अलगाव और माउस Cortical Astrocytes की संस्कृति
Summary
Astrocytes बहुमुखी कोशिकाओं मौलिक जैविक प्रक्रियाओं कि सामान्य मस्तिष्क के विकास और समारोह, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की मरम्मत के लिए आवश्यक हैं में भाग लेने के लिए मान्यता दी गई है. यहाँ हम एक तेजी से प्रक्रिया शुद्ध माउस astrocyte संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की कोशिकाओं के इस प्रमुख वर्ग के जीव विज्ञान का अध्ययन प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
Astrocytes स्तनधारी मस्तिष्क में प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार के हैं, अभी तक बहुत अपने आणविक और कार्यात्मक विशेषताओं के बारे में सीखा जा रहता है इन विट्रो astrocyte सेल संस्कृति प्रणालियों में इन glial कोशिकाओं के विस्तार में जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस वीडियो प्रोटोकॉल पता चलता है कि कैसे प्राप्त करने के लिए माउस पिल्ले की मिश्रित cortical कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति से शुद्ध astrocytes. विधि व्यवहार्य न्यूरॉन्स के अभाव और astrocytes oligodendrocytes, और microglia, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के तीन मुख्य glial सेल संस्कृति में, आबादी की जुदाई पर आधारित है. संस्कृति के पहले दिन के दौरान प्रतिनिधि छवियों एक मिश्रित सेल आबादी की उपस्थिति का प्रदर्शन और Timepoint संकेत मिलता है, जब astrocytes मिला हुआ हो और microglia और oligodendrocytes से अलग किया जाना चाहिए. इसके अलावा, हम पवित्रता और सुसंस्कृत अच्छी तरह से स्थापित के लिए immunocytochemical stainings का उपयोग astrocytes के astrocytic morphology प्रदर्शन औरनव astrocyte मार्करों वर्णित है. इस संस्कृति प्रणाली आसानी astrocyte जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए शुद्ध माउस astrocytes और astrocyte वातानुकूलित माध्यम से प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
Astrocytes एक बहुत ही प्रचुर मात्रा में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सेल प्रकार हैं. चूहों और चूहों के प्रांतस्था में astrocytes के न्यूरॉन्स अनुपात 01:03 है, जबकि वहाँ में मानव प्रांतस्था 1 1.4 न्यूरॉन प्रति astrocytes. Astrocyte समारोह में ब्याज नाटकीय रूप से हाल के वर्षों में वृद्धि हुई है. Astrocytes का एक प्रमुख कार्य 2,3 न्यूरॉन्स के लिए संरचनात्मक और चयापचय समर्थन प्रदान करने में उनकी भूमिका है. Astrocytes के लिए नव की खोज की भूमिकाओं कार्यों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम कवर. ये 4-6 विकास दौरान विकासशील axons और कुछ neuroblasts के प्रवास मार्गदर्शन, synaptic प्रसारण में काम करता है, synapse और तंत्रिका 7-9 सर्किट द्वारा सूचना संसाधन शक्ति, रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) में भूमिकाओं 10 गठन और 11-13 अखंडता और cerebrovascular टोन 14 के विनियमन और. Astrocytes का एक अन्य प्रमुख विशेषता उनके चोट करने के लिए जवाब है. रोग की स्थिति astrocyt के तहततों प्रतिक्रियाशील बन गया है और और मध्यवर्ती रेशा glial fibrillary अम्लीय (GFAP) प्रोटीन और निरोधात्मक कोशिकी मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन 15,16 की अभिव्यक्ति upregulate. रिएक्टिव astrocytes स्वस्थ ऊतकों से एक glial निशान, जो chondroitin सल्फेट proteoglycan परिवार (CSPG) के astrocyte secreted ईसीएम प्रोटीन की मुख्य रूप से शामिल द्वारा निर्मित चोट साइट हदबंदी करना, प्रमुख कारक है कि CNS 15-17 चोट के बाद axonal उत्थान रोकती हैं.
Astrocytes देर embryogenesis और प्रसव के बाद जीवन की शुरुआत के दौरान रेडियल glial कोशिकाओं (आरजी) से उत्पन्न. Astrocyte विनिर्देश के बाद हुआ है, astrocyte व्यापारियों उनके अंतिम पदों के लिए विस्थापित, जहां वे vivo में टर्मिनल भेदभाव की प्रक्रिया शुरू, astrocytes को जन्म के बाद तीन से चार सप्ताह में परिपक्व हो उनके ठेठ 18,19 आकारिकी द्वारा संकेत के रूप में दिखाई देते हैं. आरजी कोशिकाओं के एक subpopulation subventricular क्षेत्र astrocytes (प्रकार की कोशिकाओं बी) में परिवर्तित. बीoth आरजी, और प्रकार बी कोशिकाओं astrocyte की तरह विकास के दौरान और वयस्क में तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) के रूप में कार्य, क्रमशः. Astrocytes, आरजी, और प्रकार बी कोशिकाओं की तरह भी astrocyte विशिष्ट ग्लूटामेट (GLAST) ट्रांसपोर्टर, मस्तिष्क लिपिड बाध्यकारी प्रोटीन (BLBP), और GFAP व्यक्त, यह दर्शाता है कि विशेष रूप से इन मार्करों के लिए विशेष रूप से वयस्क astrocytes लेबल नहीं इस्तेमाल किया जा सकता है. वयस्क parenchymal astrocytes, जो स्वस्थ मस्तिष्क, आरजी, और प्रकार बी कोशिकाओं आत्म नवीकरण क्षमता के रूप में प्रदर्शनी स्टेम सेल संभावित विभाजन नहीं के विपरीत. Astrocytes की dysregulation कई विकृतियों में फंसा दिया गया अल्जाइमर रोग 20,21, हटिंगटन 22 रोग, पार्किंसंस रोग 23, 24 Rett सिंड्रोम और सिकंदर के रोग 25 सहित,. इसके अलावा, astrocytes सीएनएस के सभी अपमान के लिए प्रतिक्रिया, astrocyte सक्रियण और astrocytic glial निशान 16,26 गठन के लिए अग्रणी. astrocytic glial निशान कि निम्न मस्तिष्क tr रूपोंAUMA या रीढ़ की हड्डी में चोट के लिए प्रधानमंत्री neuronal उत्थान रोकने 15 बाधा माना जाता है.
विश्वसनीय तरीकों के विकास के लिए अलग और कोशिकाओं की आबादी शुद्ध बनाए रखने के तंत्रिका तंत्र के बारे में हमारी समझ के लिए अनिवार्य किया गया है. McCarthy और डी Vellis द्वारा अग्रणी काम तिथि जांचकर्ताओं नवजात चूहे के ऊतकों से 27 astrocytes के लगभग शुद्ध संस्कृतियों तैयार करने के लिए सक्षम बनाता है. बहुत astrocyte जीव विज्ञान का उपयोग कर इस विधि है, जो यहाँ माउस cortical astrocytes को अलग करने के लिए एक थोड़ा संशोधित रूप में प्रस्तुत किया जाता है के बारे में सीखा है. Vivo अध्ययन, astrocytes के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वातानुकूलित मध्यम प्राप्त इन विट्रो संस्कृति में वर्णित का उपयोग में पूरक, मूल्यवान आगे astrocyte कार्यों में अंतर्दृष्टि लाभ कर रहे हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ उल्लिखित विधि कृंतक नवजात दिमाग है, मूल रूप से 27 1980 में McCarthy और डी Vellis द्वारा वर्णित से astrocyte संस्कृति तैयारी पर आधारित है. प्रसवोत्तर P1 से P4 माउस मस्तिष्क में cortical astrocytes के अलगाव और संस्कृति का संशोधित व…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एसएस, शिक्षा और अनुसंधान के संघीय मंत्रालय KB और यूरोपीय आयोग FP7 PIRG08 GA-2010 २,७६,९८९ अनुदान, NEUREX (01 BMBF EO 0803), और जर्मन रिसर्च फाउंडेशन अनुदान 1442 / SCHA Fazit फाउंडेशन ग्रेजुएट फैलोशिप द्वारा समर्थित सीएस को 3-1 लेखकों परस्पर विरोधी कोई वित्तीय हित है.
Materials
| Name of working solution | Company | Catalogue number | Final concentration |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C |
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