Isolement et culture des astrocytes corticaux de souris
Summary
Les astrocytes ont été reconnus pour être des cellules polyvalentes qui participent au processus biologiques fondamentaux qui sont essentiels pour le développement normal du cerveau et la fonction, et réparation du système nerveux central. Nous présentons ici une procédure rapide afin d'obtenir des cultures pures astrocytes de souris pour étudier la biologie de cette classe importante de cellules du système nerveux central.
Abstract
Les astrocytes sont un type de cellule abondant dans le cerveau des mammifères, mais il reste beaucoup à apprendre sur leurs caractéristiques moléculaires et fonctionnelles. Astrocytes in vitro systèmes de culture cellulaire peut être utilisé pour étudier les fonctions biologiques de ces cellules gliales dans le détail. Ce protocole vidéo montre comment obtenir les astrocytes pures par l'isolement et la culture des cellules corticales mixtes de souriceaux. La méthode est basée sur l'absence de neurones viables et la séparation des astrocytes, les oligodendrocytes et les microglies, les trois principales populations de cellules gliales du système nerveux central, de la culture. Images représentatifs au cours des premiers jours de culture en évidence la présence d'une population cellulaire mixte et indiquer le point temporel, lorsque les astrocytes deviennent confluentes et ne doit être séparé de la microglie et les oligodendrocytes. De plus, nous démontrons la pureté et de la morphologie des astrocytes astrocytes en culture en utilisant des colorations immunocytochimiques pour bien établies etnouvellement décrit marqueurs astrocytaires. Ce système de culture peut être facilement utilisé pour obtenir des astrocytes de souris pures et astrocytes conditionné moyen pour étudier divers aspects de la biologie des astrocytes.
Introduction
Les astrocytes sont un type cellulaire très abondante dans le système nerveux central (SNC). Le ratio des astrocytes aux neurones est de 1:3 dans le cortex des souris et des rats, alors il ya 1,4 astrocytes par neurone dans le cortex humain 1. L'intérêt pour la fonction des astrocytes a augmenté de façon spectaculaire ces dernières années. Une des principales fonctions des astrocytes est leur rôle dans le soutien structural et métabolique des neurones 2,3. Rôles récemment découverts pour astrocytes couvrent un large éventail de fonctions. Il s'agit notamment de guidage de la migration des axones et des neuroblastes développement au cours du développement de certaines 4-6, fonctions de la transmission synaptique, la force des synapses et de traitement d'informations par des circuits neuronaux 7-9, les rôles de barrière hémato-encéphalique (BHE) formation 10 et 11-13 intégrité et la réglementation des 14 tonus cérébrovasculaire. Une autre caractéristique importante des astrocytes est leur réponse à une blessure. Sous astrocyt conditions pathologiqueses devenue plus réactive et augmentent l'expression de la protéine intermédiaire filament gliale fibrillaire acide (GFAP) et inhibiteurs de la matrice extracellulaire (ECM) 15,16 protéines. Astrocytes réactifs délimiter le site de la lésion des tissus sains en formant une cicatrice gliale, qui se compose principalement d'astrocytes protéines de la MEC sécrétées de la chondroïtine sulfate protéoglycanes (GCEP) de la famille, les principaux facteurs qui inhibent la régénération axonale après une lésion du SNC 15-17.
Les astrocytes proviennent gliales radiales (RG), les cellules lors de l'embryogenèse fin et au début de la vie postnatale. Après la spécification des astrocytes a eu lieu, précurseurs astrocytaires migrer vers leurs positions finales, où ils commencent le processus de différenciation terminale. In vivo, les astrocytes semblent être mature trois à quatre semaines après la naissance, comme indiqué par leur morphologie typique 18,19. Une sous-population de cellules RG convertir en zone sous-ventriculaire (astrocytes de type cellules B). Both, RG et les cellules de type B fonctionnent comme des astrocytes de type cellules souches neurales (NSC) au cours du développement et chez l'adulte, respectivement. Comme les astrocytes, cellules RG et de type B expriment également le transporteur du glutamate astrocytes spécifique (GLAST), le cerveau des lipides-binding protein (BLBP), et de la GFAP, ce qui indique que ces marqueurs ne peuvent pas être exclusivement utilisé pour marquer spécifiquement les astrocytes adultes. Contrairement aux adultes, les astrocytes parenchymateux, qui ne se divisent pas dans le cerveau, RG sain et cellules de type B présentent un potentiel de cellules souches telles que la capacité d'auto-renouvellement. Le dérèglement des astrocytes a été impliquée dans de nombreuses pathologies, y compris la maladie d'Alzheimer 20,21, la maladie de Huntington 22, la maladie de Parkinson 23, le syndrome de Rett 24 et la maladie d'Alexander 25. Par ailleurs, les astrocytes réagir à toutes les injures du système nerveux central, conduisant à l'activation des astrocytes et astrocytaire formation cicatrice gliale 16,26. La cicatrice gliale astrocytaire qui forme tr cerveau suivantelésions de la moelle épinière ou auma est considéré comme le principal obstacle empêchant la régénération neuronale 15.
Le développement de méthodes fiables d'isoler et de maintenir des populations purifiées de cellules a été essentielle à notre compréhension du système nerveux. Travaux pionniers de McCarthy et de Vellis permet aux enquêteurs à ce jour pour préparer des cultures d'astrocytes presque purs de tissu de rat nouveau-né 27. On a beaucoup appris sur la biologie des astrocytes en utilisant cette méthode, qui est présentée ici sous une forme légèrement modifiée pour isoler les astrocytes corticaux de souris. En complément des études in vivo, les astrocytes, ainsi que le milieu conditionné obtenu en utilisant le décrit la culture in vitro, sont des outils précieux pour mieux avoir un aperçu des fonctions astrocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici est basée sur la préparation des cultures d'astrocytes à partir de cerveaux de rongeurs nouveau-nés, initialement décrite par McCarthy et de Vellis en 1980 27. La méthode modifiée de l'isolement et la culture des astrocytes corticaux de P1 à P4 postnatal du cerveau de souris présentée ici est rapide, rendements pures astrocytes primaires et est hautement reproductible. Cette technique peut facilement être transférée à isoler les astrocytes à partir d'autres …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Soutenu par la Fondation de bourses d'études supérieures à Fazit SS, le ministère fédéral de l'Education et de la Recherche (BMBF 01 EO 0803) à Ko et la Commission européenne FP7 Grant PIRG08-GA-2010-276989, Neurex, et la fondation allemande de recherche Grant SCHA 1442 / 3-1 à CS Les auteurs n'ont pas de conflits d'intérêts financiers.
Materials
| Name of working solution | Company | Catalogue number | Final concentration |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C |
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