Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

doi: 10.3791/50047 Published: May 3, 2013

Summary

Otofaji hücreler protein ve organellerin aşağılamak ve geri dönüşüm sağlayan her yerde bulunan bir süreçtir. Biz görselleştirmek ve küçük ölçmek için gelişmiş floresan mikroskop geçerli, ama autolysosomes içine oluşumu ve autophagosomes ve lizozomlar dağılımı, ve füzyon da dahil olmak üzere otofaji indüksiyon ile ilgili temel, fiziksel değişiklikler,.

Abstract

Cerrahi iktidarsızlık ve inkontinans önemli bir risk taşır iken Prostat kanseri ABD'de erkekler arasında malignite önde gelen biçimidir, geleneksel kemoterapötik yaklaşımların büyük ölçüde başarısız olmuştur. Hormon tedavisi erken bir aşamada etkilidir, ancak genellikle hormon dirençli tümörlerin nihai gelişimi ile başarısız olur. Biz tümör hücrelerinin belirli metabolik eksikliği hedefleyen tedavi gelişmekte ilgi var. Yakın zamanda bu prostat tümör hücrelerinin, özellikle amino asit arginin 1 sentezinde yer alan bir enzim (argininosükinat sintaz veya ASS) eksikliği göstermiştir. Bu durum dışsal arjinin bağımlı hale için tümör hücrelerinin neden olur, ve ücretsiz arjinin arjinin deiminaz (ADI) 1,10 ile bittiği zaman metabolik stres tabi. Gerçekten de, insan prostat kanseri hücrelerinde CWR22 RV1 etkili kaspaz-bağımsız apoptoz ve agresif autopha ile ADI tarafından öldürüldü olduğunu göstermiştirgy (veya macroautophagy) 1,2,3. Otofaji hücreleri 4,5 beslenme açlık sırasında lizozomal arıza istenmeyen proteinleri metabolize sağlayan bir evrimsel-korunmuş bir süreçtir. Bu yolun temel bileşenleri 6,7,8,9 iyi karakterize olmasına rağmen, moleküler mekanizmasının birçok açıdan hala belirsiz - özellikle, ADI tedavi sonrası prostat kanseri hücrelerinin ölümüne-yanıt olarak otofaji rolü nedir ? Bu soruya cevap verebilmek için, biz hücrelerinde otofajik cevap düzeyi ve kapsamı ölçmek için deneysel bir yöntem gerekli - ve doğru bu süreci takip edebilirsiniz bilinen bir moleküler işaretleri olduğu için, biz kullanarak, bir görüntüleme-temelli bir yaklaşım geliştirmek için seçti nicel 3D floresan mikroskobu 11,12.

Autophagosomes ve lizozomlar için floresan problar ile özel etiketli CWR22Rv1 hücreleri kullanarak, 3D görüntü yığınlarının wi ya ile elde olduğunu göstermektedirdefield deconvolution mikroskobu (ve daha sonra, süper çözünürlük, yapılandırılmış-aydınlatma mikroskobu ile) açıkça otofaji indüksiyon erken aşamalarında yakalayabilir. Piyasada bulunan dijital görüntü analizi uygulamaları ile, kolayca autophagosome ve lizozom sayısı, boyutu, dağılımı ve herhangi bir görüntülü hücreden ko derecesi hakkında istatistiksel bilgi alabilirsiniz. Bu bilgiler tam olarak canlı hücrelerin içinde otofaji ilerleme izlemenize olanak sağlayan ve kanser kemoterapi otofaji rolüne devam eden soruşturma sağlar.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Bölüm 1: Hücre Kültürü ve Immuno-floresan Etiketleme

  1. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin / glutamin ihtiva eden RPMI (Mediatech, VA) ile 6-delikli plakalardaki yerleştirilen cam lamelleri (# 1.5 ve 170 mikron kalınlığında) ilgili RV1 CWR22 insan prostat tümörü hücrelerinin büyümesini.
  2. Fosfat tamponlu salin (PBS) arginin deiminaz (ADI, 0.3 ug / ml) ile muamele etmek suretiyle seçilmiş örnekler Otofaji neden olur.
  3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, lamel başına 100 ul; PBS ile seyreltilerek% 4 paraformaldehit (PFA, Fisher Scientific, NH) ile hücreleri saptamak.
  4. 1 mi HBS / BSA ile 3 kez hücreleri yıkayın.
  5. Oda sıcaklığında 15 dakika için HEPES (HBA) / BSA, lamel başına 100 ul,% 0.05 saponin (Sigma, MO) ile hücre geçirgenliği.
  6. Önceki immüno-etiketleme, sadece HBS / BSA, lamel başına 100 ul,% 2.5 kazein (Sigma, MO) ile, oda sıcaklığında 1 saat boyunca blok örnekler.
  7. % 2.5 kazein / HBS / BSA, coversl başına 100 ul seyreltilmiş primer antikorlar ile sabit hücreleri inkübe4 de ip, O / N ° C
  8. 1 mi HBS / BSA ile 3 kez hücreleri yıkayın.
  9. , Oda sıcaklığında, 1 saat boyunca,% 2.5 kazein / HBS / BSA, lamel başına 100 ul seyreltilmiş sekonder antikor ile sabit hücreler inkübe edin.
  10. 1 mi HBS / BSA ile 3 kez hücreleri yıkayın.
  11. Slowfade Altın düzenli cam mikroskop slaytlar hazırlanmış lamelleri monte veya 4 içeren Altın antifade reaktif (Invitrogen, CA) ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) uzatır.
  12. Oje ile Seal lamel kenarları. En iyi görüntüleme sonuçlar için, anti-solmaya medya için zaman (ideal O / N) iyice hücreleri girmesine izin verir.
  13. Metanol ve / veya kloroform ile temiz lamel yüzey.
  14. Immersiyon (kırılma indeksi 1.520 görüntüleme 37 ° C veya 1.516 oda sıcaklığında görüntüleme) 60X 1.42 NA objektif lens (Olympus, Japonya) için. Ekle
  15. Pozisyon mikroskop sahnede slayt ve ilgi hücreleri ile odak kurmak.

2. Bölüm 2: Canlı Görüntüleme için hazırlanması Hücreleri

  1. CWR büyütün35 mm poli-D-lisin kaplamalı cam-alt kültür kaplarına (Mattek, MA) üzerinde,% 10 FBS ve% 1 antibiyotik içeren RPMI kültür ortamı yeşil floresan protein birleştirilmiş hafif zincir 3 (LC3-GFP) ifade 22 RV1 hücreleri. Hücreler hızla yayılması kolaylaştırmak için yeterli yoğunlukta kaplama, ama o kadar çok hücreler büyümüş ve görüntüleme zaman clumped olduğunu. Olmalıdır
  2. PBS ADI (0.3 mg / ml) ile seçilen hücre örnekleri davranın.
  3. Görüntüleme önce yaklaşık 1 saat, Lysotracker ile kırmızı DND-99 (Invitrogen, CA) 20 ml RPMI 1.5 ul sulandırmak. % 10 FBS ve% 1 antibiyotik içeren. Seçilen örnekler için ADI içeren çözümler kullanın. ° C önce kültür çanak içine ekleyerek 37 tüm medya sıcak.
  4. RPMI 37 ° C'de 15-45 dakika boyunca Lysotracker Kırmızı DND-99 içeren hücrelerin inkübe
  5. Görüntüleme önce yaklaşık 30 dakika, WeatherStation çevre muhafaza açmak ve 37 gelmesini sağlayınız ° C ve% 5 CO 2 (gösterilmeyen nem ileIED hava).
  6. PBS ile hücreleri yıkayın ve standart RPMI sadece% 10 FBS ve% 1 antibiyotik içeren medya değiştirin. Belirtilen örnekler ADI ekleyin.
  7. Montaj 35 mm coverglass-alt kültür özel adaptörü (Hassas, Inc, WA Uygulamalı) yemekleri, ve mikroskop sahnede konumu. 60X 1.42 NA objektif lens üzerine immersiyon (kırılma indeksi 1.520) kullanın ve sahnede monte kültür çanak yerleştirin.

3. Bölüm 3: Dekonvolüsyon Mikroskopi ve Analiz

Bu bölümdeki protokol DeltaVision Kişisel DV deconvolution mikroskop ve ilgili Softworx uygulama paketi (Uygulamalı Hassas, Inc, WA) kullanımını varsayar.

  1. Satın alma iş istasyonu ve cihaz kontrol dahil olmak üzere, mikroskop sistemi açın. Xenon ışık kaynağı mikroskop sahne ve dönüş başlatmak için Resolve3D uygulamasını açın. Isınmak ve istikrarlı koşullar ulaşmak için ışık kaynağı için 10 dakika izin verin.
  2. Bir eklemedaldırma petrol damla 60X 1.42 NA objektif lens ve objektif lens üzerinde merkezi slayt örneği (aşağı kapak kayma yüz) üzerinde (37 canlı örnekler için kırılma indeksi 1.520 ° C veya oda sıcaklığında sabit örnekler için 1.516).
  3. Daldırma yağ boncuk ters cam kapak ile temas edene kadar ya parlak alan veya Sokak aydınlatma ve kaba odağı ayarlamak düğmesini kullanarak, yavaşça objektif lens yükseltmek. (Bu noktadan sonra, hücre tabakası ince odak topuzu ayarlamak birkaç tur içinde odak noktası haline gelmelidir). Slaytlar üzerinde sabit örnekleri ile çalışırken, bu kabarcıkları ile herhangi alanlarda veya yakın hücreleri önlemek için tavsiye edilir. Cam alt çanak canlı örnekleri ile görüntülerken, cam lamel sınır dışında objektif lens hareket kaçının.
  4. Autophagosomes EGFP sinyali (yeşil) tarafından tespit edilebilir. Lizozomlar Lysotracker Kırmızı (canlı örnek) ya da anti-LAMP1 floresan antikor (sabit örnek) ile tanımlanır. Hücre çekirdekleri DAPI st ile tanımlanır(sabit örnek) Aining.
  5. Görüş istenen alanı seçin. İdeal olarak, hücreler tüm uygun kanalları iyi floresan sinyal göstermelidir, ve yeterince bağlı ve hücre içi içeriği görselleştirmek kolay böylece lamel yüzeyine yayılmış. Yan x, y ve z,-odak küçük ayarlamalar Acquire3D arabirimini kullanarak bilgisayar tarafından kontrol edilebilir. Görmek istenen alanı (daha fazla hücre binning 2x2 olarak ayarlanır alanında görülebilir) bağlı olarak, 1x1 veya 2x2 için binning ayarlayın.
  6. Bir hücrenin midsection ile belirli bir görüntü için, maksimum piksel yoğunluğu 3.000 sayıları aşmayacak şekilde maruz kalma parametreleri (örneğin% iletim gücü ve maruz kalma süresi) ayarlayın. Genel olarak,% iletim 1 sn üzerinde olan k pozlama süresi artırmadan, mümkün olduğu kadar düşük ayarlanmalıdır. En yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için görüntülü her floresan renk ve görüş her bir ayrı alan için bu işlemi tekrarlayın.
  7. U ayarlayınsırasıyla, hücre numunesinin üst ve alt kısmına sadece biraz odaklama ile Z-yığının pper ve alt limitleri. Resimlerin sayısı Z-yığın verilen bu nedenle bu sınırları ile ve tabakalar (: 0.2 um bir varsayılan değer) arasındaki boşluğu ile belirlenecektir.
  8. Görüntü alımı sırasında hareket eserler en aza indirmek için, sabit örnekler için "sonra dalga boyu z-yığını" ve "z-yığını dalga boyu" canlı örnekleri için için görüntü elde etme modunu ayarlamanızı öneririz.
  9. Floresan görüntüleri Softworx (Uygulamalı Hassas, WA) kullanarak deconvolved ve daha sonra (Perkin Elmer, MA şimdi, Doğaçlama) Volocity kullanılarak analiz edilmektedir.

4. Bölüm 4: Süper çözünürlüklü, Yapısal-aydınlatma (OMX) Mikroskopi

Bu bölümdeki protokol OMX Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskop kullanımı (Uygulamalı Hassas, WA) için de geçerlidir.

  1. Ana güç ve istenilen lazerler (410 nm, 488 nm, ve / veya 532 nm) açın. 20 mi bekleyinn lazerler için termal stabilize edilecek.
  2. 60X 1.42 NA objektif lens üzerine daldırma yağ (oda sıcaklığında sabit numuneler için kırılma indeksi 1.516) ekleyin. Kabarcıklar yağ damlacığı görülür ise, amacı temiz ve tekrar yağ ekleyin.
  3. Sahnede ve gerekirse örnek slayt yerleştirin, hücreler için 10 dakika lamel yerleşmek için izin.
  4. Satın alma programı başlatılamıyor. Hücrenin keskin bir taslak görülebilir kadar Odağı ayarlamak için floresan aydınlatma kullanın. (Bakım gerçek görüntü elde etme kadar, floresan uyarma için hücrelerin maruziyeti en aza indirmek için her zaman alınmalıdır).
  5. Bir spiral mozaik tarama ilgi hücreleri veya bölgeleri seçmek için örnek geniş alanlar önizleme elde edilebilir. Bu örnek tarama veya hedefleri bulurken kısa pozlama süreleri (1-10 msn) ve düşük uyarma gücü (0.1-1% iletim) kullanılması tavsiye edilir.
  6. GFP-LC3 floresan tarafından autophagosomes belirleyin. Alexa Fluor 555 anti-LAMBASI tarafından lizozomlar tespit(Lizozom ilişkili membran proteini) ve DAPI (sabit örnekler) kullanarak hücre çekirdekleri.
  7. Dalgaboyu, görüntü alanı (örneğin 512x512), yığın kalınlığı, maruz kalma süresi ve lazer iletim oranı dahil olmak üzere deneysel koşullar seçin. Süper karar görüntüler için, yapısal aydınlatma seçeneği etkin olduğundan emin olun. OMX deconvolution mikroskopi için, geleneksel aydınlatma seçeneği seçin.
  8. En iyi sonucu elde etmek için yeniden, maksimum yoğunluğu sayısı satın alma sırasında 10,000 ila 15,000 olduğunu bu deneysel koşullar seçin. Photobleaching bir endişe ise, daha düşük bir pozlama (5.000 ve 10.000 arasında sayımı) de görüntüleme kullanılabilir. İdeal olarak, sayıları tüm toplama sırasında iki kat daha fazla azaltmak gerekir, ve dört kat daha fazla azalır kaçınılmalıdır. Eğer gerekli ise, sürekli yoğunluğu sayısı sağlamak için yığın kalınlığını azaltmak. Kamera çok fazla, 64.000 adet de doyururtensit Bu asla aşmamalıdır. Iyi örnekleri için,% 1 lazer şanzıman ile 10 olmak deneysel koşullar ~ 50 msn maruz kalma süresi bulundu. Tekrar tekrar görüntülenebilir parlak ve fotostabil örnekleri tercih edilir. İstikrarlı leke zaman atlamalı, süper çözülmesi görüntüler için gereklidir.
  9. Gürültü, bir 95MHz okuma hızı (Orta hız seçeneği) ve 2 milisaniye veya daha fazla satın alma süresini azaltmak için tavsiye edilir. Artan eserler örnek satın alma sırasında hareket yeniden görüntülü, elde edilir. Bu etkiler nedeniyle, kısa pozlama olmayan yapışık veya hızlı hareket eden hücreler için tavsiye edilir.
  10. Çok kanallı görüntüleme aynı anda veya sırayla yapılabilir. Sıralı modda verim daha az çapraz konuşma ve böylece tavsiye edilir.
  11. Photobleaching azaltmak için, genellikle ilk uzun uyarma dalga boyları (daha sonra 532 nm, 488 nm ve 410 nm) ile görüntü tavsiye edilir. Bununla birlikte, Şekil 3 'de gösterilen deney sonuçları için, bu sırasını tersine olduBu özel örnek fotostabilite nedeniyle d (yani 48 nm, 532 nm ve 410 nm).
  12. Hücrelerin üst / alt odak dışında biraz kadar mikroskop sahne hareket ettirerek Z-yığın üst / alt limit ayarlayın. Yeniden yazılım varsayılan olarak bu değeri almak gibi her resim arasında istenen mesafe, süper çözünürlük görüntüleme için 0.125 mikron sabit tutulmalıdır.
  13. Softworx (Uygulamalı Hassas, WA) kullanarak görüntü yığınlarının yeniden ve Volocity 6.0 (Perkin Elmer, MA) kullanılarak analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 1 'de gösterilen görüntü dizisi Otofaji oluşumunun ilk 80 dakika boyunca CWR22 hücrelerinde meydana gelen fiziksel değişiklikleri gösterir. Bu ve diğer çalışmalar (gösterilmemiştir) sürekli olarak gözlenen: uzak hücre merkezine çekirdeğin (1) değiştirme; odak yapışma noktaları (2) azaltılması ve ortasına doğru autophagosomes ve lizozomlar (3) Genel translokasyon Celi. Buna ek olarak, biz de daha sonra noktalarında autophagosomes (yeşil) ve lizozomlar (kırmızı) arasında ko küçük bir artış (sarı belirtildiği), gözlemledi.

Görüntü tabanlı sitometri bir gösteri olarak, tanımlamak, saymak ve gösterilen CWR22 hücrelerin görüntüleri etiketli autophagosomes ve lizozomlar istatistiksel veri toplamak için Volocity dijital görüntüleme uygulama paketi (sürüm 6.0, Doğaçlama / Perkin-Elmer) kullanılan Şekil 1. Şekil 2 'de çizelgeleri ile gösterildiği gibi, T sayısını ve boyutunuo autophagosome (onların ilk oluşumu ve görünümünü sonra) zamanla değişir: otofaji indüksiyon 80 dakika sonra, autophagosomes sayısında kademeli bir ama net azalış (Şekil 2A) autophagosomes ortalama büyüklüğü karşılık gelen bir artış ile yoktu ( Şekil 2B). Buna ek olarak, Pearson korelasyon katsayısı analizi (Şekil 2C) dayalı autophagosomes ve lizozomlar ve ko bir ölçülebilir artış vardı. Birlikte, bu bulgular otofaji uyarılması üzerine, çok sayıda küçük autophagosomes zaman içinde daha büyük autophagosomes (Şekil 2B) oluşturmak için sigorta önerdi. Şekil 1 ve 2 sadece tek bir görüntüleme çalışmanın sonuçlarına yansıyan ve daha sıkı kantitatif analiz sağlam bir sonuç çıkarmak için gerekli olsa da, bu nicel floresan mikroskobu özellikleri ve avantajları göstermektedir yaptı. Biz aktif yapın bu tekniği kullanıyorr hücresel otofaji moleküler mekanizması ve sürecinin incelenmesi devam etmektedir.

Şekil 3A edinilen ve OMX mikroskop (sağ) kullanarak DV modu (simüle Geniş açılı deconvolution, solda) ve yapılandırılmış-aydınlatma modunda yeniden görüntülerin bir yan-yana karşılaştırma gösterir. Yanal çözünürlüğü 120 kadar nm, geleneksel kırınım-sınırlı mikroskopi 14,15 iki katı çözünürlüğe geliştirildi. Onlar geleneksel floresan görüntüleme ile pek belirgindi ise autophagosomes ve lizozomlar (oklarla gösterilen Şekil 3B,) küçük ölçekli ko, süper çözünürlüklü mikroskopi ile açıkça belirgin.

Dekonvolüsyon Mikroskopi kullanmanın avantajlarından biri farklı moleküller arasında daha doğru mekansal bilgi ortaya bir 3D modeli içine tüm görüntüleri yeniden etmektir. Movie 1 bir CWR22 RV1 hücre undergoi genel bir resim gösterirDaha sonra nokta, autophagosome ve lizozom arasında ko önemli miktarda meydana başlar de ng otofaji. E-kaderin boyaması (beyaz renkli olarak belirtilmiştir), hedef hücre hatları ortaya koymaktadır. Sinema 2, 3D yeniden modeli autophagosomes ve lizozomlar (gibi sarı renkte gösterilen) arasındaki füzyon daha fazla mekansal ayrıntılı bilgi sağlar. Biz açıkça yeşil LC3 sinyalleri ve kırmızı Lizozom sinyalleri ve sarı sinyalleri üretmek için iki sinyal birleştirme arasındaki etkileşimi görebilirsiniz.

Şekil 1,
Şekil 1. ADI ile tedavi CWR22 RV1 hücrelerinin Zaman Aşımı görüntüleri. 80 dakika ADI ile tedavi CWR22 RV1 hücreleri gösteren resim dizisi. (Maksimum Z projeksiyon tarafından orijinal görüntü yığınlarının elde edilen 2D görüntüleri). White noktalı çizgi hücresi hatları temsil eder, ve ışık-gölgeli bölge çekirdeğin konumunu temsil eder.

Şekil 2,
Şekil 2. İstatistiksel Analiz. İstatistik eğilimleri görüntü verileri ölçülebilir olduğu bir gösteri Şekil 1'de gösterilen görüntü sırası analiz ederek çıkarıldı. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. Celi. A'da Autophagosome ve lizozom dağıtım Top) Yan yana edinilen ve OMX mikroskop (sağ) kullanarak DV modu (simüle Geniş açılı deconvolution, sol) ve yapılandırılmış-aydınlatma modunda yeniden görüntülerin karşılaştırılması. Ölçek bar 5 mikron temsil eder. B. Alt) autophagosomes ve lizozomlar (oklarla gösterilen) Küçük ölçekli ko.

Film 1 ve Film 2. CWR22 RV1 Hücre Uygulanan Otofaji 3D İmar. Bu film ADI tedavi sonrası normal otofaji indüksiyon göstermektedir. Z-Stack görüntüleri 3 boyutlu modeli yeniden inşa edildi. Bu film hücre ° yatay ve 360 ​​° dikey olarak 360 çevirerek oluşturulmuştur. Yeşil sinyal LC3 temsil eder, kırmızı sinyal lizozom temsil eder, beyaz sinyal E-Cadherin temsil eder ve mavi sinyal çekirdeğini temsil eder. Movie 1 görmek için buraya tıklayın ya da= "_blank"> Film 2 görmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LC3 karşı floresan problar ile işaretli hücrelerin doğrudan gözlem yaygın otofajik yanıt 6, nicel 3D aynı sistem (yaptığımız gibi) görüntüleme hücresel otofaji karmaşık süreci hakkında benzeri görülmemiş bir bilgi ve ayrıntı sağlayan onaylamak için standart bir yöntem olarak kabul edilirken . Özellikle, canlı hücrelerde autophagosomes yüzlerce (yoksa bin) otofaji indüksiyon 80 dakika içinde oluşur görüyoruz. Benzer şekilde, otofaji indüksiyon sırasında lizozomal bölmeleri dağılımında çok ilginç morfolojik değişiklikler görüyoruz. Belirli bir hücre içinde, autophagosome sayısındaki azalma ve zaman içinde ortalama boyutu karşılık gelen bir artış, bu autophagosomes formu autolysosomes için lizozomlar ile birleştirerek önce, birbirleriyle eritme tarafından büyük büyümek öneririz. Canlı hücrelerin yüksek çözünürlüklü 3D floresan görüntüleme autophagosomes kritik bir boyutu befor ulaşmalıdır olup olmadığını araştırmak için bize sağlarlizozomlar ile e eritme veya otofaji daha küçük fiziksel boyutta sadece devam olup olmadığını. Gerçekten de, sadece deconvolution mikroskop kararı sınırında erken aktivasyon üzerine görünür çok küçük autophagosomes sayısı göz önüne alındığında, ve çok daha net OMX yapılandırılmış-aydınlatma mikroskop 13 karar, bu söz konusu olabilir aslında otofajik faaliyet toplu bu aşamada gerçekleşir.

, Belirli bir hücrede Autophagosomes sayısı ve boyutunda değişiklik hücreden hücreye, bu parametrelerinin varyasyonları göre, küçük olabilir gibi Otofaji seyri sırasında canlı hücreleri izleme olanağı, son derece önemlidir. Biz gözlemlediğimiz morfolojik değişiklikler deneysel koşullar yerine, istatistiksel varyans nedeniyle daha emin olabilirsiniz - zaman içinde tek bir canlı hücresi inceleyerek.

Son olarak, spesifik moleküler işaretleri ile, biz çalışma bu görüntüleme teknikleri uygulayabilirsinizautophagosomes erken oluşumu, autophagosomal membranlar için kökeni izlemek için, ve özellikle otofaji indüksiyon sırasında autophagosomes sardı edilmiştir mümkün organelleri ve / veya hücre içi bileşenleri tanımlamak için. Ayrıca bu yaklaşım bize hücre hayatta kalma ve hücre ölümü otofaji rolünü araştırmak ve daha iyi potansiyel ilaçlar ve otofaji üzerinde inhibitörlerinin etkilerini karakterize sağlayacaktır umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Hibe desteği: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), Biophotonics Bilim ve Teknoloji (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Kalın) için NSF FİZ-0.120.999 Merkezi, Araştırma Norveç Konseyi, Leiv Eiriksson Seyahat Bursu 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung de Auburn Topluluk Kanser Vakfı Fonu'nun desteğiyle kabul eder. RJ Kalın da J. McDonald bağış desteği kabul eder.

Biz ADI cömert temini için Dr Jenny Wei-Jen Kung ve DesigneRx Dr Bor-wen Wu teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arginine Deiminase (ADI) DesigneRx
HEPES Sigma H4034
Casein Sigma C5890
Paraformaldehyde Fisher 4042
Saponin Sigma S4521
Alexa anti-mouse 555 Invitrogen A21422
Alexa anti-rabbit 647 Invitrogen A21244
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L7528
anti-Lamp1 DSHB H4A3
anti-Cadherin Cell Signaling #3195
SlowFade Gold Invitrogen S36936
35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate MatTek P35GC-1.5-1.4-C
No.1, 22 mm coverslip Corning #2865-22
Microscope slides Globe Scientific 1324G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69, (2), 700-708 (2009).
  2. Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
  3. Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
  4. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
  5. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  6. Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
  7. Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
  8. Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
  9. Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
  10. Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
  11. Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10, (6), 551-562 (2011).
  12. Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171, (3), 382-388 (2010).
  13. York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).
  14. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
  15. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8, (12), 1044-1046 (2011).
Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).More

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter