Summary

Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit<em> Plasmodium berghei</em> ANKA-geïnfecteerde muizen

Published: January 02, 2013
doi:

Summary

Werkwijze voor isolatie van hechtende inflammatoire leukocyten uit hersenen bloedvaten<em> Plasmodium berghei</em> ANKA-geïnfecteerde muizen beschreven. De werkwijze maakt kwantificering en fenotypische karakterisatie van leukocyten geïsoleerd na kleuring met fluorescente antilichamen en daaropvolgende analyse door flowcytometrie.

Abstract

We beschrijven een werkwijze voor isolatie en karakterisering van hechtende ontstekingscellen uit hersenen bloedvaten P. berghei ANKA-geïnfecteerde muizen. Infectie van gevoelige muizen-stammen met deze parasiet stam resulteert in de inductie van experimentele cerebrale malaria, een neurologisch syndroom dat recapituleert bepaalde belangrijke aspecten van Plasmodium falciparum-gemedieerde ernstige malaria in mensen 1,2. Rijpe vormen van bloed-stage malaria expressie parasitaire eiwitten op het oppervlak van de geïnfecteerde erythrocyten, waardoor ze binden aan vasculaire endotheelcellen. Dit proces leidt tot verstoppingen in de bloedstroom, wat resulteert in hypoxie en bloedingen 3 en stimuleert ook de werving van inflammatoire leukocyten naar de plaats van parasiet vastlegging.

In tegenstelling tot andere infecties, zoals virussen neutrotopic 4-6, zowel malaria-geparasiteerde rode bloedcellen (PRBC) en geassocieerde InflammAtory leukocyten blijven afgezonderd binnen de bloedvaten in plaats van te infiltreren in de hersenen parenchym. Dus om contaminatie van afgezonderd leukocyten met niet-inflammatoire circulerende cellen, uitgebreide intracardiale perfusie van geïnfecteerde-muizen voorafgaand aan orgaanextractie en weefsel verwerking wordt verontreinigd is nodig in deze procedure om het bloed compartiment te verwijderen. Na perfusie, zijn hersenen geoogst en ontleed in kleine stukjes. De weefselstructuur wordt verder verstoord door enzymatische behandeling met collagenase en D DNAse I. De resulterende hersenhomogenaat wordt vervolgens gecentrifugeerd op een Percoll-gradiënt die scheiding van hersenen gesekwestreerde leukocyten (BSL) van myeline en andere weefselafval maakt. Geïsoleerde cellen worden vervolgens gewassen, geteld met een hemocytometer en gekleurd met fluorescente antilichamen voor verdere analyse door flowcytometrie.

Deze procedure maakt uitgebreide fenotypische karakterisatie van inflammatoire leukocyten migreren naar de hersenen in rereactie op verschillende stimuli, waaronder beroerte alsook virale of parasitaire infecties. De werkwijze verschaft ook nuttig voor het beoordelen van nieuwe anti-inflammatoire behandelingen in preklinische diermodellen.

Protocol

1. Infectie van muizen met P. berghei-ANKA Ontdooi een portie van gecryopreserveerde P. berghei ANKA PRBC. Juist remmen cerebrale malaria-resistente BALB / c donor muis (8-12 weken oud) met de twee handen beperking techniek. Injecteer muis met 100-200 pi PRBC met een 1 ml insulinespuit (28G naald). Routinematig, 1-2 donormuizen geïnjecteerd. Op de dagen 4 tot 5 na infectie (pi) te verwijderen donor muis van kooi en plaats het op een werkstation of een wegwerp werkende pa…

Representative Results

De resultaten in Fig. 2 tonen percentages en absolute aantallen van de verschillende BSL populaties hersteld van hersenen van geperfundeerde of unperfused malaria geïnfecteerde en naïef controle muizen. BSL geïsoleerd werden gekleurd met PE-anti-NK1.1 en APC-anti-TCR-β antilichamen zoals aangegeven in de tekst Protocol. Consistent met eerdere bevindingen 7-9, αβTCR + T-cellen bestaat een groot deel van de BSL pool in hersenen van geperfundeerde malaria geïnfecteerde muizen (dag 6 pi). Deze p…

Discussion

De isolatie en analyse van BSL is een methode die karakterisering en kwantificering van inflammatoire cellen migreren naar de hersenen in reactie op weefselbeschadiging of infectie in experimentele muismodellen maakt. De invoering van een intracardiale perfusie stap voor het verwijderen van het bloedcompartiment voor orgaanextractie en latere celisolatie is nuttig om contaminatie van inflammatoire cellen met niet-inflammatoire circulerende leukocyten voorkomen. Dit is misschien niet een essentiële vereiste in neurotrop…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen graag Miss Liana Mackiewicz bedanken voor technische bijstand. Dit werk werd mogelijk gemaakt door Victoriaanse Overheid van de Staat Operationele Infrastructuur Support en Australische regering National Health en Medical Research Council IRIISS en Project Grant 1031212.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Solutions and buffers
Giemsa’s azur eosin methylene blue solution Merck Millipore 1.09204.0500 1:10 dilution in distilled water
RPMI medium Mouse tonicity
Mouse tonicity PBS 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3
0.4%Trypan Blue Sigma Aldrich T-8154 1:2 dilution
Collagenase D Worthington Biochemical
Deoxyribonuclease (DNAse) I Sigma Aldrich D4263-5VL From bovine pancreas
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 30% solution in PBS
Ultrapure Tris Invitrogen 15505-020
Ammonium Chloride (NH4Cl) AnalaR 10017
Red Cell Lysis Buffer 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2
FCS Gibco 1009
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1M, pH 7.2
Antibodies and conjugates
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 BD Pharmingen 553142 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml)
FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 BD Pharmingen 553651
PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 BD Pharmingen 553165
PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 BD Pharmingen 551162
APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 BD Pharmingen 553174
PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 R&D Systems FAB1685P
Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 BD Pharmingen 559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 551419
Equipment and material
SuperFrost microscope slide Lomb Menzel-Gläser
Dissection forceps, scissors REDA Instrumente
500 ml PBS reservoir Nalgene
Rubber tubing
23G needle BD PrecisionGlide 302008
Cell dissociation kit containing metal sieve Sigma Aldrich CD-1
70 μm nylon cell strainer BD Falcon 352350
Hemocytometer GmbH Neubauer 717810
Flow cytometry tubes BD Falcon 352008

References

  1. Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
  2. Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
  3. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
  4. Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
  5. LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
  6. Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
  7. Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
  8. Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
  9. Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
  10. Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
  11. Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
  12. Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
  13. Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
  14. Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).

Play Video

Cite This Article
Ryg-Cornejo, V., Ioannidis, L. J., Hansen, D. S. Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice. J. Vis. Exp. (71), e50112, doi:10.3791/50112 (2013).

View Video