Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ analys av Autophagy med Advanced 3D Fluorescensmikroskopi

doi: 10.3791/50047 Published: May 3, 2013

Summary

Autophagy är en allestädes närvarande process som gör det möjligt för celler att brytas ned och återvinna proteiner och organeller. Vi tillämpar avancerad fluorescens mikroskopi för att visualisera och kvantifiera små, men viktiga, fysiska förändringar i samband med framkallande av autophagy, däribland bildandet och distribution av autophagosomes och lysosomer, och deras fusion i autolysosomes.

Abstract

Prostatacancer är den ledande formen av maligniteter bland män i USA Medan operation medför en betydande risk för impotens och inkontinens, har traditionella kemoterapeutiska metoder tappat målet. Hormonbehandling är effektiv på tidigt stadium, men ofta misslyckas med en eventuell utveckling av hormonrefraktär tumörer. Vi har varit intresserade av att utveckla läkemedel som riktar sig specifikt metabolisk brist på tumörceller. Vi visade nyligen att prostatatumörceller specifikt saknar ett enzym (argininosuccinat syntas eller ASS) involverade i syntesen av aminosyran arginin 1. Detta tillstånd orsakar tumörcellerna att bli beroende av exogen arginin, och de genomgår metabolisk stress då fri arginin är uttömda av arginindeiminas (ADI) 1,10. Vi har faktiskt visat att humana prostatacancerceller CWR22 RV1 effektivt dödas av ADI med kaspas-oberoende apoptos och aggressiv autophagy (eller macroautophagy) 1,2,3. Autophagy är en evolutionärt bevarad process som gör att celler att metabolisera oönskade proteiner genom lysosomal nedbrytning under näringsmässiga svält 4,5. Även de viktigaste komponenterna i denna väg är väl karaktäriserade 6,7,8,9, många aspekter av den molekylära mekanismen är fortfarande oklar - i synnerhet, vad är rollen av autophagy i döden-respons av prostatacancerceller efter ADI behandling ? För att ta itu med denna fråga, krävs vi en experimentell metod för att mäta nivån och omfattningen av autophagic respons i celler - och eftersom det inte finns några kända molekylära markörer som exakt kan spåra denna process, valde vi att utveckla en avbildning synsätt, med kvantitativ 3D fluorescensmikroskopi 11,12.

Använda CWR22Rv1 celler specifikt märkta med fluorescerande prober för autophagosomes och lysosomer, visar vi att 3D bildstaplar förvärvats med antingen widefield deconvolution mikroskopi (och senare, med super-upplösning, strukturerad-belysning mikroskopi) kan tydligt fånga de tidiga stadierna av autophagy induktion. Med kommersiellt tillgängliga digitala applikationer bildanalys, kan vi få lätt statistisk information om autophagosome och lysosome antal, storlek, fördelning, och graden av colocalization från någon avbildade cell. Denna information ger oss möjlighet att exakt följa utvecklingen av autophagy i levande celler och möjliggör vår fortsatta utredning in i rollen av autophagy i cancer kemoterapi.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ett. Del 1: Cell Culture och Immuno-fluorescensmärkning

  1. Grow CWR22 RV1 humana prostatatumörceller på glas täckglas (# 1,5 eller 170 | im tjocklek) placerades i 6-brunnars plattor, med RPMI (Mediatech, VA) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin / glutamin.
  2. Framkalla autophagy genom att behandla utvalda proverna med arginindeiminas (ADI, 0,3 | ig / ml) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  3. Fix celler med 4% paraformaldehyd (PFA, Fisher Scientific, NH) utspädd i PBS, 100 | il per täckglas, för 10 min vid rumstemperatur.
  4. Tvätta cellerna 3x med 1 ml HBS / BSA.
  5. Permeabilisera celler med 0,05% saponin (Sigma, MO) i HEPES (HBS) / BSA, 100 | il per täckglas, under 15 min vid RT.
  6. Före immuno-märkning, blockera prover med 2,5% kasein (Sigma, MO) i HBS / BSA, 100 | il per täckglas, för 1 h vid RT.
  7. Inkubera fixerade celler med primära antikroppar utspädda i 2,5% kasein / HBS / BSA, 100 l per coverslip, O / N vid 4 ° C.
  8. Tvätta cellerna 3x med 1 ml HBS / BSA.
  9. Inkubera fixerade celler med sekundära antikroppar utspädda i 2,5% kasein / HBS / BSA, 100 | il per täckglas, under 1 timme vid RT.
  10. Tvätta cellerna 3x med 1 ml HBS / BSA.
  11. Montera förberedda täckglas på regelbundna diabilder glasmikroskop med SlowFade Guld eller förlänga Gold antifade reagens (Invitrogen, CA) innehållande 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  12. Seal täckglas kanterna med nagellack. För bästa bildåtergivning resultat, ge tid (helst O / N) för anti-fade media att grundligt tränga celler.
  13. Rengör täckglas yta med metanol och / eller kloroform.
  14. Lägg immersionsolja (brytningsindex 1.520 när imaging vid 37 ° C, eller 1.516 när imaging vid RT) till 60X 1,42 NA objektiv (Olympus, Japan).
  15. Placera bilden på mikroskop scenen och skapa fokus med cellerna av intresse.

2. Del 2: Förbereda Celler för Live avbildning

  1. Grow CWR22 RV1 celler som uttrycker grönt fluorescerande protein-coupled lätt kedja 3 (LC3-GFP) i RPMI odlingsmedium innehållande 10% FBS och 1% antibiotika på 35 mm poly-D-lysinbelagda glasbottnade odlingsskålar (MatTek, MA). Celler bör vara klädd på tillräcklig täthet för att underlätta en snabb spridning, men inte så mycket att cellerna är överväxt och clumped vid tiden för avbildning.
  2. Behandla valda cellprover med ADI (0,3 | ig / ml) i PBS.
  3. Cirka 1 timme före avbildning, späd 1,5 pl Lysotracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) med 20 ml RPMI. innehållande 10% FBS och 1% antibiotika. Använd lösningar innehållande ADI för utvalda prover. Värm alla medier till 37 ° C före tillsats till kulturen skålen.
  4. Inkubera cellerna med RPMI innehållande Lysotracker Red DND-99 för 15 till 45 minuter vid 37 ° C.
  5. Cirka 30 min före avbildning, slå på väderstation miljö inneslutningen och låt jämvikt till 37 ° C och 5% CO 2 (med humidified luft).
  6. Tvätta cellerna med PBS och ersätta media med standard RPMI innehållande endast 10% FBS och 1% antibiotika. Lägg ADI proverna som anges.
  7. Mount 35 mm coverglass-botten kultur rätter i anpassad adapter (Applied Precision, Inc., WA), och position på mikroskop scenen. Använd immersionsolja (brytningsindex 1.520) på 60X 1,42 NA objektiv, och placera den monterade kulturen skålen på scenen.

Tre. Del 3: Deconvolution mikroskopi och analys

Protokollet i detta avsnitt förutsätter användning av DeltaVision Personal DV deconvolution mikroskop och tillhörande Softworx Application Suite (Applied Precision, Inc., WA).

  1. Slå på mikroskop systemet, inklusive förvärv arbetsstation och instrument controller. Öppna Resolve3D ansökan att initiera mikroskop scenen och slå på xenonljuskälla. Tillåt 10 minuter för ljuskälla för att värma upp och nå stabila förhållanden.
  2. Lägg ettdroppe immersionsolja (brytningsindex 1,520 för levande prover vid 37 ° C eller 1,516 för fasta prover vid RT) på 60X 1,42 NA objektivlins, och center slide prov (täckglas med framsidan nedåt) över objektivlinsen.
  3. Med antingen ljusa fält eller yttre belysning och den grova fokus justera ratten, sakta höja objektivlinsen tills vulsten av immersionsolja kommer i kontakt med den inverterade täckglaset. (Från denna punkt, bör cellagret kommit i fokus inom några varv på den fina fokus justera ratten). När du arbetar med fasta prover på bilderna, är det rekommenderat att undvika celler inom eller i närheten av några områden med bubblor. Vid visning med levande prover på glas nedre skålen, undvik att flytta objektivet utanför gränsen av glaset täckglas.
  4. Autophagosomes kan identifieras genom eGFP signal (grön). Lysosomes identifieras genom Lysotracker Röd (levande prov) eller anti-Lamp1 fluorescerande antikropp (fast prov). Cellkärnor identifieras genom DAPI staining (fast prov).
  5. Välj önskat synfält. Helst bör celler uppvisar god fluorescerande signal i alla lämpliga kanaler, och tillräckligt fast och sprids ut på täckglas ytan så att de intracellulära innehållet är lätt att visualisera. Små justeringar i sidled x, y och z-inriktning kan styras av datorn med Acquire3D gränssnittet. Ställ binning till 1x1 eller 2x2, beroende på önskat synfält (fler celler kan ses i fältet när binning är satt till 2x2).
  6. För en given bild genom mittsektionen av en cell, ställa in exponering parametrar (t.ex.% sändareffekt och exponeringstid) så att den maximala pixelintensiteten inte överskrider 3000 räknas. Generellt bör% transmission sättas så lågt som möjligt, utan att höja motsvarande exponeringstiden under 1 sek. Upprepa denna procedur för varje fluorescens färg som ska avbildas och för varje separat synfält för att få bilder med högsta kvalitet.
  7. Ställ upper och undre gränser för Z-stacken genom att justera fokus bara något över toppen och bottnen av cellen provet, respektive. Det totala antalet bilder i en given Z-stack kommer således att bestämmas av dessa gränser och av avståndet mellan skikten (standardvärde: 0,2 ^ m).
  8. För att minimera rörelseartefakter under bildtagning, rekommenderar vi att läget bildtagning till "våglängd då z-stack" för fasta prover och "z-stack då våglängden" för levande prov.
  9. Fluorescence bilder är avfaltade använder Softworx (Applied Precision, WA) och analyserades senare med hjälp Volocity (Improvision, nu Perkin Elmer, MA).

4. Del 4: Super-upplösning, Structured-belysning (OMX) Mikroskopi

Protokollet i detta avsnitt gäller användningen av OMX Structured Illumination mikroskop (Applied Precision, WA).

  1. Slå på huvudströmbrytaren och önskade laser (410 nm, 488 nm, och / eller 532 nm). Vänta 20 kmn för laser för att bli termiskt stabiliseras.
  2. Lägg immersionsolja (brytningsindex 1.516 för fasta prover vid RT) på 60X 1,42 NA objektiv. Om bubblor syns i oljan droppen, rengör objektiv och tillsätt oljan igen.
  3. Placera provet glida på scenen och vid behov tillåta 10 min för celler att bosätta sig på täckglas.
  4. Initiera förvärvet programmet. Använd fluorescensbelysning att justera fokus tills en skarp kontur av cellen kan ses. (Försiktighet bör iakttas vid alla tillfällen för att minimera exponering av celler för fluorescens excitation, tills den verkliga bilden förvärvet).
  5. En spiral mosaik scan kan förvärvas för att förhandsgranska större områden av provet för att välja celler eller områden av intresse. Det rekommenderas att använda korta exponeringstider (1-10 ms) och låg excitation effekt (0,1-1% transmission) när du skannar provet eller hitta mål.
  6. Identifiera autophagosomes av GFP-LC3 fluorescens. Identifiera lysosomer av Alexa Fluor 555 anti-LAMP(Lysosom-associerade membran protein) och cellkärnor med DAPI (fasta prover).
  7. Välj experimentella förhållanden inklusive exciteringsvåglängd, bildyta (t.ex. 512x512), stack tjocklek, exponeringstid, och laser överföring procent. För super upplösta bilder, se till att den strukturerade belysningen alternativet är aktiverat. För avfaltning mikroskopi på OMX väljer den konventionella belysningen alternativet.
  8. För bästa återuppbyggnad resultat väljer experimentella betingelser så att maximal intensitet räkna är mellan 10.000 och 15.000 under förvärvet. Om fotoblekning är ett bekymmer, kan avbildning på en lägre exponering (räknas mellan 5.000 och 10.000) användas. Helst ska de räknas minskar inte mer än en faktor två under hela förvärvet, och minskar med mer än en faktor fyra bör undvikas. Om det behövs, reducera stacken tjocklek för att säkerställa en hållbar intensitet räknas. Kameran mättas vid 64.000 punkter, så maximalt iintensiteten bör aldrig överstiga detta. För bra prover, hittade vi de experimentella förutsättningar att vara 10 ~ 50 ms exponeringstid med 1% laser transmission. Ljusa och fotostabila prover som kan avbildas upprepade gånger föredras. En stabil fläcken krävs för time-lapse, löst super bilder.
  9. För att minska bullret, en 95MHz avläsning hastighet (Medium speed tillval) och förvärv tid på 2 millisekunder eller mer rekommenderas. Ökade artefakter erhålls i den rekonstruerade avbildade, då provet rör sig under förvärvet. På grund av denna effekt, är korta exponeringar rekommenderas för icke-vidhäftande eller snabbrörliga celler.
  10. Multichannel avbildning kan utföras samtidigt eller sekventiellt. Sekvensdrift ger mindre överhörning och rekommenderas därför.
  11. För att minska fotoblekning, är det i allmänhet rekommenderas att bilden med längre exciteringsvåglängder först (532 nm, 488 nm, och sedan 410 nm). Men för de experimentella resultat som visas i figur 3, var denna ordning omvändd (dvs. 48 nm, 532 nm och 410 nm) på grund av fotostabiliteten av denna särskilda prov.
  12. Ställ den övre / undre gräns för Z-stacken genom att flytta mikroskop scenen tills toppen / botten av cellerna är något ur fokus. Den önskade avståndet mellan varje bild ska hållas konstant vid 0,125 um för superupplösning avbildning, eftersom återuppbyggnaden programvara tar detta värde som standard.
  13. Reconstruct bildstaplar använder Softworx (Applied Precision, WA) och analysera med hjälp Volocity 6,0 (Perkin Elmer, MA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bilden som visas i figur 1 visar de fysiska förändringar som sker i CWR22-celler under den första 80 min av autophagy induktion. I denna och andra studier (ej visad) vi observerade genomgående: (1) förskjutning av kärnan bort från cellens centrum, (2) reduktion av fokala vidhäftning punkter, och (3) allmänna translokering av autophagosomes och lysosomer mot centrum av den cell. Dessutom noterade vi också en liten ökning av colocalization (anges i gult) mellan autophagosomes (grön) och lysosomer (röd), vid senare tidpunkter.

Som en demonstration av bildbaserad cytometry, använde vi Volocity digital bildbehandling Application Suite (version 6.0, Improvision / Perkin-Elmer) för att identifiera, räkna och samla in statistiska uppgifter om märkta autophagosomes och lysosomer i bilderna av de CWR22 cellerna som visas i Figur 1. Som framgår av diagrammen i figur 2, antal och storlek på than autophagosome (efter deras initiala bildning och utseende) inte varierar med tiden: efter 80 min av autophagy induktion fanns det en gradvis men nettominskning av antalet autophagosomes (Figur 2A) med en motsvarande ökning av den genomsnittliga storleken på de autophagosomes ( Figur 2B). Dessutom fanns det en mätbar ökning av colocalization av autophagosomes och lysosomer, baserat på Pearsons Korrelationskoefficient analys (figur 2C). Tillsammans föreslog dessa fynd som vid stimulering av autophagy, många små autophagosomes säkring för att bilda större autophagosomes över tid (Figur 2D). Medan figurerna 1 och 2 återspeglade resultaten av bara en enda imaging study, och mer rigorös kvantitativ analys behövs för att dra någon säker slutsats, gjorde det illustrera funktionerna och fördelarna med kvantitativ fluorescensmikroskopi. Vi arbetar aktivt med den här tekniken i our fortsatt utredning av den molekylära mekanismen och processen av cellulära autophagy.

Figur 3A visar en sida-vid-sida jämförelse av bilder som förvärvats och rekonstrueras i DV mod (simulerad Vidvinkel avfaltning, vänster) vs strukturerad-belysning läge med hjälp av OMX mikroskop (höger). Sidoupplösning förbättrades till upp till 120 nm, dubbelt så hög upplösning av konventionella diffraktionsbegränsad mikroskopi 14,15. Småskalig colocalization av autophagosomes och lysosomer (Figur 3B, anges med pilar) var tydligt med super-upplösning mikroskopi, medan de var knappast uppenbart med konventionell fluorescens avbildning.

En av fördelarna med att använda Deconvolution mikroskopi är att rekonstruera alla bilder i en 3D-modell som kommer att avslöja mer exakt geografisk information mellan olika molekyler. Movie 1 visar en helhetsbild av en CWR22 RV1 cell undergoing autophagy vid senare tidpunkt, där betydande mängd colocalization mellan autophagosome och lysosome börjar uppstå. E-Cadherin färgning (såsom anges i vit färg) avslöjar konturerna av målcellen. I Movie 2, ger 3D-rekonstruerade modellen mer rumsliga detaljer om fusion mellan autophagosomes och lysosomer (såsom anges i gul färg). Vi kan tydligt se samspelet mellan gröna LC3 signaler och röda lysosome signaler och sammanslagningen av de två signalerna att producera gula signaler.

Figur 1
Figur 1. Time-lapse bilder av CWR22 RV1 celler behandlade med ADI. Bildsekvens visar CWR22 RV1 celler som behandlats med ADI för 80 min. (2D-bilder som erhållits från original bildstaplar av maximal Z projektion). WHite streckade linjen representerar konturen av cellen, och ljuset-skuggade området representerar läget av kärnan.

Figur 2
Figur 2. Statistisk analys. Statistisk utveckling extraherades genom att analysera bilden som visas i figur 1 som en demonstration att bilddata är kvantifierbart. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3
Figur 3. Autophagosome och lysosom fördelning i cellen. A. Topp) sida vid sida jämförelse av bilder som förvärvats och rekonstrueras i DV mod (simulerad Vidvinkel avfaltning, vänster) och strukturerad-belysning läge med hjälp av OMX mikroskop (höger). Skala stapel representerar 5 pm. B. Bottom) Småskalig colocalization av autophagosomes och lysosomer (indikeras med pilar).

Film 1 och Film 2. 3D-rekonstruktion av CWR22 RV1 Cell Genomgår Autophagy. Denna film visar en normal autophagy induktion efter ADI behandling. Z-Stack bilder rekonstruerades in i en 3-dimensionell modell. Denna film genererades genom att vrida cellen 360 ° horisontellt och 360 ° vertikalt. Grön signal representerar LC3 representerar röd signal lysosomen, representerar vitt signal E-Cadherin och blå signalen representerar kärnan. Klicka här för att se film 1 eller= "_blank"> Klicka här för att se film 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Medan den direkta observationen av celler märkta med fluorescerande prober mot LC3 är allmänt accepterat som en standardmetod för att bekräfta autophagic svar 6, kvantitativ 3D avbildning av samma system (som vi har gjort) ger oöverträffad information och detaljer om den komplexa processen av cellulära autophagy . Framför allt märker vi att hundratals (om inte tusentals) av autophagosomes i levande celler bildas inom 80 min av autophagy induktion. Likaså ser vi mycket intressanta morfologiska förändringar i fördelningen av lysosomala fack under autophagy induktion. Inom en given cell, minskningen i autophagosome numret och den motsvarande ökningen av deras genomsnittliga storlek över tid, tyder på att autophagosomes växa sig större genom sammansmältning med varandra, innan de kombineras med lysosomer att bilda autolysosomes. Högupplöst 3D fluorescens avbildning av levande celler ger oss möjlighet att undersöka om autophagosomes måste nå en kritisk storlek before sammansmältning med lysosomer, eller om autophagy kan gå helt enkelt på en mindre fysisk storlek. Med tanke på att antalet mycket små autophagosomes som visas vid tidig aktivering precis vid upplösningen gränsen för deconvolution mikroskop, och mycket tydligare lösas på OMX strukturerade-belysning mikroskop 13, kan det vara så att den största delen av autophagic aktivitet faktiskt På denna nivå.

Förmågan att övervaka levande celler under loppet av autophagy är kritiskt viktiga, eftersom ändringarna i antalet och storleken av autophagosomes i en given cell kan vara små, i förhållande till variationer av dessa parametrar från cell till cell. Genom att studera en enda levande cell över tiden - vi kan vara mer säkra på att de morfologiska förändringar som vi ser beror på experimentella förhållanden, snarare än statistisk varians.

Slutligen, med specifika molekylära markörer, kan vi tillämpa dessa avbildningstekniker för att studeratidiga bildandet av autophagosomes, att spåra ursprunget för autophagosomal membranen, och att identifiera möjliga organeller och / eller intracellulära komponenter som särskilt har uppslukade i autophagosomes under autophagy induktion. Vi hoppas också att detta tillvägagångssätt kommer att göra det möjligt för oss att undersöka rollen av autophagy i cell-överlevnad och celldöd, och bättre karakterisera effekterna av potentiella läkemedel och hämmare på autophagy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Grant stöd: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0.120.999 Centrum för Biophotonics Science & Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ fet), The Research Norges, Leiv Eiriksson Travel Grant 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung erkänner också stöd från Auburn Community Cancer Donationsfond. RJ Bold erkänner också stöd av J. McDonald kapitalförsäkring.

Vi tackar Dr Jenny Wei-Jen Kung och Dr Bor-wen Wu vid DesigneRx för generöst utbud av ADI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arginine Deiminase (ADI) DesigneRx
HEPES Sigma H4034
Casein Sigma C5890
Paraformaldehyde Fisher 4042
Saponin Sigma S4521
Alexa anti-mouse 555 Invitrogen A21422
Alexa anti-rabbit 647 Invitrogen A21244
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L7528
anti-Lamp1 DSHB H4A3
anti-Cadherin Cell Signaling #3195
SlowFade Gold Invitrogen S36936
35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate MatTek P35GC-1.5-1.4-C
No.1, 22 mm coverslip Corning #2865-22
Microscope slides Globe Scientific 1324G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69, (2), 700-708 (2009).
  2. Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
  3. Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
  4. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
  5. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  6. Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
  7. Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
  8. Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
  9. Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
  10. Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
  11. Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10, (6), 551-562 (2011).
  12. Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171, (3), 382-388 (2010).
  13. York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).
  14. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
  15. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8, (12), 1044-1046 (2011).
Kvantitativ analys av Autophagy med Advanced 3D Fluorescensmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).More

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter