Astrocytes har blitt anerkjent for å være allsidige celler som deltar i grunnleggende biologiske prosesser som er avgjørende for normal utvikling av hjernen og funksjon, og det sentrale nervesystemet reparasjon. Her presenterer vi en rask prosedyre for å få rene mus astrocyte kulturer å studere biologi denne store klassen av sentralnervesystemet celler.
Astrocytes er et rikt celletype i hjernen hos pattedyr, men mye gjenstår å lære om deres molekylære og funksjonelle egenskaper. In vitro astrocyte cellekultur-systemer kan brukes til å studere de biologiske funksjonene til disse gliacellene i detalj. Denne videoen protokollen viser hvordan du kan få rene astrocytes av isolering og kultur av blandede kortikale celler av mus valper. Metoden er basert på fravær av levedyktige nevroner og utskillelse av astrocytes, oligodendrocytes og microglia, de tre viktigste glial cellepopulasjoner av det sentrale nervesystemet, i kultur. Representative bilder under de første dagene av kultur påvise en blandet cellepopulasjon og indikere endepunktet, når astrocytes blir sammenflytende og skal skilles fra microglia og oligodendrocytes. Videre viser vi renhet og astrocytic morfologi dyrkede astrocytes bruker immuncytokjemisk stainings for godt etablert ognylig beskrevet astrocyte markører. Denne kulturen system lett kan brukes til å oppnå rene mus astrocytes og astrocyte klimaanlegg medium for å studere ulike aspekter av astrocyte biologi.
Astrocytes er en meget rikelig celletype i sentralnervesystemet (CNS). Forholdet mellom astrocytes til nevroner er 01:03 i cortex av mus og rotter, mens det er 1,4 astrocytes per nervecelle i den menneskelige cortex en. Interessen for astrocyte funksjon har økt dramatisk de siste årene. En viktig funksjon av astrocytes er deres rolle i å gi strukturell og metabolsk støtte til nevroner 2,3. Nyoppdagede roller for astrocytes dekker et bredt spekter av funksjoner. Disse inkluderer guiding migrering av utviklingsland axoner og visse neuroblasts under utvikling 4-6, funksjoner i synaptisk transmisjon, synapse styrke og informasjonsbehandling ved nevrale kretser 7-9, roller i blod-hjerne-barrieren (BBB) formasjon 10 og integritet 11-13 og regulering av den cerebrovaskulære tonen 14. En annen viktig funksjon i astrocytes er deres respons på skade. Under patologiske tilstander astrocytes bli reaktive og ytterligere oppregulere uttrykk for den mellomliggende filament glial fibrillary surt protein (GFAP) og hemmende ekstracellulære matrix (ECM) proteiner 15,16. Avgrense reaktive astrocytes skaden området fra friskt vev ved å danne en glial arr, som består hovedsakelig av astrocyte skilles ECM proteiner av chondroitin sulfat proteoglykan (CSPG) familie, de viktigste faktorene som hemmer aksonal regenerasjon etter CNS skade 15-17.
Astrocytes stammer fra radial glial (RG) celler i slutten embryogenese og tidlig postnatal liv. Etter astrocyte spesifikasjonen har skjedd, astrocyte forløpere migrere til sine endelige posisjoner, hvor de begynner prosessen med terminal differensiering. In vivo, astrocytes synes å være moden tre til fire uker etter fødselen som indikert av sine typiske morfologi 18,19. En undergruppe av RG celler konvertere til subventricular sone astrocytes (type B-celler). Both, RG og type B-celler fungere som astrocyte-lignende nevrale stamceller (NSCs) under utvikling og i den voksne, henholdsvis. Som astrocytes, RG og type B-celler også uttrykke astrocyte-spesifikke glutamat transporter (GLAST), hjernen lipid-bindende protein (BLBP), og GFAP, noe som indikerer at disse markørene kan ikke bare brukes til å spesifikt merke voksne astrocytes. I motsetning til voksne parenkymatøs astrocytes, som ikke deler i sunn hjerne, RG og type B celler utstillingen stamcelle potensial slik som evnen til å selv fornye. Feilregulering astrocytes har blitt implisert i en rekke patologier, inkludert Alzheimers sykdom 20,21, Huntingtons sykdom 22, Parkinsons sykdom 23, Retts syndrom 24 og Alexander sykdom 25. Videre astrocytes reagere på alle fornærmelser i CNS, noe som fører til aktivering og astrocyte astrocytic glial arrdannelse 16,26. Den astrocytic glial arr som danner følgende hjernen trAUMA eller ryggmargsskade er tenkt å være den viktigste barrieren hindrer neuronal regenerasjon 15.
Å utvikle pålitelige metoder for å isolere og vedlikeholde rensede populasjoner av celler har vært avgjørende for vår forståelse av nervesystemet. Pionerarbeid av McCarthy og de Vellis gjør etterforskere til dato for å forberede nesten rene kulturer av astrocytes fra neonatal rotte vev 27. Mye har blitt lært om astrocyte biologi ved hjelp av denne metoden, som er presentert her i en litt modifisert form for isolering mus kortikale astrocytes. Supplerer in vivo studier, astrocytes samt betinget medium oppnådd ved hjelp av den beskrevne in vitro kultur, er verdifulle verktøy for å ytterligere få innsikt i astrocyte funksjoner.
Metoden beskrevet her er basert på den astrocyte kultur forberedelse fra gnagere neonatal hjerner, opprinnelig beskrevet av McCarthy og de Vellis i 1980 27. Den modifiserte metode for isolering og kultur av kortikale astrocytes fra postnatal P1 til P4 mus hjernen som presenteres her er rask, avkastning rene primære astrocytes og er reproduserbar. Denne teknikken kan enkelt overføres til isolere astrocytes fra andre arter, for eksempel fra rotte eller gris og fra andre hjerneregioner som ryggmargen. M…
The authors have nothing to disclose.
Støttes av Fazit Foundation Graduate Fellowship til SS, Federal Utdannings-og forskningsdepartementet (BMBF 01 EO 0803) til KB og Europakommisjonen FP7 Grant PIRG08-GA-2010-276989, NEUREX, og den tyske Research Foundation Grant SCHA 1442 / 3-1 til CS Forfatterne har ingen motstridende økonomiske interesser.
Name of working solution | Company | Catalogue number | Final concentration |
Astrocyte culture media | |||
DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
Solution for brain tissue digestion | |||
HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
Other | |||
70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
Water bath | Julabo | SW20; 37 °C |