Здесь мы опишем весь монтаж флуоресцентных<em> На месте</em> Гибридизации (FISH) протокол для определения экспрессии и локализации свойств РНК, высказанные в ходе эмбриогенеза дрозофилы,<em> Дрозофилы</em>.
Оценка экспрессии генов, а также субклеточном свойства локализации его транскрипции РНК, являются ключевыми для понимания особенностей его биологической функции в процессе разработки. РНК в гибридизация (РНК-ISH) представляет собой мощный метод, используемый для визуализации свойств РНК распределения, будь то на организменном, клеточном и субклеточном уровнях 1. РНК-ISH основан на гибридизации меченого зонда нуклеиновой кислоты (например, антисмысловую РНК, олигонуклеотиды), комплементарный последовательности мРНК и некодирующих РНК объектом интереса 2. Так как процедура требует первичной информации о последовательности только для генерации последовательности конкретных датчиков, он может применяться универсально для широкого круга организмов и образцов тканей 3. Действительно, ряд крупномасштабных ISH исследования были реализованы к документу экспрессии генов и РНК локализации динамики в различных модельных организмов, которые привели ксоздание важных ресурсов сообщества 4-11. В то время как различные маркировки и обнаружения зонда стратегии были разработаны на протяжении многих лет, в сочетании использование флуоресцентно-меченных обнаружения реагентов и ферментативных реакций усиления сигнала предлагают значительные улучшения чувствительности и разрешающей процедуры 12. Здесь мы описываем оптимизированы флуоресцентные на месте методом гибридизации (FISH) с использованием tyramide усиления сигнала (TSA) для визуализации экспрессии РНК и локализации динамику в постановке эмбрионов дрозофилы. Процедура проводится в 96-луночный ПЦР планшет формата, что значительно облегчает одновременную обработку большого количества образцов.
Для шагов зонд синтеза, мы обычно генерируют стоки антисмысловых РНК-зондов в пробирке транскрипции от полной длины кДНК Drosophila амплифицировали из плазмиды найден у дрозофилы ген Collection (РСК), ресурс подробно описаны на сайте: http://www .fruitfly….
The authors have nothing to disclose.
Работы, проводимые в лаборатории Лекьюайер поддерживается финансирование от Национального наук и инженерного совета Канады (NSERC), Канадский институт исследований в области здравоохранения (CIHR) и Фон-де-Recherche ан Здоровье Квебека (FRSQ). Фабио Алексис Лефевра и Гаэль Moquin-Бодри поддерживается NSERC студентов studentships исследования, в то время как Кэрол Iampietro поддерживается Angelo Pizzagalli докторской стипендии.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
3M sodium acetate | |||
Cold 100% ethanol. | |||
Cold 70% ethanol. | |||
Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
Heptane | |||
Methanol | |||
proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |