Summary
Метод выделения приверженцем воспалительных лейкоцитов из мозга кровеносных сосудов
Abstract
Мы описываем метод выделения и характеристика приверженцем воспалительных клеток из мозга кровеносных сосудов P. berghei ANKA-инфицированных мышей. Заражение восприимчивых мыши штаммов с этим паразитом результаты напряжение в индукционной экспериментальной церебральной малярии, неврологического синдрома, который повторяет некоторые важные аспекты Plasmodium тропической опосредованной тяжелой малярии в 1,2 человека. Зрелые формы крови стадии малярии выразить паразитарных белков на поверхности зараженных эритроцитов, что позволяет им связываться с сосудистых эндотелиальных клеток. Этот процесс вызывает препятствия в кровоток, что приводит к гипоксии и кровоизлияния 3, а также стимулирует набора воспалительных лейкоцитов к месту паразита углерода.
В отличие от других инфекций, т.е. neutrotopic вирусы 4-6, как малярия зараженных эритроцитов (PRBC), а также связанные InflammAtory лейкоцитов оставаться поглощенным в кровеносных сосудах, а не проникают в паренхиму мозга. Таким образом, чтобы избежать загрязнения поглощенных лейкоцитами с невоспалительные циркулирующих клеток, обширная внутрисердечной перфузии зараженных мышей до извлечения органов и тканей, обработка требуется в этой процедуре, чтобы удалить кровь отсека. После перфузии мозга собирают и расчлененные на мелкие кусочки. Структуры тканей в дальнейшем нарушается ферментативной обработки с коллагеназы D и ДНКазы I. В результате мозг гомогенат центрифугировали в градиенте Percoll, который позволяет разделение мозга секвестрированных лейкоцитов (BSL) из миелина и другим мусором ткани. Изолированные клетки затем промывают, рассчитывали с использованием гемоцитометр и окрашенных флуоресцирующих антител для последующего анализа методом проточной цитометрии.
Эта процедура позволяет комплексно фенотипическая характеристика воспалительных лейкоцитов мигрируют в мозг, в реответа на различные раздражители, в том числе инсульта, а также вирусных и паразитарных инфекций. Этот метод также является полезным инструментом для оценки романа противовоспалительное лечение в доклинических моделях животных.
Protocol
1. Заражение мышей с P. berghei-ANKA
- Размораживание аликвоты криоконсервированных P. berghei ANKA PRBC.
- Сдерживать церебральной малярии, устойчивых BALB / с донорами мышь (8-12 недель от роду) с помощью двуручной сдержанность техники. Inject мыши с 100-200 мкл PRBC использованием 1 мл инсулиновый шприц (игла 28G). Регулярно, 1-2 мышей-доноров вводят.
- На 4-5 дней после заражения (PI) удалить доноров мыши из клетки и поместить его на рабочую станцию или одноразовой рабочей площадки.
- Аккуратно сдерживать мыши к концу хвоста и с помощью небольших ножниц разрезать кончик хвоста (около 1 мм). Кроме того, небольшой прокол хвост использованием 25 G игла может быть выполнена.
- Поместите каплю крови из хвостовой вены мыши ближе к концу матового конца микроскопа.
- Поместите второй слайд (распределитель) на угол 45 ° и обратно его в каплю крови. Как только кровь распространяется по краю, нажмите на разбрасыватель-слайд наканунеолько через стекло микроскопа, чтобы сделать мазок крови. Разрешить мазка высохнуть на воздухе.
- Исправить мазках крови в 100% метаноле в течение 30 секунд, после чего пятно слайды в свежеприготовленный Гимза в течение 10 мин.
- Промыть мазок крови с проточной водой в течение 1 мин, позволяют воздушно-сухой и изучить слайд под микроскопом (100х, масло погружение). Перечислить PRBC в пределах 1000 эритроцитов и вычислить процент паразитемии. Донор мышей должна достичь уровня паразитемии между 2.5-5%, прежде чем они могут быть кровь для заражения экспериментальных животных.
- Сбор крови от донора мышь ретроорбитального кровотечение использованием гепаринизированной микрогематокритовых капиллярной трубке. Все эксперименты проводятся в соответствии с Уолтером и Элизы зале института животных этики требования комитета. В зависимости от местных требований этики животных Комитета другие процедуры кровотечения могут быть использованы. Растворите необходимое количество крови в среде RPMI в конечной концентрации 1x10 6 pRBC/0.2 мл. Считают, чтонормальный гематокрит мышь ~ 6x10 9 красных кровяных клеток / 1 мл.
- Infect экспериментальных мышей C57BL / 6 (8-12 недель) путем введения внутрибрюшинно (IP) 1x10 6 pRBC/0.2 мл.
- Для контроля уровня паразитемии зараженных мышей выполните шаги 1.3-1.8. Паразитемии должны определяться каждые 2-3 дней, начиная с дня 2 или 3 пи
- Возникновение тяжелых форм малярии в C57BL / 6, может проявляться в виде сгорбленной внешний вид, гривистый меха и низкой активности. Некоторые мыши могут восстановиться на этой стадии, но прогресс в потере чувства собственного рефлекса указывает необратимые заболевания и животные должны быть умерщвлены.
2. Внутрисердечной перфузии мозга мышей и добыча
- Соберите эксплуатации системы перфузии тяжести, обеспечивая 500 мл резервуар колонки держатель крепится к верхней части 60 см колонки стенде. Подключите пластиковые трубы в нижней части водохранилища и обеспечить трубки зажим для управления буфером потока. Прикрепите трубки к 23-игла G. Фильл до резервуара с PBS (хранится при температуре 22 ° C), откройте зажим и позволяют буфера проходят через трубку, чтобы удалить все пузырьки воздуха.
- Усыпить P. berghei ANKA-инфицированные мыши, CO 2 ингаляции. Подтверждение смерти из-за отсутствия педали, орбитальных и дыхательных реакций.
- Pin эвтаназии мыши, задние и передние лапы сверху на доску из пенопласта рассечение, содержащиеся в пластиковый лоток. В зависимости от местной анестезии животных этика комитет требования могут быть введены до начала внутрисердечной pefusion.
- Протрите брюшной стороне с 70% этанола.
- Используйте большие ножницы и щипцы, чтобы открыть кожу вдоль средней линии, чтобы разоблачить грудной полости. Fold и контактный кожи в стороны.
- Держите грудины с тонким пинцетом и сократить диафрагму и по обе стороны от грудины, отделяя ребра. Будьте осторожны, чтобы не повредить крупные кровеносные сосуды.
- Pin грудной клетки от грудины свободно рядом с головой.
- Держите желудочков остроумиеч штраф пинцетом и аккуратно надрезать правого предсердия с мелкими ножницами.
- Вставьте 23G иглой тяжести системы перфузии в левом желудочке к восходящей аорты в то время как PBS работает. Вставьте всего 0,5 см от кончика иглы.
- Заливать мыши в течение 5 мин или пока стоков ясно.
- Изъять мыши и положить его на свой живот. Протрите головой с 70% этанола.
- Использование больших ножниц, сделать разрез чуть выше шейного отдела спинного области мозга.
- Использование тонких ножниц, чтобы средний хвостовой-ростральной разрез, начиная с основания черепа и очистить кожу от разоблачить черепа.
- Держа голову, поместить лопасти маленькие ножницы в каждой орбитальной полости и сделать разрез между орбитами.
- Сделайте продольный разрез вдоль сагиттального шва и тщательно очистить череп на каждого полушария мозга наружу.
- Используя лопаточку, осторожно поднимите мозга и поместить его в 10 мл центрифужную пробирку, содержащую RPMI среде.
3. Выделение Brain-секвестрированных Лейкоциты (BSL)
- Работая в безопасности кабинета, место свежесобранных мозг на верхней части фильтра из нержавеющей стали клетки (40-60 размер ячейки) в чашку Петри, содержащую 3-5 мл RPMI среде тканевой культуры.
- Отрежьте ткань мозга на мелкие кусочки.
- Нажмите небольшие кусочки ткани мозга через ячейку фильтра использованием плунжера кристалла.
- Передача гомогената мозга в 10 мл трубки и центрифуги при 250 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
- Растворить осадок в 3 мл среды RPMI, содержащей 0,05% коллагеназы D и 2U/ml ДНКазы I.
- Поверните смесь в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалите остатки клеток, нажав на смесь через 70 мкм нейлоновый фильтр клеток и / или путем инкубации на льду в течение 5 мин.
- Положите гомогената мозга на 7 мл 30% подушке Percoll и центрифуге при 400 х г (без тормозов) в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют осадок в 1 мл красного буфера для лизиса клеток крови и инкубируют на льду в течение 5 минлизировать приверженцем PRBC, которые не могут быть удалены из мозга внутрисердечной перфузии.
- Добавить 9 мл среды RPMI, мыть клетки и центрифуги при 250 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
- Ресуспендируют BSL-содержащих гранулы в 50-100 мкл RPMI среде и передачи клеткам трубки Эппендорф.
- Развести 5-10 мкл аликвоты образец клеток 1:2 в трипанового синего для идентификации жизнеспособных клеток.
- Граф жизнеспособных клеток под микроскопом, используя гемоцитометра. Из 6-й день пи года, когда П. berghei ANKA-инфицированные мыши обнаруживают неврологические симптомы, 20,000-100,000 BSLs могут быть восстановлены.
4. Иммунофенотипирование из BSL по многоцветной проточной цитометрии
- Центрифуга клетки при 250 х г в течение 10 мин при 4 ° C, аспирации супернатант и ресуспендируют осадок в 50 мкл окрашивания буфера (PBS, 1% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 2 мм EDTA).
- Добавить 1 мкл очищенного anti-CD16/32 антител (Fcblock).
- Инкубировать клетки в течение 10 мин на льду.
- Вымойте клеток в 1 мл буфера окрашивания. Центрифуга клетки при 250 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и аспирации супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 50 мкл буфера, содержащего Окрашивание заранее определенного оптимального разведения необходимые флуоресцирующих антител, т. е. анти-CD4, анти-CD8, анти-TCR и анти-NK1.1.
- Выдержите в течение 1 часа на льду.
- Вымойте клеток в 1 мл буфера окрашивания. Центрифуга клетки при 250 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и аспирации супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл PBS.
- Передача клетки пластиковой трубки проточной цитометрии.
- С помощью проточной цитометрии, приобретают по крайней мере 5,000-10,000 событий. Соответствующие неокрашенных контроль клетку и флуорохромом образцов компенсации должны быть включены по мере необходимости.
- Анализ результатов с помощью соответствующего программного обеспечения проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты на рис. 2 показывают проценты и абсолютные числа различных BSL населения оправился от мозгов перфузии или unperfused-инфицированных малярией и наивно контрольных мышей. Изолированные BSL окрашивали PE-анти-NK1.1 и APC-анти-TCR-β антитела, как указано в тексте Протокола. В соответствии с предыдущими выводами 7-9, αβTCR + Т-клеток состоят высокая доля BSL бассейн в мозгах перфузируемой малярия-инфицированных мышей (6-й день PI). Это население оказалось значительно недостаточно представлены в мозгах, не перфузии животных (рис. 2A-B). Очевидное снижение частоты T ячейки в не-перфузии мозга была связана со значительно более высокий процент и общее количество двойных негативных клеток (αβTCR - NK1.1 -) у этих животных (рис. 2A-B). Высокий процент и номера на двойное отрицание клеток в unperfused мозги были не только обнаружены в малярия-инфицированных мышей, но и в па-МЕмл; ве управления, предполагая, что эти клетки не являются воспалительные лейкоцитов, присутствующих в мозгу кровеносных сосудов, которые извлекаются вместе с воспалительными клетками, если внутрисердечной перфузии не выполняется.
Еще два примера BSL анализа показаны на рис. 3 и рис. 4. Короче говоря, C57BL / 6 мышей, инфицированных P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Временные связи между лейкоцитов в мозг и возникновению неврологических симптомов (от 6-8 дней PI) были продемонстрированы в P. berghei ANKA инфицированных мышей 7-9. В этом конкретном примере, малярия-инфицированных мышей умерщвляли на 6 день пи, и BSL очищали, как описано в тексте Протокола. Изолированные BSL окрашивали PE-анти-NK1.1, APC-анти-TCR-β, FITC анти-CD4 и PerCPCy5.5-анти-CD8α антител. Образцы были получены с помощью BD Biosciences FACSCalibur цитометра и анализ осуществляется с помощью Weasel 3.0.1 программного обеспечения. ЧерезBLE клетки закрытого по вперед и в стороны разбегаются. Проценты НК-клеток, Т-лимфоцитов и NKT клеток (TCR NK1.1 + + клеток), накопленные в мозгу наивным и малярия-инфицированных мышей (6-й день пи) указаны в верхней панели (рис. 3А). В нижней панели показывают процент CD4 + и CD8 + Т-лимфоцитов среди закрытых NK1.1 - αβTCR + клеток (рис. 3А). Рис. 3В показан пример, в котором абсолютное количество CD4 + и CD8 + мозг секвестрированных Т-клетки были рассчитаны на 6 день пи с П. berghei ANKA. В общем, 20,000-100,000 BSL могут быть восстановлены из мозгов P. berghei ANKA инфицированных мышей. Несколько факторов, таких как время пи, подверженность деформации мыши или включение противовоспалительного лечения может повлиять на восстановление клеток. Регулярно, один индивидуальный мозг дает достаточно клеток для 1 комплект антител окрашивания.
В примере, приведенном в Fiг. 4 использование хемокинов рецептор мозга секвестрированных Т-лимфоциты были проанализированы. Мышей, инфицированных P. berghei ANKA и BSL были выделены на 6 день пи клетки окрашивали APC-анти-TCR-β, PE-анти-CXCR3 и биотинилированного анти-CCR5 антитела, с последующей инкубацией с стрептавидин-PerCPCy5.5 сопряжены. Образцы были получены и проанализированы как на рис. 3. Гистограммы представляют собой процент клеток αβTCR + среди общего BSL в борьбе с малярией-инфицированных и наивно контрольных мышей. Контур участка в средней и нижней панелях показывают процент CXCR3 + и CCR5 + клеток в закрытом αβTCR + клеток.
Рисунок 1. Блок-схема процедуры выделения и анализа BSLот Р. berghei ANKA-инфицированных мышей. (1) cryopreseved аликвоты P. berghei ANKA PRBC размораживают и 1 или 2 мышей-доноров инфицированы. (2) Четыре дня спустя parsitemia уровней доноров мышам рассчитывается, донорских мышей кровь и кровь разведения подготовлены для заражения подопытных мышей. Малярийной инфекции затем устанавливается в тяжелой малярии восприимчивых мышей C57BL / 6. (3) В дни 5-7 р, мышей усыпляют СО 2 вдоха и сразу intracardially перфузии, чтобы удалить все циркулирующие не соблюдают клеток. (4) Мозги затем собирают и гомогената мозга подготовленный переваривание тканей с коллагеназы D и ДНКазы I. BSL отделяются от миелина и остатков клеток по градиенту Percoll. (5) Осажденный BSL затем промывают, подсчитывали с помощью гемоцитометра, окрашенных флуоресцирующих антител и анализировали с помощью проточной цитометрии.
Рисунок 2. BSL анализа в мозге перфузии или unperfused мышей. C57BL / 6 мышей, инфицированных P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Мозги были собраны на 6 день пи от перфузии или unperfused животных. BSL были изолированы, окрашивали анти-NK1.1 и анти-TCR флуоресцирующих антител и анализировали с помощью проточной цитометрии. (A) Dot участки изображают процент NK клетки, Т-лимфоциты, NK1.1 + TCR + клеток и двойные негативные клетки NK1.1 - TCR - в перфузии (верхняя панель) или unperfused (нижняя панель) малярия-инфицированных и наивно контрольных мышей . (B) абсолютное число двойных негативных клеток и Т-лимфоцитов и был рассчитан на 6 день пи с П. berghei ANKA и наивно контрольных мышей. Каждый бар represeНТС среднем 3 пробы ± SEM, * р> 0,05.
Рисунок 3. NK-клетки и Т-лимфоцитов могут быть обнаружены в мозге P. berghei ANKA инфицированных мышей. C57BL / 6 мышей, инфицированных P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Мозги были извлечены на 6 день после пи перфузии эвтаназии животных. BSL были изолированы, окрашивали анти-NK1.1, анти-TCR, анти-CD4 и анти-CD8 флуоресцирующих антител и анализировали с помощью проточной цитометрии. (А) верхней панели изображают процент NK клеток, Т-лимфоцитов и NK1.1 + TCR + клеток в борьбе с малярией-инфицированных и наивно контрольных мышей. Нижняя панель иллюстрирует процент CD4 + и CD8 + Т-клеток в закрытом αβTCR + NK1.1 - (B) абсолютное число мозга секвестрированных CD4 + и CD8 + Т-клеток был рассчитан на 6 день пи с П. berghei ANKA и наивно контрольных мышей. Каждая панель представляет собой среднее из 3 образцов ± SEM.
Рисунок 4. Большинство Т-лимфоциты мигрируют в мозг в ответ на тяжелые инфекции малярии выражают рецептор хемокинов CXCR3. C57BL / 6 мышей, инфицированных P. berghei ANKA (1x10 6 PRBC). Мозги были извлечены на 6 день после обширного пи перфузии эвтаназии животных. BSL были изолированы, окрашивали анти-TCR, анти-CXCR3 и анти-CCR5 антитела и анализировали с помощью проточной цитометрии. Лучшие панелей изображают проценты αβT лимфоцитов в борьбе с малярией-инфицированных и наивно контрольных мышей. Контурные графики иллюстрируют проценты CXCR3 + (середина панели) и CCR5 + (нижняя панель) клеток в закрытом + лимфоцитов αβTCR.
| Проблема | Поиск и устранение неисправностей |
| Неполное перфузии |
|
| Не хватает BSL восстановился |
|
Таблица 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выделения и анализа BSL это метод, который позволяет характеристика и количественная воспалительных клеток мигрируют в мозг в ответ на повреждение ткани или инфекции в экспериментальной модели мышей. Введение внутрисердечной шаг перфузии для удаления крови отсека до извлечения органов и последующего выделения ячейки полезно для предотвращения загрязнения воспалительных клеток с невоспалительные циркулирующих лейкоцитов. Это не может быть основным требованием в нейротропных инфекциях, таких как мышиный вирус энцефаломиелита, в котором воспалительные клетки проникают в паренхиму мозга 5, но особенно актуально в грызунах малярии, в котором инфицированных эритроцитов и лейкоцитов воспалительного оставаться поглощенным в кровеносных сосудах, а не проникают ткани головного мозга . Соответственно, внутрисердечной перфузии малярией мышей, инфицированных должна не только быть рекомендован для анализа BSL, но может быть также полезно дляОценка паразитов тканей, поглощение 10,11. Как и невоспалительные циркулирующих лейкоцитов, незрелые формы малярийных паразитов не в состоянии придерживаться эндотелия сосудов и должны быть удалены перфузии процедуры. В отличие от сторонника PRBC (зрелые шизонтов), по всей видимости, остаются в пределах сосудов головного мозга. P. berghei ANKA трансгенных паразитов, выразив люциферазы были получены 12 и являются ценным ресурсом для этого типа анализа. После заражения с люциферазы, экспрессирующие линии, паразит ткани секвестр может быть определена путем визуализации перфузии мозга зараженных животных с использованием системы ИВИС 10,11. Прямое сравнение паразита-поглощения на 6-7 дней пи в мозге животных и перфузии мозга мышей, инфицированных стадия конкретных паразитов репортер (т.е. выразить люциферазы только во время шизонт этап) будут полезны для дальнейшей проверки этого метода.
ОдинСущественным недостатком традиционных подходов гистологического анализа тканей проникновения клеток является то, что эти методы не позволяют оценить клеточных популяций, которые требуют признания более чем на одну ячейку маркером для их идентификации (т.е. NK1.1 + + αβTCR CD1d ограниченные NKT или CD4 + Foxp3 + T регуляторных клеток). В отличие от гистологии, проточной цитометрии воспалительных лейкоцитов поддается несколько окрашивания антител, обеспечивая очень полезный инструмент для всеобъемлющего фенотипическая характеристика клеточных инфильтратов 7,9,13. Кроме того, этот метод является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить клеточные популяции, происходящие на частотах столь же низко как 1-3% от общего объема внутрисосудистой инфильтрата, в том числе не только эндогенного, но и адаптивно переданы клеток, а также антиген специфические Т-клетки. P. berghei ANKA трансгенных паразитов, выразив MHC I и MHC II-ограниченного эпитопы из OVA 14 + CD8 + Т-клеток от OT-я мышах могут быть обнаружены среди BSL из Ly5.2 + C57BL / 6 PbTG-инфицированных мышей, что свидетельствует о воспалительных Т-клетки мигрируют в мозг борьбы с малярией являются паразитами конкретных 14.
Анализ BSL также полезно, чтобы оценить потенциал новых противовоспалительное лечение в доклинических моделях животных. Например, способность моноклональных антител против CXCR3 хемокинов ИФН-γ-индуцируемых белков 10 (IP-10), чтобы предотвратить проникновение мозга внутрисосудистого и облегчить симптомы заболевания, связанные с тяжелой формой малярии было успешно продемонстрировано с помощью этогометодом 11.
Одно из ограничений, что этот метод может иметь то, что общее число клеток оправился от мозга одного человека, как правило, достаточно для одного набора антител окрашивания. Таким образом, отдельные эксперименты могут быть необходимы, если более 4-6 маркеров клеток, необходимых для анализа. В общем, процедура проста в исполнении. Единственный шаг, который может потребовать некоторого начального обучения внутрисердечной перфузии. Несколько советов, которые могут быть полезны для преодоления возможных проблем приведены в таблице 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить мисс Лиана Мацкевич технической помощи. Эта работа стала возможной благодаря викторианской государственного управления оперативной поддержки инфраструктуры и австралийское правительство национального здравоохранения и медицинских исследований Совета IRIISS и гранта 1031212.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
