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Biology

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

doi: 10.3791/50047 Published: May 3, 2013

Summary

자식 작용은 세포가 단백질과 세포 소기관을 분해하고 재활용 할 수있는 유비쿼터스 프로세스입니다. 우리는 시각화하고 작은 정량화 고급 형광 현미경을 적용하지만, autolysosomes로 형성과 autophagosomes와 리소좀의 배포, 자신의 융합 등 자식 작용의 유도와 관련된 필수, 물리적 변화.

Abstract

수술은 발기 부전과 요실금의 중요한 위험을 수행하는 동안 전립선 암은 미국 남성들 사이 악성의 주요 형태이며, 기존의 화학 요법 방법은 대부분 실패했습니다. 호르몬 치료는 초기 단계에 효과적이지만, 종종 호르몬 불응 성 종양의 최종 개발에 실패합니다. 우리는 종양 세포의 특정 대사 결핍을 대상으로 치료제 개발에 관심이있다. 우리는 최근이 전립선 종양 세포는 특히 아미노산 아르기닌 (1)의 합성에 관여하는 효소 (argininosuccinate 합성 효소 또는 ASS)를 부족했다. 이 조건은 외생 아르기닌에 의존하는 종양 세포를 원인, 무료 아르기닌은 아르기닌 deiminase (ADI) 1,10가 고갈 될 때 신진 대사 스트레스를 겪는다. 사실, 우리는 인간의 전립선 암 세포 CWR22 RV1을 효과적으로 카스파 독립적 인 세포 사멸과 적극적인 autopha과 ADI에 의해 살해되는 것으로 나타났습니다GY (또는 macroautophagy) 1,2,3. 자식 작용은 세포가 4,5 영양 기아 동안 리소좀 고장에 의해 원치 않는 단백질을 대사 할 수 있도록 진화 - 보존 과정입니다. 이 통로의 필수 구성 요소가 6,7,8,9 잘 특성화되어 있지만, 분자 기계의 많은 부분은 여전히 불분명하다 - 특히 ADI의 치료 후 전립선 암 세포의 죽음 반응에 autophagy에의 역할을 무엇인가 ? 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 세포 자식 작용 반응의 수준과 범위를 측정하는 실험 방법을 필요 - 정확하게이 과정을 추적 할 수있는 알려진 분자 마커가 없기 때문에, 우리는 사용하여 영상 기반의 접근 방식을 개발하기로 결정했습니다 양적 3D 형광 현미경 11,12.

autophagosomes과 리소좀 형광 프로브를 구체적으로 표지 된 CWR22Rv1 세포를 사용하여, 우리는 3D 이미지 스택 위스콘신 중 하나에 인수 보여defield의 ​​디컨 볼 루션 현미경 (이상, 최고 해상도, 구조적 조명 현미경)은 명확하게 autophagy에 유도의 초기 단계를 캡처 할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 디지털 이미지 분석 응용 프로그램과 함께, 우리는 쉽게 autophagosome과 리소좀 수, 크기, 분포 및 이미지 한 셀에서 colocalization을 정도에 대한 통계 정보를 얻을 수 있습니다. 이 정보는 우리가 정확하게 살아있는 세포의 자식 작용의 진행 상황을 추적 할 수 및 암 화학 요법 autophagy에의 역할에 대한 지속적인 조사를 할 수 있습니다.

Protocol

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1. 1 부 : 세포 배양 및 면역 형광 라벨링

  1. 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 글루타민을 포함하는 RPMI (Mediatech, VA) 6 - 잘 접시에 배치 유리 coverslips는 (# 1.5 170 μm의 두께)에 CWR22 RV1 인간의 전립선 암 세포를 성장.
  2. 인산염 완충 식염수 (PBS)에있는 아르기닌 deiminase (ADI, 0.3 ㎍ / ㎖)를 선택한 샘플을 처리하여 autophagy를 유도.
  3. RT에서 10 분 동안, coverslip에 100 μL, PBS에 희석 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA, 피셔 과학, NH)로 세포를 고정합니다.
  4. 1 ML HBS / BSA와 배 세포를 씻으십시오.
  5. RT에서 15 분 HEPES (HBS) / BSA, coverslip에 100 μL, 0.05 %의 사포닌 (시그마, MO)로 세포를 Permeabilize.
  6. 이전 면역 라벨, HBS / BSA, coverslip에 100 μL, 2.5 % 카제인 (시그마, MO)와 실온에서 1 시간 동안 블록 샘플을합니다.
  7. 2.5 % 카제인 / HBS / BSA, coversl 당 100 ㎕의 희석 일차 항체 고정 된 세포를 배양4에서 IP, O / N ° C.
  8. 1 ML HBS / BSA와 배 세포를 씻으십시오.
  9. RT에서 1 시간 동안 2.5 % 카제인 / HBS / BSA, coverslip에 100 ㎕의 희석 차 항체 고정 된 세포를 품어.
  10. 1 ML HBS / BSA와 배 세포를 씻으십시오.
  11. SlowFade 골드와 일반 유리 현미경 슬라이드에 준비의 coverslips를 탑재, 4를 포함하는 골드 antifade 시약 (Invitrogen 사, CA) ',6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI)을 연장.
  12. 매니큐어와 씰 coverslip을 사용하면 가장자리. 최고의 이미징 결과를, 반대로 퇴색 미디어 시간 (이상적으로 O / N) 철저하게 세포를 침투 할 수 있습니다.
  13. 메탄올 및 / 또는 클로로포름 깨끗한 coverslip을 표면.
  14. 침수 오일 (굴절률 1.520 영상 37 ° C, 또는 1.516 RT에서 영상) 60X 1.42 NA 대물 렌즈 (올림푸스, 일본) 있습니다. 추가
  15. 위치 현미경 무대에 슬라이드와 관심의 세포로 포커스를 설정합니다.

2. 2 부 : 라이브 영상을위한 준비 세포

  1. CWR 성장35mm 폴리 - D - 라이신 코팅 유리 바닥 문화 요리 (MatTek, MA)에 10 % FBS와 1 % 항생제가 포함 된 RPMI 배양액에서 녹색 형광 단백질 결합 라이트 체인 3 (LC3-GFP)을 발현 22 RV1 세포. 세포는 빠르게 증식을 촉진하기에 충분한 밀도로 도금,하지만 너무 많은 세포가 자란 및 이미징의 시간에 응집 것을.해야한다
  2. PBS의 ADI (0.3 ㎍ / ㎖)을 선택한 셀 샘플을 처리합니다.
  3. 영상에 앞서 약 1 시간이 LysoTracker 레드 DND-99 (Invitrogen 사, CA) 20 ML RPMI의 1.5 μl를 희석. 10 % FBS와 1 % 항생제를 포함. 선택한 샘플에 대한 ADI를 포함하는 솔루션을 사용합니다. ° C 전에 배양 접시에 추가하기 37 모든 미디어를 따뜻하게.
  4. RPMI 37 ℃에서 15-45 분간 LysoTracker 레드 DND-99을 함유 세포를 배양
  5. 영상에 앞서 약 30 분, 웨더 환경 인클로저를 켜고 37 평형 할 수 있도록 ° C와 5 % CO 2 (humidif로처음 엔 공기).
  6. PBS로 세포를 씻어 표준 RPMI는 10 % FBS와 1 % 항생제가 포함 된 용지를 교체하십시오. 표시된대로 샘플 ADI를 추가합니다.
  7. 마운트 35mm는 커버 글라스 바닥 문화 정의 어댑터 (정밀, 주식, 워싱턴 적용)의 요리, 그리고 현미경 단계에 위치. 60X 1.42 NA의 대물 렌즈에 침수 오일 (굴절률 1.520)를 사용하고, 무대에 탑재 된 배양 접시를 놓습니다.

3. 제 3 부 : 디컨 볼 루션 현미경 및 분석

이 섹션의 프로토콜은 DeltaVision 개인 DV의 디컨 볼 루션 현미경 및 관련 SoftWorX 응용 프로그램 제품군 (응용 정밀, 주식 회사, WA)의 사용을 가정합니다.

  1. 취득 워크 스테이션과 악기 컨트롤러를 포함, 현미경 시스템을 켭니다. 크세논 광원에서 현미경 스테이지 및 회전을 초기화하는 Resolve3D 응용 프로그램을 엽니 다. 따뜻하게하고 안정 상태에 도달하는 광원 10 분을 허용합니다.
  2. 추가침수 기름의 드롭 60X 1.42 NA의 대물 렌즈와 대물 렌즈를 통해 센터 슬라이드 표본 (아래 커버 슬립 얼굴)에 (37 라이브 샘플에 대한 굴절률 1.520 ° C 또는 실온에서 고정 된 샘플 1.516).
  3. 침수 기름의 구슬 거꾸로 커버 유리와 접촉 할 때까지 두 시야 또는 외부 조명과 거친 초점 조절 노브를 사용하여, 천천히 대물 렌즈를 올립니다. (이 시점에서, 세포 층은 미세 초점 노브를 조정하는 몇 회전에서 초점이되어야합니다.) 슬라이드에 고정 된 샘플로 작업 할 때, 그것은 거품 모든 지역 내 또는 주변 세포를 방지하는 것이 좋습니다. 유리 바닥 접시에 살고 샘플 볼 때, 유리 coverslip에의 경계 외부의 대물 렌즈를 이동하지 마십시오.
  4. Autophagosomes은 EGFP 신호 (녹색)에 의해 식별 할 수 있습니다. 리소좀은 LysoTracker 레드 (실시간 샘플) 또는 방지 램프 1 형광 항체 (고정 샘플)에 의해 식별됩니다. 세포 핵은 DAPI 성으로 식별됩니다(고정 샘플) aining.
  5. 보기 원하는 필드를 선택합니다. 이상적으로, 세포가 적절한 모든 채널에서 좋은 형광 신호를 전시하며, 충분히 부착 세포 내용을 시각화하기 쉬운 수 있도록 coverslip을 표면에 확산. 측면 X, Y 및 Z 초점의 작은 조정은 Acquire3D 인터페이스를 사용하여 컴퓨터에 의해 제어 할 수 있습니다. 보기 원하는 필드 (더 많은 세포가 비닝 (binning)는 2 × 2로 설정되는 필드에서 볼 수있다)에 따라, 1X1 또는 2 × 비닝 (binning)을 설정합니다.
  6. 셀의 중앙부를 통해 지정된 이미지의 경우 최대 픽셀 강도는 3,000 수를 초과하지 않는 등 노출 매개 변수 (예 : % 전송 전력 및 노출 시간)을 설정합니다. 일반적으로, % 전송은 1 초에 해당하는 노출 시간을 발생시키지 않고, 가능한 한 낮게 설정해야합니다. 최고 품질의 이미지를 얻기 위해 이미지에 표시 할 모든 형광 색상 및보기의 각 개별 필드에 대해이 절차를 반복합니다.
  7. U를 설정각각의 세포 샘플의 상단과 하단에 단지 약간의 초점을 조절하여 Z-스택의 pper과 하한. 에서 이미지의 총 수는 Z-스택을 제공함으로써 이러한 제한에 의해 및 레이어 (0.2 μm의 기본값) 사이의 간격에 의해 결정됩니다.
  8. 이미지 수집 중에 모션 아티팩트를 최소화하기 위해, 우리는 고정 샘플 "그 파장 Z-스택"및 "다음에 z 스택 파장"라이브 샘플로 이미지 획득 모드를 설정하는 것이 좋습니다.
  9. 형광 이미지는 SoftWorX (응용​​ 정밀, WA)를 사용하여 deconvolved 이상 (퍼킨 엘머, MA 지금, 순발력) VoloCITY를 사용하여 분석됩니다.

4. 제 4 부 : 최고 해상도, 구조적 조명 (OMX) 현미경

이 섹션의 프로토콜은 OMX 구조적 조명 현미경의 사용 (응용 정밀, WA)에 적용됩니다.

  1. 주 전원 원하는 레이저 (410 nm의 488 nm의, 및 / 또는 532 nm의)에 전환합니다. 20 마일 기다립니다N 레이저 용 열 안정 수 있습니다.
  2. 60X 1.42 NA의 대물 렌즈에 침수 오일 (RT에서 고정 된 샘플에 대한 굴절률 1.516)를 추가합니다. 거품이 기름 방울을 볼 경우, 목표를 청소하고 다시 오일을 추가합니다.
  3. 무대에서하고 필요한 경우 샘플 슬라이드를 배치, 셀의 10 분은 coverslip을에 정착 할 수 있습니다.
  4. 취득 프로그램을 초기화합니다. 셀의 날카로운 윤곽을 볼 수있을 때까지 초점을 조절하는 형광 조명을 사용합니다. (관리는 실제 이미지 획득 할 때까지, 형광 여기에 세포의 노출을 최소화하기 위해 항상주의해야한다).
  5. 나선형 모자이크 스캔이 관심의 세포 나 지역을 선택하려면 샘플의 큰 영역을 미리 취득 할 수 있습니다. 이 샘플을 스캔 또는 대상을 찾는 동안 짧은 노출 시간 (1-10 밀리 초) 및 낮은 구동 전력 (0.1-1 % 전송)를 사용하는 것이 좋습니다.
  6. GFP-LC3의 형광에 의해 autophagosomes를 식별합니다. 알렉사 플 루어 555 안티 LAMP에 의해 리소좀을 식별(리소좀 - 관련 막 단백질)와 DAPI를 (고정 샘플)를 사용하여 세포 핵.
  7. 여기 파장, 이미지 영역 (예를 들어 512x512 크기) 스택의 두께, 노출 시간 및 레이저 전송 비율 등의 실험 조건을 선택합니다. 슈퍼 해결 이미지의 구조화 된 조명 옵션이 활성화되어 있는지 확인합니다. OMX의 디컨 볼 루션 현미경, 기존 조명 옵션을 선택합니다.
  8. 최고의 재건 결과, 최대 강도 계수가 획득 동안 10,000에서 15,000 명 사이가되도록 실험 조건을 선택합니다. photobleaching에이 문제가되는 경우, 낮은 노출 (5,000 ~ 10,000 사이의 카운트)의 이미지를 사용할 수 있습니다. 이상적으로, 수는 전체 수집 기간 동안 2 배 이상 감소하지 말아야하며, 네 배 이상에 의한 감소는 피해야한다. 필요한 경우, 지속적인 강도 수를 보장하기 위해 스택 두께를 줄일 수 있습니다. 카메라에 너무 최대 64,000 카운트에 포화긴장이를 초과해서는 안됩니다. 좋은 샘플을 위해, 우리는 1 % 레이저 전송을 10으로 실험 조건 ~ 50 밀리 초 노출 시간을 발견했다. 반복적으로 이미지화 할 수있는 밝고 photostable 샘플이 바람직하다. 안정 얼룩은 시간 경과, 슈퍼 해결할 이미지가 필요합니다.
  9. 소음, 95MHz 판독 속도 (중간 속도 옵션), 2 밀리 이상 획득 시간을 단축하는 것이 좋습니다. 증가 된 유물은 샘플 수집하는 동안 이동 재구성 군데에서 얻을 수 있습니다. 이 영향으로 인해, 짧은 노출은 비 부착 또는 빠르게 움직이는 세포를 권장합니다.
  10. 다중 채널 영상을 동시에 또는 순차적으로 수행 할 수 있습니다. Sequential (순차) 모드 수율 적은 크로스 토크 및 따라서 권장합니다.
  11. photobleaching에 줄이기 위해 일반적으로 첫 번째 이상 여기 파장 (다음 532 nm의 488 nm의 410 nm의)에 이미지를 권장합니다. 그러나 그림 3의 실험 결과,이 순서는 반대했다이 특정 샘플의 광 안정성으로 인해 D (즉, 48 nm의 532 nm의 410 nm의).
  12. 세포의 위 / 아래는 초점이 약간 때까지 현미경 스테이지를 이동하여 Z-스택의 상한 / 하한을 설정합니다. 복원 소프트웨어는 기본적으로이 값을 각 이미지 사이의 원하는 거리를, 최고 해상도 이미징을위한 0.125 μm의에서 일정하게 유지되어야한다.
  13. SoftWorX (응용​​ 정밀, WA)를 사용하여 이미지 스택을 재구성하고 VoloCITY 6.0 (퍼킨 엘머, MA)를 사용하여 분석 할 수 있습니다.

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Representative Results

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그림 1의 이미지 시퀀스는 autophagy에 유도의 첫 80 분 동안 CWR22 세포에서 발생하는 신체적 변화를 보여줍니다. 이것과 다른 연구 (미도시)에서 우리는 일관되게 관찰 : 거리 세포의 중심에서 핵 (1) 변위, 초점 접착 점 (2) 감소, 그리고의 중심을 향해 autophagosomes와 리소좀 (3) 일반 전좌 셀. 또한, 우리는 또한 나중에 지점에서 autophagosomes (녹색)와 리소좀 (적색) 사이 colocalization을의 작은 증가 (노란색으로 표시), 관찰했다.

이미지 기반 세포 계측법의 데모로, 우리는 식별 카운트와 같이 CWR22 세포의 이미지에 표시된 autophagosomes과 리소좀에 대한 통계 데이터를 수집하는 VoloCITY 디지털 이미징 응용 프로그램 제품군 (버전 6.0, 순발력 / 퍼킨 - 엘머)를 사용 그림 1. 그림 2의 차트에서와 같이, T의 수와 크기그는 autophagosome은 (초기 형성과 모양 이후) 시간에 따라 달라집니다 않습니다 autophagy를 유도 80 분 후, autophagosomes의 수가 점진적이지만 순 감소 (그림 2A) autophagosomes의 평균 크기에 상응하는 증가가 있었다 ( 그림 2B). 또한, 피어슨의 상관 계수 분석 (그림 2C)에 따라 autophagosomes와 리소좀의 colocalization을에서 측정 가능한 증가가 있었다. 함께, 이러한 연구 결과는 autophagy에의 자극에, 수많은 작은 autophagosomes 시간이 지남에 큰 autophagosomes (그림 2D)를 형성 융합하는 것이 좋습니다. 그림 1과 2는 하나의 이미징 연구의 결과를 반영하고,보다 엄격한 정량 분석은 확고한 결론을 그리는 데 필요한 것입니다 있지만, 그것은 양적 형광 현미경의 기능과 장점을 설명했다. 우리가 적극적으로 OU에서이 기술을 사용하는연구는 세포 자식 작용의 분자 메커니즘과 프로세스의 조사를 계속.

그림 3A는 인수 OMX 현미경 (오른쪽)를 사용하여 DV 모드 (시뮬레이션 위드 디컨 볼 루션, 왼쪽) 대 구조화 조명 모드에서 복원 이미지의 나란히 비교를 보여줍니다. 측면 해상도는 최대 120 nm의, 기존의 회절 현미경 14,15 배의 해상도로 개선되었다. 그들은 기존의 형광 이미징 거의 분명했다 반면 autophagosomes와 리소좀 (화살표로 표시된 그림 3B)의 소규모 colocalization을은 초 고해상도 현미경을 명확하게 분명했다.

디컨 볼 루션 현미경을 사용의 장점 중 하나는 다른 분자들 사이의보다 정확한 공간 정보를 공개 할 3D 모델에 모든 이미지를 재구성하는 것입니다. 영화 1 CWR22 RV1 세포 undergoi의 전체적인 그림을 보여줍니다나중에 포인트 autophagosome와 리소좀 사이 colocalization을 상당한 금액이 발생하기 시작에서 겨 자식 작용. E-cadherin의 염색은 (같은 흰 색 표시) 대상 셀의 윤곽을 보여준다. 영화 2, 3D 복원 모델은 autophagosomes와 리소좀 (같은 노란색으로 표시) 사이의 융합의 더 많은 공간 세부 사항을 제공합니다. 우리는 명확하게 녹색 LC3 신호와 빨간색 리소좀 신호 및 노란색 신호를 생성하는 두 신호의 병합 사이의 상호 작용을 볼 수 있습니다.

그림 1
그림 1. ADI 치료 CWR22 RV1 세포의 시간 경과 이미지. 80 분 ADI 치료 CWR22 RV1 세포를 보여주는 이미지 시퀀스. (최대 Z 프로젝션으로 원본 이미지 스택에서 얻은 2D 이미지). WHITE 점선은 세포의 윤곽을 나타내며, 빛의 음영 지역은 핵의 위치를​​ 나타냅니다.

그림 2
그림 2. 통계 분석. 통계 동향은 이미지 데이터를 정량화 할 수있는 것을 시범으로 그림 1의 이미지 시퀀스를 분석하여 추출 하였다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. 셀. A.에서 Autophagosome과 리소좀 배포 맨) 사이드 바이 사이드 인수 OMX 현미경 (오른쪽)를 사용하여 DV 모드 (시뮬레이션 위드 디컨 볼 루션, 왼쪽)와 구조화 조명 모드에서 복원 영상의 비교. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. B.는 아래) autophagosomes와 리소좀 (화살표로 표시)의 소규모 colocalization을.

동영상 1 동영상 2. CWR22 RV1 세포 겪고 자식 작용의 3 차원 재구성.이 영화는 ADI의 치료 후 정상 autophagy를 유도를 보여줍니다. Z-스택 이미지는 3 차원 모델로 재구성 하였다. 이 영화는 세포 °, 수평 360 ° 수직 360 회전에 의해 생성 된. 녹색 신호가 LC3 대표, 빨간 신호가 리소좀 대표, 흰색 신호는 E-cadherin의를 나타내며, 파란색 신호는 핵을 나타냅니다. 영화 1 보려면 여기를 클릭하십시오 또는= "_blank"> 영화 2를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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LC3에 대한 형광 프로브로 표시된 세포의 직접 관찰이 널리 자식 작용 반응 6, 양적 3D 동일한 시스템 (우리가했던 것처럼)의 영상 세포 자식 작용의 복잡한 과정에 대해 전례없는 정보와 세부 정보를 제공합니다 확인하는 표준 방법으로 인정되고 있지만 . 특히, 우리는 살아있는 세포에있는 autophagosomes의 수백 (수천하지 않을 경우) autophagy를 유도 80 분 내에 형성되는 것을 관찰합니다. 마찬가지로, 우리는 autophagy에 유도시 리소좀 구획의 분포에서 매우 흥미로운 형태 학적 변화를 관찰한다. 주어진 셀 내, autophagosome 수의 감소와 시간에 자신의 평균 크기의 해당 증가, 그 autophagosomes는 폼 autolysosomes에 리소좀과 결합하기 전에, 서로 융합하여 더 큰 성장을하는 것이 좋습니다. 살아있는 세포의 고해상도 3D 형광 이미징 autophagosomes가 중요한 크기 befor를 도달해야하는지 여부를 조사하기 위해 우리를있게리소좀과 전자 융합, 또는 autophagy에 더 작은 물리적 크기에서 간단하게 진행할 수 있는지 여부. 사실, 그냥 디컨 볼 루션 현미경의 해상도 한계에 이른 활성화에 나타나는 아주 작은 autophagosomes의 수를 주어진, 그리고 훨씬 더 명확하게 OMX 구조적 조명 현미경 13 해결, 그것은 사건이 될 수 있다는 사실은 자식 작용 활동의 대부분 이 수준에서 발생합니다.

특정 셀에 autophagosomes의 수와 크기의 변화가 세포에 세포에서 이러한 매개 변수의 변화에​​ 상대적으로 작은 수 있듯이 자식 작용의 과정에서 살아있는 세포를 모니터링하는 능력은 매우 중요합니다. 우리는 우리가 관찰하는 형태 변화 실험 조건보다는 통계적 분산에 의한 것을 더 확신 할 수 있습니다 - 시간의 경과에 하나의 살아있는 세포를 연구함으로써.

마지막으로, 특정 분자 마커, 우리는 공부를 위해 이러한 이미징 기술을 적용 할 수 있습니다autophagosomes의 초기 형성 autophagosomal 세포막의 기원을 추적하고, 특히 autophagy를 유도하는 동안 autophagosomes에 잠겼 것일 수도 소기관 및 / 또는 세포 내 구성 요소를 식별 할 수 있습니다. 우리는 또한이 방법은 우리가 세포 생존과 세포 죽음에 자식 작용의 역할을 조사, 그리고 더 나은 잠재적 인 약물과 자식 작용에 대한 억제의 효과를 특성화 할 수 있기를 바랍니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

보조금 지원 : NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ 쿵), NIH CA150197S1 (CA Changou), 바이오 포토닉스 과학 & 기술 (DL 울프슨, FYS 추앙), DOD PC073420 (RJ 굵게)에 대한 NSF PHY-0120999 센터, 연구 노르웨이 의회, Leiv 에릭손 여행 그랜트 209286/F11 (BS Ahluwalia는). HJ 쿵푸는 오번 커뮤니티 암 기부 기금의 지원을 인정합니다. RJ 굵은는 J. 맥도날드 기부금의 지원을 인정합니다.

우리는 ADI의 관대 한 공급 박사 제니 웨이 - 젠 쿵푸와 DesigneRx 박사 보르 - 원자바오 우 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arginine Deiminase (ADI) DesigneRx
HEPES Sigma H4034
Casein Sigma C5890
Paraformaldehyde Fisher 4042
Saponin Sigma S4521
Alexa anti-mouse 555 Invitrogen A21422
Alexa anti-rabbit 647 Invitrogen A21244
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L7528
anti-Lamp1 DSHB H4A3
anti-Cadherin Cell Signaling #3195
SlowFade Gold Invitrogen S36936
35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate MatTek P35GC-1.5-1.4-C
No.1, 22 mm coverslip Corning #2865-22
Microscope slides Globe Scientific 1324G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석
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Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).More

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).

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