Astrocytter er blevet anerkendt for at være alsidige celler, der deltager i fundamentale biologiske processer, der er afgørende for normal hjernens udvikling og funktion, og det centrale nervesystem reparation. Her præsenterer vi en hurtig procedure for at opnå rene mus astrocyt kulturer at studere biologi af denne store klasse af centralnervesystemet celler.
Astrocytter er en rigelig celletype i den mammale hjerne, men er stadig meget at lære om deres molekylære og funktionelle egenskaber. In vitro astrocyt cellekultursystemer kan anvendes til at studere de biologiske funktioner af disse gliaceller i detaljer. Denne video protokol viser, hvordan til opnåelse af rene astrocytter efter isolering og dyrkning af blandede corticale celler af muse-unger. Fremgangsmåden er baseret på fravær af levedygtige neuroner og adskillelse af astrocytter, oligodendrocytter og mikroglia, de tre vigtigste glial cellepopulationer i centralnervesystemet, i kultur. Repræsentative billeder i de første dages dyrkning viser tilstedeværelse af en blandet cellepopulation og angiver tidspunkterne, når astrocytter bliver sammenflydende og skal adskilles fra mikroglia og oligodendrocytter. Desuden viser vi renhed og astrocytisk morfologi af dyrkede astrocytter anvender immuncytokemiske farvninger for veletableret ognyligt beskrevne astrocyt-markører. Dette dyrkningssystem kan let anvendes til opnåelse af rene murine astrocytter og astrocyt-konditioneret medium til undersøgelse af forskellige aspekter af astrocyt biologi.
Astrocytter er en meget rigelige celletype i centralnervesystemet (CNS). Forholdet mellem astrocytter til neuroner er 1:3 i cortex hos mus og rotter, mens der er 1,4 astrocytter pr neuron i den humane cortex 1. Interessen for astrocyt funktion er steget dramatisk i de seneste år. En vigtig funktion af astrocytter er deres rolle i at yde strukturel og metaboliske støtte til neuroner 2,3. Nyopdagede roller for astrocytter dækker et bredt spektrum af funktioner. Disse omfatter styre migrationen af udviklingslandene axoner og visse neuroblaster under udvikling 4-6, funktioner i synaptisk transmission, synapse styrke og informationsbehandling ved neurale kredsløb 7-9, roller i blod-hjerne-barrieren (BBB) formation 10 og integritet 11-13 og regulering af cerebrovaskulær tone 14. Et andet væsentligt træk ved astrocytter er deres respons på skade. Under patologiske betingelser astrocytes bliver reaktiv og yderligere opregulere ekspressionen af det intermediære filament glialt fibrillært surt protein (GFAP) og inhibitoriske ekstracellulær matrix (ECM) proteiner 15,16. Reaktive astrocytter afgrænse skaden site fra sundt væv ved at danne en glial ar, der hovedsagelig består af astrocyt secernerede ECM proteiner af chondroitinsulfat proteoglycan (CSPG) familie, de vigtigste faktorer, der hæmmer axonal regenerering efter skade på centralnervesystemet 15-17.
Astrocytter stammer fra radiale gliaceller (RG) celler under sen embryogenese og tidlig postnatal liv. Efter astrocyt specifikation har fundet sted, astrocyt-prækursorer migrerer til deres endelige positioner, hvor de begynder processen med terminal differentiering. In vivo, astrocytter synes at være modne tre til fire uger efter fødslen som angivet ved deres typiske morfologi 18,19. En subpopulation af RG celler konverterer til subventricular zone astrocytter (type B-celler). Both, RG-og type B-celler fungere som astrocyt-lignende neurale stamceller (NSC) under udvikling og i den voksne hhv. Ligesom astrocytter, RG-og type B-celler endvidere udtrykker astrocyt-specifikke glutamat transportør (GLAST), hjerne-lipid-bindende protein (BLBP), og GFAP, hvilket indikerer, at disse markører ikke kan udelukkende anvendes til specifikt mærke voksne astrocytter. I modsætning til voksne parenchymale astrocytter, som ikke deler i den sunde hjerne, RG og type B-celler udviser stamceller potentiale såsom evnen til selv at forny. Dysregulering af astrocytter er blevet impliceret i adskillige patologier, herunder Alzheimers sygdom 20,21, Huntingtons sygdom 22, Parkinsons sygdom 23, Rett syndrome 24 og Alexander sygdom 25. Endvidere astrocytter reagere på alle fornærmelser i CNS, hvilket fører til astrocyt aktivering og astrocytisk glial ardannelse 16,26. Den astrocytisk glial ar, der danner således hjerne trAUMA eller rygmarvsskade menes at være den primære barriere for neuronal regenerering 15.
Udviklingen af pålidelige metoder til at isolere og vedligeholde oprensede populationer af celler har været afgørende for vores forståelse af nervesystemet. Banebrydende forskning fra McCarthy og de Vellis giver efterforskerne til dato for at forberede næsten rene kulturer af astrocytter fra neonatal rotte væv 27. Meget er blevet lært om astrocyt biologi ved hjælp af denne metode, som præsenteres her i en let ændret form til isolering af muse corticale astrocytter. Som supplement in vivo-undersøgelser, astrocytter og konditioneret medium opnås ved hjælp af den beskrevne in vitro-dyrkning, er værdifulde værktøjer til yderligere at få indsigt i astrocyt-funktioner.
Fremgangsmåden beskrevet her er baseret på astrocyt kulturpræparat fra gnaver neonatale hjerner, som oprindeligt beskrevet af McCarthy og de Vellis i 1980 27. Den modificerede fremgangsmåde til isolering og dyrkning af corticale astrocytter fra postnatal P1 til P4 musehjerne præsenteret her er hurtig, udbytter rene primære astrocytter og er yderst reproducerbar. Denne teknik kan let overføres til isolering astrocytter fra andre arter, såsom fra rotte eller gris og fra andre hjerneregioner, såso…
The authors have nothing to disclose.
Støttet af Fazit Foundation Graduate stipendium til SS, Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (BMBF 01 EO 0803) til KB og Europa-Kommissionen FP7 Grant PIRG08-GA-2010 til 276.989, NEUREX, og den tyske Research Foundation Grant SCHA 1442 / 3-1 til CS Forfatterne har ingen modstridende økonomiske interesser.
Name of working solution | Company | Catalogue number | Final concentration |
Astrocyte culture media | |||
DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
Solution for brain tissue digestion | |||
HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
Other | |||
70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
Water bath | Julabo | SW20; 37 °C |