Summary
ここでは、ホールマウント蛍光を記述
Abstract
遺伝子の発現パターンだけでなく、その転写されたRNAの細胞内局在化特性を評価、開発中にその生物学的機能を理解するために重要な機能です。 in situハイブリダイゼーション 、RNA（RNA ISH）は、生物の、細胞または細胞内のレベル1でそれである、RNAの分布特性を可視化するために使用される強力な方法です。 RNA-ISHはmRNAまたは関心2の非コーディングRNA標的の配列に相補的な標識核酸プローブ（ 例えば、アンチセンスRNA、オリゴヌクレオチド）のハイブリダイゼーションに基づいています。手順は配列特異的なプローブを生成するために単独で一次配列情報を必要として、それは普遍的に生物や組織標本3の広い範囲に適用することができます。実際、大規模なISHの多くの研究がにつながっている様々なモデル生物における遺伝子発現とRNA局在化ダイナミクスを文書化するために実装されています重要な地域資源の確立4-11プローブのラベリングと検出、様々な戦略が長年にわたって開発されてきたが、蛍光標識された検出試薬と酵素信号増幅ステップの併用は、手順12の感度と分解能の大幅な機能強化を提供します。ここでは、段階的なショウジョウバエ胚におけるRNAの発現と局在の動態を可視化するためにチラミドシグナル増幅（TSA）を用いるin situハイブリダイゼーション法（FISH） に最適化された蛍光を記述します。手続きが大幅に多数のサンプルの同時処理を容易にする96ウェルPCRプレート形式で行われる。
Protocol
1。 RNAプローブの調製
概要：次のセクションでは、魚に適したジゴキシゲニン（DIG）標識RNAプローブを作るために必要な手順を説明します。最初のステップは、クローニングや配列特異的なプローブを生成するために使用され、目的の遺伝子の転写領域に対応する配列を増幅するPCRを伴います。これは、複数のクローニング部位は、その後のプロモーター配列を組み込む隣接するプライマーを用いたPCRのテンプレートとして使用することができますバクテリオファージプロモーターエレメント（T7、T3またはSP6）が隣接したプラスミドへの最初のクローニング遺伝子セグメントによって達成することができる、このように各端で異なるプロモーター配列（ 図1A）と線形PCR産物を生成する。あるいは、クローニングステップを回避するために、1つはまた、T7、T3またはSP6配列が、5 '端で（ 例えば T7を含むオリゴヌクレオチドを用いて、ゲノムDNAまたはcDNAからPCR増幅を行うことができます。5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3：5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; SP6：5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '）。リニアPCR産物をランオフ適切なポリメラーゼ（ 図1B）を用いた in vitro 転写によりDIG標識センスまたはアンチセンスRNAプローブを作るためのテンプレートとして使用されます。特定の遺伝子に対するプローブを作るとき、私たちは魚のシグナル特異性（ すなわち 、目的の遺伝子をアンチセンス方向に転写されていない限り、評価するための参考になると明確なポリメラーゼを用いて、センスおよびアンチセンスRNAプローブの両方の準備をお勧めし、センスRNAプローブは、明らかにする背景信号のレベル）。次のすべての手順では、1は、（ 例えば 、水、最初の70％エタノールまたは商業アーゼ除染ソリューションをすべてベンチエリアや機器を洗浄することにより、RNaseフリー用品を使用することによって汚染リボヌクレアーゼ（RNaseが）することにより、潜在的な劣化を避けるために細心の注意を払うべきであるヒント、マイクロチューブ）。
マterials
- 1.5 mlのマイクロチューブ、（Abgene、ロチェスター、NY、アメリカカタログ番号0900）
- ゲル抽出キット（QIAGEN、ミシサガ、ON、カナダ;カタログ番号28706）。
- アーゼフリー水（ヴィセント株式会社カタログ番号809から115-CL）
- RNAポリメラーゼ（T7、T3、またはSP6）。 （20 U /μlで、フェルメンタスBiosciences社。カタログ番号EP0101、EP0111、EP0131）。
- アーゼ-OUTリボヌクレアーゼ阻害剤（40 U /μl）を、（インビトロジェン、バーリントン。Canada.Cat号10777から019 ON）です。
- ジゴキシゲニン（DIG）ヌクレオチドミックス（DIG-11-UTP、ロシュ·アプライド·サイエンス、ラヴァル、QC、カナダ。猫。No.11209256910）。
機器
- 卓上マイクロ遠心
- ゲル電気泳動装置
- PCRは、バクテリオファージT7、T3またはSP6プロモーター配列が隣接線形PCR産物を生成するためにゲノムDNA、cDNA、またはプラスミドDNAから遺伝子特異的な配列を増幅する。 PCR条件については、製造元の推奨に従ってください。
- 品質とsiを確認しますアガロースゲル電気泳動によるPCR産物のぜ。消費税及び勧告を製造し、緩衝液50μl中に生成物を溶出によると、標準ゲル抽出キットを用いてPCR産物を精製する。
- 3M酢酸ナトリウム（pH5.2）と氷冷100％エタノールを150μlの5μlを添加してPCR産物を沈殿させ、-70℃で一晩チューブを配置します。 4℃で10分間13000×gで遠心すると沈殿を70％エタノールで洗浄してください。再びスピン、エタノールと空気ペレットを乾燥のすべてのトレースを削除します。 RNaseフリー水の25〜50μlに再懸濁する。
- 10X T7転写緩衝液（Invitrogen）を2μl、RNaseインヒビター、2μlのDIG-NTPのミックスを1μl（20 U /μl）を次のように20μlの反応液で200から500 ngの精製したPCR産物を用いてDIGラベルされたプローブを書き写す、、2μlのT7 RNAポリメラーゼ（20 U /μl）を。 RNaseフリー水で20μlに最終的なボリュームを持ってきて。 3〜4時間、37℃で転写反応をインキュベートする。
- transcを調整RNaseフリー水で50μlにriptionミックスとは、ステップ4で説明DIG標識RNAプローブを沈殿させた。 RNaseフリー水100μlで洗浄し、RNAペレットを再懸濁します。 -70℃で再懸濁したサンプルを保存
- 光度計、分光光度計を用いてプローブを定量化する。プローブの品質を確認するには、エチジウムブロマイドで染色した1から2パーセントアガロースゲル上で1から2μlのサンプルを実行します。
2。 ショウジョウバエの胚の収集および固定
概要：このセクションでは、段階的なショウジョウバエの胚を収穫し、処理するための手順を説明します。必要とされる胚の数に応じて、ハエは様々なサイズの人口ケージに維持することができる。コレクションは100ミリメートルリンゴジュースコレクションプレートを用いて900センチメートル3円筒形のケージを使用して実行するため、次のステップは次のとおりです。適切な固定は胚を囲む2つの保護層の除去を必要とする：外側と内側の絨毛膜ビテリン電子膜13。一度収穫し、胚を第一絨毛膜を除去するために、50％漂白剤溶液に浸され、次にそれらをヘプタン（卵黄膜をpermeabilizes）と、3.7％ホルムアルデヒドを含むPBSを含む二相溶液中で混合する。卵黄膜は、その後、ヘプタンとメタノールの混合物中に二相性の胚を転送することにより、ひび割れや削除されます。適切な胚の固定と卵黄膜の除去は、下流FISHの手順の成功のために重要である。
材料
- ダイムサイズの酵母ペースト（パン酵母、バターの一貫性に水と混合）とアップルジュース寒天プレート（40％りんご果汁、4％スクロース、3.5％寒天、0.3％メチルパラベン）
- 粉末状のパラホルムアルデヒド（電子顕微鏡学、ハットフィールド、ペンシルバニア州、アメリカ合衆国;。カタログ番号19208）
- ヘプタン
- メタノール
- 3％漂白剤溶液
- 20ミリリットルガラスシンチレーションバイアル（ON、カナダサーモフィッシャーサイエンティフィック、オタワ、;カタログ番号03から337-15）。
機器
- 人口ケージ
- コレクションバスケット（Nitexメッシュと穴が蓋にカットされたカット50mlポリプロピレンチューブの上部を使用して作られる）。
- 小さなペイントブラシ
- テーブルトップの渦
- 25℃で1時間のために新鮮なリンゴジュース/酵母プレートと栄養の十分な人口ケージ事前クリア℃に
- 初期段階の胚を収穫するためにケージに新しいりんごジュース/酵母プレートを追加します。 25℃で4時間のためにケージをインキュベート℃（収集時間は、所望の段階に応じて調整することができることに注意してください）。
- 3.7グラムのパラホルムアルデヒド粉末、2NのKOH70μlの、化学ボンネットの下にガラスシンチレーションバイアル中のミリQ水7.3ミリリットルを組み合わせることにより、新鮮な37％ホルムアルデヒド溶液を調製します。パラホルムアルデヒド粉末が完全に溶解するまで新しいシンチレーションバイアルに入れ、室温およびフィルタへのその後涼しい、溶液を沸騰。
- 相性によって固定液を調製その後ヘプタンの7.5 mlを加え、シンチレーションバイアル中の37％ホルムアルデヒド250ミリリットルでの1X PBS 2.25ミリリットルを組み合わせる。
- ケージからリンゴジュースプレートを収穫し、室温の水道水のビットを追加し、微妙にペイントブラシでプレートから胚をブラッシングすることによって胚を収集します。バスケットに再懸濁させた胚を移し、ぬるま湯の水道水で洗い流してください。
- 漂白剤溶液中でコレクションバスケットの入浴で90秒間Dechorionate胚は、その後ぬるま湯水道水（漂白剤の臭いがなくなるまで）で十分にすすいでください。
- コレクションバスケットを分解し、優しく絵筆を使って胚を収集し、二相性の固定液にそれらを転送します。胚は、PBSおよびヘプタン層との間の界面に蓄積されます。
- シールシンチレーションバイアル、ボルテックスミキサーに固定します。最低設定で20分間振とうする。
- 取り外し、下PBSとパスツールピペットを用いて上部ヘプタン相の大部分を捨てる。吸引する残りのPBS /ヘプタン/胚ピペットへの混合物。滴下方式で、胚を排除しないように注意しながら、ピペットから下のPBS相を捨てる。 500μlのヘプタン（上相）の二相溶液を含む1.5 mlチューブに胚を堆積し、500μlのメタノール（下相）。
- 卵黄膜をクラックするために30から45秒間手で激しく振ら。一度割れた、胚はメタノールにシンクします。
- ヘプタン/メタノール相間上部ヘプタン相と未分解胚を破棄し、メタノール500μlを添加する。 5秒間振る。
- メタノールで3回洗浄し、-20℃で胚を保存する（この時点で胚が週/月のために保存することができます）。
3。後固定処理、ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後の洗浄
概要：魚にこのセクションの詳細胚透過処理のための処理ステップの前に、プレハイブリダイゼーション、RNAプローブとハイブリダイゼーション後の洗浄とのハイブリダイゼーション。初期透過処理手順については胚は、単一のチューブ（下記の手順1-9、定住胚/サンプルの10〜15μLを目指す）のプールとして扱われていますが、96ウェルPCRプレートの各ウェルに分注しアールプレハイブリダイゼーション工程（下記手順10）に進む前に。これは実験の初期段階にあるすべての胚さえ治療を確保するために役立ちます。 FISH実験をセットアップするとき、それは個々の実験におけるバックグラウンド信号のレベルを決定するためにネガティブコントロールを含めることが重要です。このため、我々は 'no-プローブ'サンプルと、第1節で述べたように、 '意味'は一般的に 'no-プローブ'条件に匹敵する信号を与えるRNAプローブとハイブリダイズしたサンプルを含めることをお勧めします。
材料：
- メタノール
- リン酸塩は、0.1％のTween-20（PBT）で緩衝化生理食塩水
- プロテイナーゼK 1 mg / mlのストック溶液（シグマアルドリッチ、オークビル、オン、カナダ。商品番号P2308）
- グリシン（20 mg / mlの原液）
- ハイブリダイゼーション溶液：50％ホルムアミド、5×SSC、0.1％Tween-20を、剪断サケ精子DNAの100グラム/ミリリットル、100μg/ mlのヘパリン。
- 0.2ミリリットル、96ウェルPCRプレート、Abgene、ロチェスター、NY、アメリカの猫halfskirted。なし0900ありません）
機器
- ハイブリダイゼーションオーブン、56に調整可能なデジタル加熱ブロックまたはウォーターバス℃、80℃または100℃、またはPCRマシン。
- マルチチャンネルピペッター（洗浄工程を簡略化するために推奨）
- Nutatingミキサー
- PBTで二回、PBT、および：メタノールの1:1混合物でその後、メタノール中で胚を洗浄します。
- PBTはnutator上の一定ロッキングで3.7％ホルムアルデヒドを（ステップ11で説明したように新たに調製した）を含む1mlの20分間胚を固定します。
- 揺らしながらPBTで2分間、3回の胚を洗浄します。
- PBTとアドインで希釈したプロテイナーゼK（PK）の3μg/ mlの溶液を調製試料に溶液500μl。振とうせずに室温で10分間、サンプルをインキュベートする。チューブやピペットで静かに反転させて噴射することにより胚ごとに2分を混ぜる。
- 1時間氷上で胚サンプルを転送します。
- 室温にサンプルを動かすとPK液を除去する。 PBT + 2 mg / mlのグリシン1mlで2分間2回洗浄する。
- 揺らしながらPBT + 3.7％ホルムアルデヒド1mlのサンプルを20分を修正しました。胚のPBTで5回すすいでください。
- PBTとHyb溶液の1:1混合物1mlで胚を洗浄します。 100パーセントHyb溶液（この段階で胚は-20℃で数日間/週間保存することができます）0.5〜1 mlと交換してください。
- 96ウェルプレートの各ウェルに分注し胚（胚決済/ウェルの約10から15μLを目指し、胚の損傷を防ぐために、広い開口のヒントを使用するように注意してください）。
- 5分間氷上でクールその後5分間Hybを溶液100μl/サンプルを沸騰させ。この溶液は、（プリHYB）サンプルプレハイブリダイゼーションのために使用さ。
- プリHybを溶液100μl/サンプルを追加し、56℃で少なくとも2時間インキュベート℃、
- 各サンプルについて、Hyb溶液100μlにプローブ〜100 ngを希釈します。 80℃熱℃で3分間インキュベート、5分（加熱プローブは数時間氷上に維持することができます）のために氷の上で涼しい。
- 胚からプリHybに溶液を除去したRNAプローブ溶液と交換してください。
- 12〜16時間、56℃でハイブリダイズする。
- 56℃以下の洗浄溶液プリ暖かい℃：Hyb溶液の（）を200μl/サンプルHybを3:1の混合物（B）を100μl/サンプル：PBT、（C）の100μlのサンプル/ Hybを1:1の混合：PBT樹脂、（D）Hybを1:3の混合液100μl/サンプル：PBT、（E）PBTの400μL/サンプル。
- 洗浄液100μlで試料をすすぎ、その後15分ごとに56のソリューション·ADの100μl/サンプルと、洗浄工程°Cを実行します。その後、56℃で溶液Eを100μl/サンプルで5分間のサンプルを4回洗浄
- 室温まで冷却するサンプル。
概要：このセクションでは、ハイブリダイゼーション後のRNAプローブ信号の分布を検出し、視覚化するために使用する抗体および検出試薬について説明します。これらの手順は、 図2に模式的に概説されています。ここで我々は強固な信号増幅のために使用する標準的な検出試薬のみを提示したが、タンパク質-RNA二重のために同時に異なるRNAを共同検出するためにダブルFISH実験を実行する場合は特に、様々な代替手段として使用することができ、市販の試薬を、存在染色。このプロトコルで得られた結果の例を図3のmRNA発現/局在パターンモザイクで表示されます。
材料
- HRP標識マウスモノクローナル抗DIG（ジャクソンイムノリサーチ·ラボラトリーズ社のカタログ番号200-032-156）
- ビオチン結合マウスモノクローナル抗DIG（ジャクソン-3269oResearchラボラトリーズ猫。番号200-062-156）
- ストレプトアビジン-HRPコンジュゲート（Molecular Probes社、ユージーン、OR、アメリカ合衆国、猫。No.S991）
- Cy3標識チラミド複合体（パーキンエルマーライフサイエンス、ボストン、MA、アメリカ合衆国、カタログ番号SAT704A）
- ダブコは、ソリューションを実装：50 mlチューブでは、DABCOの1.25グラム（1,4 - ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン、シグマD-2522）を希釈するの1X PBS 15mlにし、完全になるまで、グリセロールとミックスの35ミリリットルを追加均質。 PBSで予備混合することによって、DABCO粉末は非常に迅速に溶解する。 -20℃で保存してマウントソリューション
- スライドガラス、カバーガラス
機器
- Nutatingミキサー
- マルチチャンネルピペッター
- 蛍光顕微鏡
- PBTBソリューション、（通常50〜100ミリリットルは、すべて検出試薬のインキュベーションおよび洗浄工程のために十分である）PBT + 1％脱脂粉乳を含むを準備します。
- nutatorに揺らしながら、100μlのPBTB /試料に室温で10分間サンプルをブロックします。 <LI>揺らしながら100μlのサンプル/ビオチンモノクローナル抗DIG抗体溶液（PBTBに株式から1/400に希釈）を用いて室温で1.5から2時間インキュベートした胚サンプルからブロッキング溶液を除去します。
- それぞれが揺らしながら、100μlのPBTB /サンプルと、5分間のサンプルを6回洗浄します。
- ロッキングとストレプトアビジン-HRP溶液（PBTB、10μg/ mlの最終濃度で在庫から1/100に希釈したもの）の75ミリリットル/試料を用いて室温で1.5時間インキュベートします。
- サンプルを5分間6回揺らしながら100μlずつPBTB /サンプル（DNAの対比のために、PBTBで1X作業濃度にDAPIを希釈し、最初の洗浄工程において、このソリューションを使用）洗います。
- PBTで胚をすすぎ、その後、PBSで5分間2回洗浄する。
- Cy3標識チラミド液（チラミド増幅バッファに1/50希釈）50μlのサンプル/とnutator、室温で2時間インキュベートする。上のこのステップから、遮光容器にサンプルを保つようにしてください。</ LI>
- サンプルをnutatorに100μlのPBS /サンプルで5分間ずつ6回洗浄する。
- PBSを除去し、70％グリセロール、2.5％（DABCO）を含むマウントソリューションの100から125 /μLのサンプルを追加します。ストアサンプル4℃これらのサンプルは数年間保存することができます。
- ワイドボアチップを使って、次に指の爪ポリッシュとスライド上胚およびシールの上にカバースリップを置き、静かにサンプルをピとスライドガラス上に胚の25μlを移すことによって胚を再懸濁します。
- 蛍光顕微鏡を用いて胚サンプルを分析します。
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Representative Results
正常に実行されている場合、このプロシージャは、初期のショウジョウバエの胚発生における遺伝子発現とmRNA局在化ダイナミクスの時空間分析の細部の著しく強化されたレベルを提供しています。古典的なペアルール遺伝子ラント （ ラン ）のために、図3Aに示すように、確かに、1つは核を表現するグループの新生転写産物病巣の検出を介して遺伝子発現のイベントを監視するために、このプロトコルを使用することができます。加えて、 図3Bの胚のモザイクのように、この方法は、高解像度でのmRNA局在機能の可視化を可能にします。
図1。 RNAプローブの調製手順の概要（）は、in vitro転写usin 内でDIG標識RNAプローブを合成するための我々の戦略の概略図バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーター要素が隣接GA線形DNAテンプレート。 （B）は、標準1％アガロースゲルの写真は、ヒストンH2A、実行およびdocトランスポゾンRNAのin vitro転写RNAプローブでの例を示す。我々は、通常のPCRテンプレートとRNAプローブの両方のside-by-side電気泳動を行う。 RNAは、典型的にはテンプレートと比較して高い移動度との激しい離散バンドとして表示されます
図2。 FISH法でプローブ検出手順の概略図。処理胚へのプローブのハイブリダイゼーションに続いては、DIGラベルされたプローブは、その後、HRP標識ストレプトアビジンと複合体化されたビオチン化α-DIG抗体を使用して認識されます。チラミドシグナル増幅（TSA）は、その後、フリーラジカルフォームトンにチラミド試薬の変換の結果実行されhrough HRPの活性を示した。一過性に反応チラミドフリーラジカルは、共有結合プローブ位置から自分の拡散を防止離れて、近くのタンパク質の芳香族残基に結合する。チラミド基質は、蛍光顕微鏡により検出できる蛍光色素に複合体化される。
図3。 ショウジョウバエ胚におけるmRNA発現と細胞内局在パターンの多様性を強調し、この魚·プロシージャを使用して得られた結果の例として、（A）は胚発生の異なる段階で実行ペアルール遺伝子のFISH分析は、中間部分でどのように初期の幅広い表現を明らかに胚のステージ4での胚の後半の段階でセグメント化されたストライプパターンに洗練されている。mRNAのlocalizatioのさまざまな品種を示すFISH結果の（B）のモザイク描写ステージ4月7日胚におけるnパターン。 FISHはビオチン化抗DIG抗体、ストレプトアビジン-HRP、およびCy3チラミド付きシーケンシャルインキュベーションによってハイブリダイズされ、検出されたDIG標識アンチセンスプローブを用いて実施した。 RNA =青、DNA =赤。中のスケールバー（A）= 25μM、その一方で、（B）=50μmである。
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Discussion
プローブ合成の手順については、我々は通常、 ショウジョウバエ遺伝子コレクション（DGC）は、次のWebサイトで詳細なリソースで見つかったプラスミドから増幅された完全長cDNAからショウジョウバエのin vitro転写によりランオフアンチセンスRNAプローブを生成： のhttp://www .fruitfly.org / DGC / index.htmlを 14,15。このアプローチは、遺伝子発現やフライ9,16胚におけるmRNA局在パターンをマッピングすることを目的とした大規模なISHの研究に広く用いられてきた。 DGCプラスミドは、 ショウジョウバエのゲノムリソースセンター（から注文することができhttps://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/ ）。出発物質およびT7、SP6、またはT3オーバーハングを持つカスタムプライマーを設計する上での柔軟性は、1つは簡単に特定のmRNAアイソフォーム（ 例えば 、選択的にスプライシングバリアント）oを検出するためのプローブを生成することができます標準cDNAコレクションで表現されていないrの非コーディングRNA。設計アイソフォーム特異的なプローブを考えるとき、私たちは250-1,000拠点に至るまでのテンプレートが優れたFISHの結果をもたらすことができることを見出した。
ハエの胚の中の魚のために、私たちは炭酸塩処理により断片私たちのプローブをしない、むしろ私たちは500-5,000塩基間の大きさの範囲であり得るランオフ完全長転写を使用しています。大型プローブに透過性が低いである他の組織にFISHを行う際には、断片化は確かにプローブの浸透を好むかもしれません。しかし、我々は小さなPCR増幅DNAテンプレートを使用してプローブを調製、または一緒に複数の個別的に合成された小型のプローブをプールするのではなく、変数の結果が得られ、全体的なプローブの品質が低下することが大きなプローブの化学的断片化を実行するオプションを好む。
胚の収集の手順で説明するように、我々は通常、胚コレクションプレートに酵母ペーストを追加します。酵母ペーストが大きくなります卵の生産は栄養環境17に依存するので、ハエの産んだ卵の数を増やします。また、 ショウジョウバエのハエは頻繁に直接酵母ペーストに卵を産むでしょう。これらの胚は、簡単に小さなペイントブラシを使用して水の中に貼り付けて酵母を溶解し、コレクションバスケットを通して混合物を渡すことによって、収集することができる。 dechorionationステップでは、水と市販の漂白剤（通常6％濃度）を1:1で希釈することにより調製した3％の漂白剤は、ほとんどのプロトコル13,18,19で使用されています。我々の経験では、90秒の3％漂白剤溶液を用いて胚をインキュベートして効率的なdechorionationを提供することを見出した。これらのパラメータが利用可能です市販の漂白液に応じて調整する必要があるかもしれないが、これは試料を損傷する可能性がありますので、一つは、漂白剤に胚を露出オーバーしないように注意する必要があります。より密接dechorionation手順を監視するには、それは、顕微鏡下で胚トンを見することが可能であるoがdechorionation反応が完了していることを確認し、それらがdechorionatedされたときの胚は彼らの背肢を失う、すなわち 。古いソリューションが沈殿する傾向があるので、最後に、適切な胚の固定を確実にするために、我々は、新たに調製したホルムアルデヒドソリューションを使用しています。さらに詳細を知りたい場合は、この手順は、前の方法の記事13,18,19に記載されている。
プロテイナーゼK、または抗体とCy3-チラミドなどの検出試薬を用いた胚組織の透過に関係する手順については、我々は、このプロトコールに記載希釈液を使用して最適な結果を発見した。しかし、ラボ環境および試薬在庫の変動に起因する、我々は、各研究室では、経験的に、特定のニーズのための最高使用濃度を決定するために、独自の試薬をテストすることをお勧めします。さらに、最適な試薬濃度が分析組織によって異なる場合があります発見した。
その魚の手続きを行うには品質の良いIsは一貫して再現性のある結果を与え、我々は常に明確に定義された式/局在パターン（ 例えば実行 ）と成績証明書のためのプローブを含むことができるアッセイにいくつかの肯定的なコントロールを追加することをお勧めします。初期のショウジョウバエ胚発生時印象的なmRNAの局在パターンと転写産物は、フライフィッシングをするウェブサイト（上で見つけることができますhttp://fly-fish.ccbr.utoronto.ca/ ）。逆に、バックグラウンド信号を検出するために制御するために、前述したように、一つでも "いいえプローブ 'および/またはセンスRNAプローブのサンプルを含める必要があります。
このプロトコールに記載されたCy3チラミド抱合体に加えて、多色イメージング実験のために追加の柔軟性を提供することができるパーキンエルマーライフサイエンスまたはMolecular Probes社（Invitrogen社、カナダ社）から、他の市販の蛍光標識チラミド試薬の様々な種類があります。この方法では、我々の基本的なprocedを説明しているが単一のRNA FISH、このメソッドのバリエーションのUREは、このような二重のRNA魚やRNA-タンパク質共同検出など、より複雑な実験のために実装することができます。これらの手続に係る詳細については、我々は、既存のFISH法論文18-20に記載された手順に従うことを推奨します。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
レキュヤー室で行った仕事は、国立科学とカナダの技術評議会（NSERC）、健康研究（CIHR）とフォン·ド·RECHERCHE専用サンテ·デュ·ケベック（FRSQ）のカナダの協会からの資金によってサポートされています。キャロルIampietroがアンジェロPizzagalliポスドクでサポートされていながら、ファビオアレクシスルフェーブルとガエル·Moquin·ボードリーは、NSERC学部研究studentshipsによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
References
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