Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ analyse av Autophagy med Avansert 3D fluorescens mikroskopi

doi: 10.3791/50047 Published: May 3, 2013

Summary

Autophagy er en allestedsnærværende prosess som gjør det mulig for cellene å fornedre og resirkulere proteiner og organeller. Vi bruker avansert fluorescens mikroskop for å visualisere og kvantifisere den lille, men viktige, fysiske endringer knyttet til induksjon av autophagy, herunder dannelse og distribusjon av autophagosomes og lysosomer, og de blander inn autolysosomes.

Abstract

Prostatakreft er den ledende formen for kreftsykdom blant menn i USA Mens operasjoner innebærer en betydelig risiko for impotens og inkontinens, har tradisjonelle kjemoterapeutiske tilnærminger i stor grad vært mislykket. Hormonbehandling er effektiv på et tidlig stadium, men ofte mislykkes med eventuell utvikling av hormon-ildfaste svulster. Vi har vært interessert i å utvikle behandlingsformer rettet mot spesifikke metabolske mangel av kreftceller. Vi har nylig vist at prostata tumorceller spesifikt mangler et enzym (argininosuccinate syntase, eller ASS) som er involvert i syntesen av aminosyren arginin 1.. Denne tilstanden fører til at kreftceller til å bli avhengig av eksogene arginin, og de ​​gjennomgår metabolsk stress når fri arginin er oppbrukt av arginin deiminase (ADI) 1,10. Vi har faktisk vist at menneskelige prostata kreft celler CWR22 RV1 er effektivt drept av ADI med kaspase-uavhengig apoptose og aggressiv autophagy (eller macroautophagy) 1,2,3. Autophagy er et evolusjonært bevart prosess som gjør at cellene til å forbrenne uønskede proteiner ved lysosomale sammenbrudd under ernæringsmessige sult 4,5. Selv om de grunnleggende komponentene i denne veien er godt karakterisert 6,7,8,9, mange aspekter av den molekylære mekanismen er fortsatt uklart - spesielt hva er rollen til autophagy i døden respons av prostata kreft celler etter ADI behandling ? For å løse dette spørsmålet, må vi en eksperimentell metode for å måle nivået og omfanget av autophagic respons i celler - og siden det er ingen kjente molekylære markører som kan nøyaktig spore denne prosessen, valgte vi å utvikle en avbildning tilnærming, ved hjelp kvantitativ 3D fluorescensmikroskopi 11,12.

Ved hjelp CWR22Rv1 celler spesifikt-merket med fluorescerende prober for autophagosomes og lysosomer, viser vi at 3D bildestakker kjøpt med enten widefield deconvolution mikroskopi (og senere, med super-oppløsning, strukturert-belysning mikroskopi) kan tydelig fange de tidlige stadiene av autophagy induksjon. Med kommersielt tilgjengelige digitale bildeanalyse applikasjoner, kan vi lett få statistisk informasjon om autophagosome og lysosome antall, størrelse, distribusjon, og graden av colocalization fra noen avbildes celle. Denne informasjonen gir oss mulighet til nettopp spore fremdriften av autophagy i levende celler og gjør vår fortsatte etterforskning i rollen som autophagy i kreft kjemoterapi.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En. Del 1: Cell Culture and Immuno-fluorescerende merking

  1. Dyrk CWR22 RV1 humane prostata tumorceller på glass dekkglass (# 1,5 eller 170 mikrometer tykkelse) plassert i 6-brønners plater med RPMI (Mediatech, VA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin / glutamin.
  2. Induser autophagy ved å behandle utvalgte prøver med arginin deiminase (ADI, 0,3 ug / ml) i fosfat-bufret saltvann (PBS).
  3. Fix celler med 4% paraformaldehyd (PFA, Fisher Scientific, NH) fortynnet i PBS, 100 pl pr dekkglass, i 10 min ved RT.
  4. Vask cellene 3x med 1 ml HBS / BSA.
  5. Permeabilize cellene med 0,05% saponin (Sigma, MO) i HEPES (HBS) / BSA, 100 ul pr dekkglass, i 15 min ved RT.
  6. Før immun-merking, blokk prøver med 2,5% kasein (Sigma, MO) i HBS / BSA, 100 ul pr dekkglass, i 1 time ved RT.
  7. Inkuber faste celler med primære antistoffer fortynnet i 2,5% kasein / HBS / BSA, 100 mL per coverslip, O / N ved 4 ° C.
  8. Vask cellene 3x med 1 ml HBS / BSA.
  9. Inkuber faste celler med sekundære antistoffer fortynnet i 2,5% kasein / HBS / BSA, 100 ul pr dekkglass, i 1 time ved RT.
  10. Vask cellene 3x med 1 ml HBS / BSA.
  11. Monter preparerte Dekkglass på vanlige glass objektglass med SlowFade Gold eller forlenge Gold antifade reagens (Invitrogen, CA) som inneholder 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  12. Seal dekkglass kantene med neglelakk. For best tenkelig resultat, gi tid (helst O / N) for anti-fade media til grundig gjennomsyre celler.
  13. Ren dekkglass overflate med metanol og / eller kloroform.
  14. Legg nedsenking olje (brytningsindeks 1,520 når avbildning ved 37 ° C, eller 1,516 når avbildning ved RT) til 60X 1.42 NA objektivlinse (Olympus, Japan).
  15. Posisjon lysbilde på mikroskopet scenen og etablere fokus med cellene av interesse.

2. Del 2: Forberede Cells for Live Imaging

  1. Grow CWR22 RV1 celler uttrykker grønt fluorescerende protein-koblet Lett Chain 3 (LC3-GFP) i RPMI kultur media inneholder 10% FBS og 1% antibiotika på 35 mm poly-d-lysin belagt med glassbunn kultur retter (Mattek, MA). Cellene skal være belagt med tilstrekkelig tetthet til rette for rask spredning, men ikke så mye at cellene er overgrodd og klumpet seg ved tidspunktet for bildebehandling.
  2. Unn utvalgte celleprøver med ADI (0,3 mikrogram / ml) i PBS.
  3. Omtrent en time før bildebehandling, fortynne 1,5 mL av LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) med 20 ml RPMI. inneholdende 10% FBS og 1% antibiotika. Bruk løsninger som inneholder ADI for utvalgte prøver. Varm alle medier til 37 ° C før du legger inn i kulturen fatet.
  4. Inkuber cellene med RPMI inneholder LysoTracker Red DND-99 for 15-45 min ved 37 ° C.
  5. Ca 30 min før bildebehandling, slå på Værstasjon miljømessige kabinett og la til stabilisering til 37 ° C og 5% CO 2 (med humidifIED luft).
  6. Vask cellene med PBS og erstatte media med standard RPMI inneholder bare 10% FBS og 1% antibiotika. Legg ADI til prøvene som angitt.
  7. Mount 35 mm coverglass-bottom kultur retter i tilpasset adapter (Applied Precision, Inc., WA), og posisjon på mikroskopet scenen. Bruk immersjonsolje (brytningsindeks 1.520) på 60X 1,42 NA objektiv, og plassere den montert kultur tallerken på scenen.

3. Del 3: deconvolution mikroskopi og analyse

Protokollen i dette avsnittet forutsettes bruk av DeltaVision Personlig DV deconvolution mikroskop og tilhørende SoftWorX søknad suite (Applied Precision, Inc., WA).

  1. Slå på mikroskop system, inklusive kjøp arbeidsstasjon og instrument kontrolleren. Åpne Resolve3D program å starte mikroskopet scenen og slå på xenon lyskilde. Tillat 10 min for lyskilde for å varme opp og komme stabile forhold.
  2. Legg endråpe nedsenking olje (brytningsindeks 1.520 for live prøver ved 37 ° C eller 1.516 for faste prøver ved RT) på 60X 1,42 NA objektiv, og senter lysbilde prøven (cover slip forsiden ned) over objektiv.
  3. Ved hjelp av enten lys-felt eller ekstern belysning og den grove justere fokus knott, sakte heve objektivlinsen inntil vulsten av nedsenking olje kommer i kontakt med den inverterte dekkglass. (Fra dette punktet, bør celleskiktet komme i fokus i løpet av noen svinger av den fine fokusen justere knott). Når du arbeider med faste prøver på lysbildene, anbefales det å unngå celler innenfor eller nær noen områder med bobler. Når du viser med live prøver på glassbunn fatet, unngå å flytte objektiv utenfor grensen av glass dekkglass.
  4. Autophagosomes kan identifiseres ved eGFP signal (grønn). Lysosomer er identifisert av LysoTracker Red (live prøve) eller anti-Lamp1 fluorescerende antistoff (fast utvalg). Cellekjernene er identifisert av DAPI staining (fast utvalg).
  5. Velg ønsket synsfelt. Ideelt sett bør cellene oppviser god fluorescerende signal på alle de aktuelle kanaler, og tilstrekkelig festet og spredt ut på dekkglass underlag slik at de intracellulære innholdet er lett å visualisere. Små justeringer i laterale x, y og z-fokus kan kontrolleres av datamaskinen ved hjelp av Acquire3D grensesnitt. Sett binning til 1x1 eller 2x2, avhengig av ønskede synsfelt (flere celler kan ses i feltet når binning er satt til 2x2).
  6. For et gitt bilde gjennom midsection av en celle, setter eksponeringsparametre (f.eks% sendeeffekt og eksponeringstid) slik at den maksimale pikselintensiteten ikke overstiger 3000 teller. Vanligvis bør% transmisjon settes så lavt som mulig, uten å øke den tilsvarende eksponeringstid enn 1 sekund. Gjenta denne prosedyren for hver fluorescens fargen som skal avbildes, og for hver enkelt synsfelt for å få bilder av høyeste kvalitet.
  7. Sett upper og nedre grenser på Z-stabel, ved å justere fokus bare litt over toppen og bunnen av cellen prøven hhv. Det totale antall bilder i en gitt Z-stabel vil således være bestemt av disse rammer og avstanden mellom lagene (standardverdi: 0,2 mikrometer).
  8. For å minimere bevegelsesfeil under bildet oppkjøpet, anbefaler vi å sette bildeinnlastingen modus til "bølgelengde deretter z-stack" for faste prøver, og "z-stack så bølgelengde" for live prøver.
  9. Fluorescens bilder er dekonvolveres hjelp SoftWorX (Applied Precision, Washington) og senere analysert ved hjelp VoloCITY (Improvision, nå Perkin Elmer, MA).

4. Del 4: Super-oppløsning, Structured-belysning (OMX) Mikroskopi

Protokollen i denne delen gjelder for bruk av OMX Strukturert Illumination mikroskop (Applied Precision, WA).

  1. Slå på strømmen og ønsket lasere (410 nm, 488 nm, og / eller 532 nm). Vent på 20 kmn for lasere til å bli termisk stabilisert.
  2. Legg immersjonsolje (brytningsindeks 1,516 for faste prøver ved RT) på 60X 1,42 NA objektiv. Hvis boblene er sett i oljen dråpe, rengjøre objektiv og tilsett olje igjen.
  3. Plasser prøven lysbilde på scenen og om nødvendig, la 10 min for cellene å bosette seg på dekkglass.
  4. Initialiser oppkjøpet programmet. Bruk fluorescens-belysning for å justere fokuseringen inntil en skarp omriss av cellen kan sees. (Forsiktighet bør utvises til enhver tid for å minimere eksponering av celler til fluorescenseksitasjon, før det faktiske bildet oppkjøpet).
  5. En spiral mosaikk skanningen kan bli kjøpt opp for å forhåndsvise større deler av prøven for å velge celler eller områder av interesse. Det anbefales å bruke korte eksponeringstider (1-10 ms) og lav magnetiseringseffekten (0,1-1% transmisjon) under skanning prøven eller finne mål.
  6. Identifiser autophagosomes av GFP-LC3 fluorescens. Identifiser lysosomes av Alexa Fluor 555 anti-LAMP(Lysosome-assosiert membran protein) og cellekjerner med DAPI (faste prøver).
  7. Velg eksperimentelle forhold, inkludert eksitasjonsbølgelengde, image område (f.eks 512x512), stack tykkelse, eksponeringstid, og laser overføring prosentandel. For super løst bilder, sørge for at strukturert belysning alternativet er aktivert. For deconvolution mikroskopi på OMX, velg den konvensjonelle belysning alternativet.
  8. For de beste gjenoppbygging resultatet, velger eksperimentelle forhold slik at maksimal intensitet teller er mellom 10 000 og 15 000 i løpet av oppkjøpet. Hvis fotobleking er et problem, kan bildebehandling til en lavere eksponering (teller mellom 5.000 og 10.000) brukes. Ideelt sett bør de tellinger som ikke synker mer enn en faktor på to i løpet av hele kjøpet, og reduseres med mer enn en faktor på fire bør unngås. Hvis nødvendig, reduseres stabelen tykkelse for å sikre en vedvarende intensitet teller. Kameraet mettet fett på 64.000 teller, så maksimalt itensity bør aldri overstige dette. For gode eksempler, fant vi de eksperimentelle forhold til å være 10 ~ 50 ms eksponeringstid med 1% laser overføring. Lyse og photostable prøver som kan avbildes gjentatte ganger foretrekkes. En stabil flekken er nødvendig for time-lapse, super løst bilder.
  9. For å redusere støy, en 95MHz Utlesningshastigheten (Medium speed alternativet) og oppkjøpet tid på 2 ms eller mer anbefales. Økte gjenstander er oppnådd i den rekonstruerte avbildes, når prøven beveger seg i løpet av oppkjøpet. På grunn av dette innvirkning, er korte eksponeringer anbefales for ikke-heftende eller raske celler.
  10. Flerkanals avbildning kan utføres samtidig eller sekvensielt. Sekvensiell modus gir mindre krysstale og er derfor anbefalt.
  11. For å redusere photobleaching, er det generelt anbefales til bilde med lengre eksitasjonsbølgelengdene først (532 nm, 488 nm, og deretter 410 nm). Men for de eksperimentelle resultatene vist i figur 3, var denne rekkefølgen omvendtD (48 nm, 532 nm og 410 nm) på grunn av den fotostabilitet av denne spesielle prøven.
  12. Sett den øvre / nedre grense for Z-stack ved å flytte mikroskopet scenen til toppen / bunnen av cellene er litt ute av fokus. I ønsket avstand mellom hvert bilde skal holdes konstant på 0,125 mikrometer for super oppløsning bildebehandling, som gjenoppbygging programvaren ta denne verdien som standard.
  13. Rekonstruere bildestakker hjelp SoftWorX (Applied Precision, Washington) og analysere ved hjelp VoloCITY 6,0 (Perkin Elmer, MA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bildet vist på figur 1 viser de fysiske endringene som finner sted i CWR22 celler i løpet av første 80 min av autophagy induksjon. I denne og andre undersøkelser (ikke vist) gjennomgående observerte vi: (1) forskyvning av kjernen vekk fra cellens sentrum, (2) reduksjon av fokale punkter adhesjon, og (3) generelt translokasjon av autophagosomes og lysosomer mot midten av den celle. I tillegg har vi også observert en liten økning i colocalization (markert med gul farge) mellom autophagosomes (grønn) og lysosomer (rød), på senere tidspunkter.

Som en demonstrasjon av image-basert cytometry, vi brukte VoloCITY digital bildebehandling søknad suite (versjon 6.0, Improvision / Perkin-Elmer) for å identifisere, telle, og samle statistiske data på merket autophagosomes og lysosomer i bilder av CWR22 cellene vist i Figur 1. Som det fremgår av diagrammene i figur 2, antallet og størrelsen av than autophagosome (etter deres første dannelse og utseende) gjør varierer med tiden: etter 80 min av autophagy induksjon, var det en gradvis, men netto nedgang i antall autophagosomes (Figur 2A) med en tilsvarende økning i den gjennomsnittlige størrelsen på autophagosomes ( figur 2B). I tillegg var det en målbar økning i colocalization av autophagosomes og lysosomer, basert på Pearson korrelasjonskoeffisient analyse (figur 2C). Sammen tyder disse funnene at ved stimulering av autofagi, mange små autophagosomes smelter sammen til større autophagosomes over tid (figur 2D). Selv om figurene 1 og 2 reflektert resultatene av bare en enkelt avbildning studie, og mer rigorøs kvantitativ analyse vil være nødvendig for å trekke en fast konklusjon, har det illustrere trekk og fordeler ved kvantitativ fluorescens mikroskopi. Vi er aktivt bruker denne teknikken i our fortsetter etterforskningen av den molekylære mekanismen og prosessen med mobilnettet autofagi.

Figur 3A viser en side-by-side-sammenligning av bilder kjøpt og rekonstruert i DV-modus (simulert widefield deconvolution, til venstre) vs strukturert-belysning modus ved hjelp av OMX mikroskop (til høyre). Lateral oppløsning ble forbedret til opptil 120 nm, dobbelt oppløsning av konvensjonelle diffraksjon-begrenset mikroskopi 14,15. Småskala colocalization av autophagosomes og lysosomer (Figur 3B, angitt med piler) var klart tydelig med super-oppløsning mikroskopi, mens de var knapt tydelig med konvensjonelle fluorescens bildebehandling.

En av fordelene med å bruke deconvolution Mikroskopi er å rekonstruere alle bildene inn i en 3D-modell som vil avsløre mer nøyaktig romlig informasjon mellom ulike molekyler. Movie 1 viser et samlet bilde av en CWR22 RV1 celle undergoing autofagi på senere tidspunkt, hvor betydelig mengde colocalization mellom autophagosome og lysosome begynner å skje. E-Cadherin flekker (som angitt i hvit farge) viser omrisset av målcellen. I Movie 2, gir 3D rekonstruerte modellen mer romlige detaljer om fusjon mellom autophagosomes og lysosomer (som angitt i gul farge). Vi kan tydelig se samspillet mellom grønne LC3 signaler og røde Lysosom signaler, og flettingen av de to signaler å produsere gule signaler.

Figur 1
Figur 1. Time-Lapse bilder av CWR22 RV1 celler behandlet med ADI. Bildesekvens viser CWR22 RV1 celler behandlet med ADI for 80 min. (2D-bilder hentet fra originale bildestakker ved maksimal Z projeksjon). Den white stiplede linje representerer omrisset av cellen, og den lys-mørke feltet representerer posisjonen til kjernen.

Figur 2
Figur 2. Statistisk analyse. Statistiske trender ble hentet ved å analysere bildet rekkefølgen som er vist i figur 1 som en demonstrasjon på at bildedataene er kvantifiserbare. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Autophagosome og lysosome distribusjon i cellen. A. Top) Side-by-side sammenligning av bilder kjøpt og rekonstruert i DV-modus (simulert widefield deconvolution, til venstre) og strukturert-belysning modus ved hjelp av OMX mikroskop (til høyre). Skalalinje representerer 5 mikrometer. B. Bottom) Småskala colocalization av autophagosomes og lysosomer (markert med piler).

Movie 1 og Movie 2. 3D Rekonstruksjon av CWR22 RV1 Cell Gjennomgår Autophagy. Denne filmen illustrerer en normal autophagy induksjon etter ADI behandling. Z-Stack bildene ble rekonstruert i en 3-dimensjonal modell. Denne filmen ble generert ved å rotere celle 360 ​​° horisontalt og 360 ° vertikalt. Grønt signal representerer LC3, representerer rødt signal lysosome, representerer hvitt signal E-Cadherin og blått signal representerer kjernen. Klikk her for å se film en eller= "_blank"> Klikk her for å vise Movie 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mens direkte observasjon av celler merket med fluorescerende prober mot LC3 er allment akseptert som en standard metode for å bekrefte autophagic respons 6, kvantitative 3D avbildning av det samme systemet (som vi har gjort) gir enestående informasjon og detaljer om den komplekse prosessen med mobilnettet autophagy . Spesielt ser vi at hundrevis (om ikke tusenvis) av autophagosomes i levende celler dannes innenfor 80 min av autophagy induksjon. Tilsvarende ser vi svært interessante morfologiske endringer i fordelingen av lysosomale avdelinger under autophagy induksjon. Innenfor en gitt celle, nedgangen i autophagosome nummer og tilsvarende økning i gjennomsnittlig størrelse over tid, foreslår vokse som autophagosomes større ved å fusjonere med hverandre, før du kombinere med lysosomer å danne autolysosomes. Høyoppløselig 3D fluorescens avbildning av levende celler gjør oss i stand til å undersøke om autophagosomes må nå en kritisk størrelse before fiksering med lysosomer, eller om autofagi kan forløpe bare i en mindre fysisk størrelse. Faktisk, gitt antall svært små autophagosomes som vises ved tidlig aktivering bare på oppløsning grensen for deconvolution mikroskop, og mye mer tydelig løst på OMX strukturert-belysning mikroskop 13, kan det være slik at mesteparten av autophagic aktivitet faktisk skjer på dette nivået.

Evnen til å overvåke levende celler i løpet av autophagy er kritisk viktig, ettersom endringer i antall og størrelse av autophagosomes i en gitt celle kan være liten, i forhold til variasjonene av disse parametrene fra celle til celle. Ved å studere et enkelt, levende celle over tid - vi kan være mer sikker på at de morfologiske endringene som vi observerer skyldes eksperimentelle forhold, snarere enn statistisk varians.

Til slutt, med spesifikke molekylære markører, kan vi bruke disse imaging teknikker for å studeretidlig dannelse av autophagosomes, for å spore opprinnelsen til de autophagosomal membraner, og til å identifisere mulige organeller og / eller intracellulære komponenter som er spesielt oppslukt i autophagosomes under autophagy induksjon. Vi håper også at denne tilnærmingen vil gjøre oss i stand til å undersøke rolle autophagy i celle-overlevelse og celledød, og bedre karakterisere effektene av potensielle legemidler og hemmere på autofagi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Grant støtte: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Center for Biophotonics Science & Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Fet), Forskningsrådet Råd Norge, Leiv Eiriksson reisestipend 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung erkjenner også støtte fra Auburn Fellesskapet Cancer Endowment Fund. RJ Fet erkjenner også støtte av J. McDonald begavelse.

Vi takker Dr. Jenny Wei-Jen Kung og Dr. Bor-wen Wu på DesigneRx for sjenerøs tilførsel av ADI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arginine Deiminase (ADI) DesigneRx
HEPES Sigma H4034
Casein Sigma C5890
Paraformaldehyde Fisher 4042
Saponin Sigma S4521
Alexa anti-mouse 555 Invitrogen A21422
Alexa anti-rabbit 647 Invitrogen A21244
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L7528
anti-Lamp1 DSHB H4A3
anti-Cadherin Cell Signaling #3195
SlowFade Gold Invitrogen S36936
35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate MatTek P35GC-1.5-1.4-C
No.1, 22 mm coverslip Corning #2865-22
Microscope slides Globe Scientific 1324G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69, (2), 700-708 (2009).
  2. Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
  3. Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
  4. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
  5. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  6. Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
  7. Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
  8. Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
  9. Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
  10. Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
  11. Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10, (6), 551-562 (2011).
  12. Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171, (3), 382-388 (2010).
  13. York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).
  14. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
  15. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8, (12), 1044-1046 (2011).
Kvantitativ analyse av Autophagy med Avansert 3D fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).More

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter