (2010).
  13. York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).
  14. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
  15. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8, (12), 1044-1046 (2011).
3D उन्नत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर भोजी के मात्रात्मक विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).More

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter