Summary

マウス大脳皮質アストロサイトの単離および培養

Published: January 19, 2013
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Summary

アストロサイトは、脳の正常な発達と機能、および中枢神経系の修復に欠かせない基本的な生物学的プロセスに参加して多目的な細胞であると認識されてきた。ここでは、中枢神経系細胞のこの主要なクラスの生物学を研究するために純粋なマウスアストロサイトの培養液を得るための迅速な方法を提示します。

Abstract

アストロサイトは、哺乳類の脳に豊富に細胞型で、まだ多くのそれらの分子的および機能的特性について学んだことが残っている。 体外アストロサイト細胞培養系では詳細にこれらのグリア細胞の生物学的機能を研究するために使用することができます。このビデオプロトコルは仔マウスの混合皮質細胞の単離および培養により純粋アストロサイトを取得する方法を示します。法は生存ニューロンの欠如およびアストロサイト、オリゴデンドロサイトおよびミクログリア、文化の中枢神経系の3つの主要なグリア細胞集団の分離に基づいています。文化の最初の日中に代表的な画像は、混合細胞集団が存在することを実証し、アストロサイトがコンフルエントになるとミクログリア、オリゴデンドロサイトから分離する必要があるとき、時点を示しています。また、純度と十分に確立されたために免疫組織化学染色を用いて培養アストロサイトのアストロサイトの形態を示し、新たにアストロサイトのマーカーを説明した。この培養系は簡単に星状膠細胞生物学の様々な側面を研究するための純粋なマウスのアストロサイトおよびアストロサイト馴化培地を取得するために使用できます。

Introduction

アストロサイトは、中枢神経系(CNS)において非常に豊富な細胞型である。人間の大脳皮質のニューロン1あたり1.4アストロサイトが存在するのに対し、ニューロンへのアストロサイトの比率は、マウスおよびラットの大脳皮質で1:3である。アストロサイト機能に興味は近年劇的に増加している。アストロサイトの主な機能は、ニューロン2,3に構造的および代謝のサポートを提供する上で自らの役割である。アストロサイトのための新たに発見された役割は、機能の広いスペクトルをカバーしています。これらは、開発4月6日の間に開発の軸索と特定の神経芽細胞の遊走を誘導、シナプス伝達関数、神経回路7から9によるシナプス強度と情報処理、血液脳関門における役割(BBB)の形成10と整合性11月13日を含む脳血管トーン14と規制。アストロサイトのもう一つの大きな特徴は、傷害への応答です。 astrocyt病的条件下でES反応となり、さらに中間フィラメントグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)と抑制性細胞外マトリックス(ECM)タンパク質15,16の発現をアップレギュレートする。反応性アストロサイトは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)家族のアストロ分泌ECMタンパク質、CNS損傷15から17の後に軸索の再生を阻害する主要な要因の主に構成されていますグリア瘢痕を形成することによって、健康な組織から損傷部位の境界を定める。

アストロサイトは後期胚発生および出生後の早い時期に放射状グリア(RG)の細胞に由来する。アストロサイトの仕様が発生した後、アストロサイト前駆体は、彼らは終末分化のプロセスを開始し、最終的な位置に移動する。 生体内では 、アストロサイトは彼らの典型的な形態18,19によって示されるように3〜4週間、出生後成熟したように見える。 RGの細胞の亜集団は、脳室下帯のアストロサイト(タイプB細胞)に変換します。 BOTH、RGとB型細胞はそれぞれ、開発中および成人におけるアストロサイトのような神経幹細胞(NSC)として機能します。アストロサイトと同様に、RGとB型細胞はまた、これらのマーカーはもっぱら特に成人星状膠細胞を標識するために使用できないことを示す、アストロサイト特異的グルタミン酸トランスポーター(GLAST)、脳脂質結合タンパク質(BLBP)、およびGFAPを発現している。健康な脳、RGとB型細胞では分裂しない大人実質アストロサイトとは対照的に、自己再生する能力のような幹細胞の可能性を示す。アストロサイトの異常は、アルツハイマー病20,21、ハンチントン病22、パーキンソン病23、レット症候群24とアレキサンダー病25を含む、数多くの病態に関与している。また、アストロサイトはアストロサイトの活性化とアストログリア瘢痕形成16,26につながる、CNSのすべての侮辱に反応します。以下の脳trを形成アストロサイトグリア瘢痕アウマまたは脊髄損傷は、神経再生15を防止プライム障壁であると考えられている。

細胞の精製された集団を分離し、維持するための信頼できる方法の開発は、神経系の我々の理解に不可欠となっています。マッカーシーとde Vellisによる先駆的な仕事は、新生児ラット組織27からアストロサイトのほぼ純粋な培養物を調製するためにこれまでに研究者を可能にします。多くはマウス大脳皮質アストロサイトを単離するためのわずかに修正された形でここに提示され、この方法を用いて、星状膠細胞生物学を学んだされています。 in vivo試験、アストロサイトと同様にin vitro培養説明を使用して得られた馴化培地中で補完して、アストロサイト機能にさらなるゲイン洞察に貴重なツールです。

Protocol

1。混合皮質細胞の単離及びメッキ星状膠細胞の培養のための混合皮質細胞の分離は、P4の仔マウスにP1を用いて行うことができる。適切なアストロサイト密度を達成するためには、T75組織培養フラスコあたり4マウス子犬皮質を使用する必要があります。したがって、次のプロトコル内のボリュームは4仔マウスを用いた細胞調製のために計算される。 解剖の手順?…

Representative Results

完全なマウス脳( 図1A)、小脳、嗅球の分離の際( 図1B)が除去されなければならない。皮質は、マウス脳幹( 図1C)と個々の皮質( 図1D ')の髄膜の剥離し慎重に( 図1E)は削除されます。髄膜は、硬膜動脈系と髄膜の細胞や線維芽細胞による最終アストロサイト培養の汚染の除去が不完全の結果は明白です。 <p class="jov…

Discussion

ここに概説された方法は、もともと1980年に27マッカーシーとde Vellisによって記述げっ歯新生児の脳からアストロサイトの培養準備に基づいています。生後P1からP4をマウス脳に皮質星状膠細胞の分離と培養の変法は速いここに提示された、純粋な一次星状膠細胞を生み出す、再現性の高いです。この手法は、簡単にこのようなラットやブタ由来や脊髄などの他の脳領域からなどの他の?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

1442キロバイトと欧州委員会のFP7のグラントPIRG08-GA-2010から276989、NEUREX、そしてドイツ研究財団助成SCHAにSS、教育研究連邦省(BMBF 01 EO 0803)にFazit財団大学院フェローシップでサポートされている/ CS 3-1〜著者らは相反する経済的利益を持っていません。

Materials

Name of working solution Company Catalogue number Final concentration
Astrocyte culture media
DMEM, high glucose Life Technologies 31966-021
FBS, heat-inactivated Life Technologies 10082-147 Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122 Final Concentration: 1%
Solution for brain tissue digestion
HBSS Life Technologies 14170-088
2.5% Trypsin Life Technologies 15090-046 Final Concentration: 0.25%
Other
70% (vol/vol) ethanol Roth 9065.2
Poly-D-Lysine Millipore A-003-E 50 μg/ml
Water PAA S15-012 cell culture grade
PBS PAA H15-002 cell culture grade
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-062
0.45 μm Sterile filter Sartorius 16555
3.5 cm petri dish BD Falcon 353001
15 ml Falcon tube BD Falcon 352096
50 ml Falcon tube BD Falcon 352070
75 cm2 Tissue culture flask BD Falcon 353136
Forceps, fine Dumont 2-1032; 2-1033 # 3c; # 5
Forceps, flat tip KLS Martin 12-120-11
13 cm surgical scissors Aesculap BC-140-R
Stereomicroscope Leica MZ7.5
Stereomicroscope + Camera Leica MZ16F; DFC320
Microscope + Camera Zeiss; Canon Primo Vert; PowerShot A650 IS
Centrifuge Eppendorf 5805000.017 Centrifuge5804R
Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450
Water bath Julabo SW20; 37 °C

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Cite This Article
Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes. J. Vis. Exp. (71), e50079, doi:10.3791/50079 (2013).

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