Summary
の脳血管から付着炎症性白血球を単離するための方法
Abstract
我々はPの脳血管から付着炎症細胞の単離および特性評価のための方法を説明ベルゲイ ANKA感染マウス。実験的脳マラリア、人間1,2における熱帯熱マラリア原虫媒介重症マラリアの再現する一定の重要な側面、その神経学的症候群の誘導にこの寄生虫のひずみの結果と感受性マウス系統の感染。血液段階のマラリアの成熟型は、それらが血管内皮細胞に結合することができます感染赤血球の表面に寄生するタンパク質を発現している。このプロセスでは、低酸素症および出血3、その結果、血流に障害を誘発し、また寄生虫隔離のサイトに炎症性白血球の動員を刺激する。
他の感染症とは異なり、すなわちneutrotopicウイルス4-6、両方マラリア寄生赤血球（PRBC）ならびに関連inflammatory白血球は血管内ではなく、脳実質に浸潤するより隔離のままである。したがって、非炎症性の循環細胞、臓器の抽出と組織の処理の前に感染したマウスの大規模な心臓内灌流による隔離白血球の汚染を避けるために、血液区画を削除する場合は、この手順が必要になります。灌流後、脳を採取し、小片に解剖した。組織構造は、さらにその結果脳ホモジネートは、その後ミエリンおよび他の組織片から脳隔離された白血球の分離（BSL）が可能パーコール勾配に遠心分離されるコラゲナーゼDとDNase Iで酵素処理によって破壊されています。単離された細胞は、その後、フローサイトメトリーによってその後の分析のための蛍光抗体と血球計数器とステンドを使用してカウントし、洗浄する。
この手順では、炎症性白血球の包括的な表現型の特徴は、再の脳への移行を可能にするストロークだけでなく、ウイルスや寄生虫感染症を含む様々な刺激に応答特性。この方法はまた、前臨床動物モデルにおける新規抗炎症治療の評価のための便利なツールを提供します。
Protocol
1。 P.によるマウスの感染ベルゲイ -ANKA
- 霜凍結保存Pのアリコートベルゲイ ANKA PRBC。
- 両手拘束技術を用いて、脳マラリア耐性のBALB / cドナーマウス（8-12週齢）を抑制する。 1mlのインスリン注射器（28G針）を使用して、PRBCの100から200μlでマウスを注入します。日常的に、1-2ドナーマウスが注入される。
- 感染後4-5日で（pi）をケージからドナーマウスを削除して、ワークステーションまたは使い捨て作業パッドの上に置きます。
- ゆっくり尾の端でマウスを抑制し、小さなハサミを使用する（約1mm）尾の先端をカットします。代わりに、25 Gの針を使って小さな尾穿刺を行うことができた。
- 曇らされたエンド顕微鏡スライドの終わり近くにマウスの尾静脈から血液を一滴。
- 45°の角度で第2のスライド（スプレッダー）を配置し、一滴の血にそれをバックアップしてください。血液はエッジに沿って広がりたら、スプレッダー-スライド前夜をプッシュ血液塗抹標本を作るために顕微鏡スライドを越えnly。スミアが空気乾燥させてください。
- 30秒間100％メタノールに血液塗抹標本を修正してから10分間、新たに調製した染色でスライドを染色する。
- 1分間流水で血液塗抹標本をすすぎ、空気乾燥することができますし、顕微鏡（100倍、油浸）の下のスライドを調べる。千赤血球内PRBCを列挙し、パーセント寄生虫を計算します。彼らは実験動物の感染症のために血を流したことができる前にドナーマウスは百分の2.5から5の間に寄生虫のレベルに到達する必要があります。
- ヘパリン処理マイクロヘマトクリット毛細管を用いて眼窩出血によってドナーマウスから血液を採取します。全ての実験は、ウォルター·エリザホール研究所動物倫理委員会の要件に準拠して行われます。地元の動物倫理委員会の要件に応じて、他の出血の手順は、使用されるかもしれません。 1X10 6 pRBC/0.2 mlの最終濃度でRPMI培地中で血液の必要量を溶かす。それを考えてみましょう正常なマウスのヘマトクリット値は、〜6×10 9赤血球/ 1ミリリットルです。
- 腹腔内（ip）に1×10 6 pRBC/0.2ミリリットルを注入することにより、実験のC57BL / 6マウス（8-12週齢）に感染。
- 感染マウスの寄生虫レベルを監視するために、ステップ1.3から1.8に従ってください。寄生虫は、2日目または3πから始まる2〜3日ごとに決定されるべきである
- C57BL / 6マウスにおける重症マラリアの発症は猫背外観、エリマキ毛皮や低活性として現れることがあります。一部のマウスには、この段階で回復するかもしれませんが、自己立ち直り反射の消失への進行が不可逆的な疾患や動物を安楽死させなければならないことを示します。
2。マウスと脳抽出の心臓内灌流
- 60 cmのカラムスタンドの上部に取り付けられたカラムホルダーに500mlの貯水池を確保することにより、手動重力灌流システムを組み立てる。貯水池の底端部にプラスチックのチューブを接続し、バッファの流れを制御するためのチューブクランプを固定します。 23Gの針にチューブを取り付けます。 FILPBSでリザーバー（22℃に保た℃）までのlは、クランプとバッファはすべての気泡を除去するためにチューブを介して実行できるように開きます。
- 安楽死P. CO 2吸入によってベルゲイ ANKA感染マウス。ペダル、軌道や呼吸器の応答の有無によって死亡を確認します。
- 背プラスチックトレイに格納されている発泡スチロールの解剖ボード上の後ろ足と前足で安楽死させたマウスをピン。地元の動物倫理委員会の要求に応じて麻酔が心臓内pefusionの事前の開始を投与することができる。
- 70％エタノールで腹側を拭きます。
- 胸腔を露出するように正中線に沿って皮膚を開くために、大きなハサミとピンセットを使用しています。両側に折り、ピン肌。
- 細かい鉗子で胸骨を押しながら、横隔膜をカットし、胸骨の両側に沿ってリブを切断する。任意の大血管を傷つけないように注意してください。
- 頭の横に緩く胸骨によって胸郭をピン。
- 心室のウィットを保持hは細かい鉗子と細かいはさみで慎重に切開右心房。
- PBSが実行されている間上行大動脈に向かって左心室に重力灌流システムに接続されている23Gの針を挿入します。針先端のわずか0.5センチメートルを挿入します。
- 5分間または排水が透明になるまでマウスを灌流する。
- 固定を解除し、マウスとその腹部の上に横たわっていた。 70％エタノールで頭を拭いてください。
- 大きなハサミを使って、ちょうど頸髄領域の上のカットを行う。
- 頭蓋骨を露出するために離れて正中仙骨-吻側頭蓋底から始まるカット、剥離皮膚を作るために微細なハサミを使用します。
- 頭を抱え、それぞれの軌道の空洞に小さなハサミの刃を配置し、軌道の間のカットを行います。
- 矢状縫合に沿って長手方向の切り込みを入れ、慎重に外側にそれぞれの脳半球上の頭蓋骨をはがします。
- へらを使って、そっと脳を持ち上げ、RPMI培地を含む10mlの遠心管に入れてください。
3。脳隔離白血球の単離（BSL）
- 安全キャビネットでの作業、場所がたてたRPMI組織培養培地の3-5 mlを入れたペトリ皿の中でのステンレス鋼のセルストレーナー（40-60メッシュサイズ）の上に脳を収穫した。
- 小片に脳組織を切り取ります。
- クリスタルプランジャーを使用してセルストレイナーで脳組織の小片を押してください。
- 4℃で10分、250×gで10 mlのチューブと遠心分離機に脳ホモジネートを転送
- 0.05パーセントコラゲナーゼDと2U/ml DNアーゼIを含むRPMI培地3ml中でペレットを溶解
- 室温で30分間混合物を回転させます。 70μmナイロンセルストレイナーでおよび/または5分間氷上でインキュベートすることにより、混合物を押すことにより、細胞の破片を取り除きます。
- 室温で20分間、400×gで（ノーブレーキ）で7ミリリットル30％パーコールクッションと遠心分離機に脳ホモジネートを置きます。
- 5分〜氷上で赤血球溶解バッファーとインキュベート1ml中のペレットを再懸濁し心臓内灌流により脳から削除できませんでした付着PRBCを、溶解する。
- RPMI培地を9mlを加え、4℃で10分間、250×gで遠心分離し、細胞を洗う
- RPMI培地とエッペンドルフチューブに移す細胞の50〜100μLに再懸濁し、BSL-含有ペレット。
- 生細胞の同定のためにトリパンブルーで細胞サンプルを1:2の5〜10μlのアリコートを希釈します。
- 血球計数器を用いて顕微鏡下で生細胞をカウントします。 6日目以降はπ、Pからベルゲイ ANKA感染マウスは20,000-100,000 BSLsを回収することができる、神経症状が表示されます。
4。マルチカラーフローサイトメトリーによるBSLの免疫表現
- 4℃で10分間、250×gで遠心し、染色緩衝液50μl（PBS、1％ウシ胎児血清（FCS）、2mMのEDTA）に懸濁し、上清とペレットを吸引除去する。
- anti-CD16/32抗体（Fcblock）を精製し、1μlを添加する。
- 1細胞をインキュベート氷の上で0分。
- 染色緩衝液1mlで細胞を洗浄します。 4℃で10分間、250×gで遠心し、上清を吸引除去する。
- 必要な蛍光抗体、 すなわち抗CD4、抗CD8、抗TCRと抗NK1.1の所定の最適な希釈を含む染色緩衝液50μlの再懸濁します。
- 氷上で1時間インキュベートする。
- 染色緩衝液1mlで細胞を洗浄します。 4℃で10分間、250×gで遠心し、上清を吸引除去する。
- 100μlのPBSに細胞を再懸濁する。
- フローサイトメトリー用プラスチックチューブに細胞を移します。
- フローサイトメーターを使用して、少なくとも5,000〜10,000のイベントを取得する。必要に応じて適切な染色細胞のコントロールおよび蛍光補正のサンプルが含まれるべきである。
- 適切なフローサイトメトリー·ソフトウェアを使用して結果を分析します。
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Representative Results
図の結果。 2に示す比率と灌流したりunperfusedマラリアに感染し、ナイーブ対照マウスの脳から回収された別のBSLの人口の絶対数。議定書のテキストに示されているように隔離されたBSLは、PE-抗NK1.1およびAPC-抗TCR-β抗体で染色した。 7月9日以前の知見と一致して、αβTCR+ T細胞は、灌流しマラリア感染マウス（6日目PI）の脳におけるBSLプールの高い割合を占めている。この集団は著しく（図2A-B）の非灌流した動物の脳内に過小評価であるように見えた。これらの動物では（図2A-B）の非灌流した脳内T細胞の頻度の明らかな減少がかなり高い割合とダブルネガティブ細胞の総数- （ - NK1.1αβTCR）と関連していた。 unperfused脳内ダブルネガティブ細胞で高い割合と数字のみがマラリアに感染したマウスではなく、NA＆IUにも検出されなかったミリリットル、VEのコントロール、これらの細胞は、心臓内の血流が行われていない場合は炎症細胞と一緒に回収される脳血管中に存在する非炎症性白血球であることを示唆している。
BSLの分析の2つのさらなる例は、図に示されている。 3、図4。簡単に言えば、C57BL / 6マウスを、P.に感染していたベルゲイ ANKA（1×10 6 PRBC）。脳や神経症状の発症（6から8日の間にπ）に白血球動員の間の時間的な関連付けはPに実証されているベルゲイアンカはマウス7-9を感染させた。この特定の例では、マラリアに感染したマウスは、6日目にpiを安楽死させ、プロトコル、文章で説明しているBSLを精製した。孤立BSLは、PE-抗NK1.1、APC抗TCR-β、FITC-抗CD4およびPerCPCy5.5抗CD8α抗体で染色した。サンプルはBD Biosciences社FACSCaliburフローサイトメーターとイタチ3.0.1ソフトウェアを使用して実行された分析を用いて得た。経由BLE細胞が前方および側方散乱によってゲートであった。 NK細胞、Tリンパ球、NKT細胞（NK1.1 + TCR +細胞）の割合は、トップパネル（図3A）に示されているナイーブおよびマラリア感染マウス（6日目PI）の脳に隔離。下のパネルは、CD4の割合を示す+とゲーテッドNK1.1間CD8 + Tリンパ球- αβTCR+細胞（図3A）。図。図3Bは、CD4 +およびCD8 +脳隔離T細胞の絶対数をPと6日目piを計算した場合の例を示してベルゲイ ANKA。一般的に、20,000-100,000 BSLは、P.の脳から回収することができベルゲイ ANKA感染マウス。そのような時間piなどいくつかの要因は、抗炎症治療のマウス系統または包含の感受性は細胞の回復に影響を及ぼす可能性がある。日常的に、1個々の脳は、抗体染色の1セットのための十分な細胞を提供する。
インターネットで提供されている例でグラム。脳隔離されたTリンパ球の4ケモカイン受容体の使用状況を分析した。マウスはPで感染していたベルゲイ ANKAとBSLは、当日6パイ細胞をストレプトアビジン-PerCPCy5.5共役とのインキュベーションに続いて、APC-抗TCR-βは、PE-抗CXCR3とビオチン標識抗CCR5抗体で染色された単離された。サンプルは図当たりとして取得し、分析した。 3。ヒストグラムは、マラリアに感染し、ナイーブ対照マウスにおける総BSLの間αβTCR+細胞のパーセンテージを表します。真ん中と下のパネルでコンター図は、ゲートαβTCR+の細胞内CXCR3 +およびCCR5 +細胞の割合を示す。
BSLの単離と解析のための手順の図1のフローチャートPからベルゲイ ANKA感染マウス。 （1）Pのcryopresevedアリコートベルゲイ ANKA PRBCが解凍され、1または2のドナーマウスは、感染している。 4日後、ドナーマウスのparsitemiaレベルが計算され（2）、ドナーマウスは実験用マウスの感染症のために準備から採血し、血液希釈されています。マラリア感染は、その後、重症マラリア感受性C57BL / 6マウスに設定されています。 （3）日5月7日πに、マウスをCO 2吸入によって安楽死させて、すぐに心臓内のすべての循環非接着細胞を除去するために灌流されています。 （4）脳は、その後回収し、コラゲナーゼDおよびDNアーゼI BSLを用いて組織の消化によって調製脳ホモジネートは、その後、パーコール勾配によってミエリンと細胞の破片から分離される。 （5）BSLは、蛍光抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析し、血球計算盤を用いて計数し、洗浄して沈殿させた。
図2：灌流したりunperfusedマウスの脳におけるBSLの分析。 C57BL / 6マウスを、P.に感染していたベルゲイ ANKA（1×10 6 PRBC）。脳を灌流したりunperfused動物から6日目piを収穫した。 BSLは、単離された抗NK1.1および抗TCR蛍光抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。マラリアに感染し、ナイーブコントロールマウスを灌流された中で（上のパネル）またはunperfused（ボトムパネル） - TCR - （A）ドットプロットはNK細胞、Tリンパ球、NK1.1 NK1.1 + TCR +細胞およびダブルネガティブ細胞の割合を描く。 （B）はダブルネガティブ細胞およびTリンパ球の絶対数が、6日目Pと円周率を計算したベルゲイ ANKAとナイーブコントロールマウス。各バーrepreseNTS 3つのサンプルの平均値±SEM、* P> 0.05。
図3：NK細胞とTリンパ球は、P.の脳で検出することができるベルゲイ ANKA感染マウス。 C57BL / 6マウスを、P.に感染していたベルゲイ ANKA（1×10 6 PRBC）。脳を安楽死させた動物の灌流後6日目にpiを抽出した。 BSLは、単離された抗NK1.1、抗TCR、抗CD4および抗CD8蛍光抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。 （a）は上面パネルがマラリアに感染し、ナイーブ対照マウスにおけるNK細胞、Tリンパ球およびNK1.1 + TCR +細胞の割合を示している。下のパネルは、gatedαβTCR内CD4 +およびCD8 + T細胞+ NK1.1の割合を示しています- （B）は脳隔離のCD4絶対数+およびCD8 + T細胞は、6日目Pと円周率を計算したベルゲイ ANKAとナイーブコントロールマウス。各バーは、3つのサンプル値±SEMの平均を表す。
図4：重度のマラリア感染に反応して脳に移行するTリンパ球の大半は、ケモカイン受容体CXCR3を発現している。 C57BL / 6マウスを、P.に感染していたベルゲイ ANKA（1×10 6 PRBC）。脳を安楽死させた動物の広範灌流後6日目にpiを抽出した。 BSLは、単離された抗TCR、抗CXCR3と抗CCR5抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。トップパネルはαの割合を描くマラリアに感染し、ナイーブ対照マウスにおけるリンパ球βT。等高線図は、ゲートαβTCR+リンパ球内CXCR3 +（中段）およびCCR5 +（下のパネル）細胞の割合を示しています。
| 問題 | トラブルシューティング |
| 不完全潅流 |
|
| BSLは十分回復していない |
|
表1。
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Discussion
BSLの単離と解析、特性評価および実験マウスモデルにおける組織損傷または感染に反応して脳への移行の炎症性細胞の定量化を可能にする方法です。臓器の抽出とそれに続く細胞単離の前に血液区画の除去のための心臓内灌流ステップの導入は、非炎症性の循環白血球と炎症細胞の汚染を防止するのに有用である。これは、炎症細胞が脳実質5を貫通しているようなマウス脳脊髄炎ウイルスなどの神経向性感染に不可欠な要件であるが、感染赤血球及び炎症性白血球が残っている血管に隔離ではなく、脳組織に浸潤している、げっ歯類のマラリアに特に関連していない可能性があり。従って、マラリア感染マウスの心臓内灌流のみBSLの分析のために推奨されるべきではないだけでなく、ために有用かもしれない寄生虫組織隔離10,11の評価。非炎症性の循環白血球と同様に、マラリア原虫の未熟なフォームが血管内皮に付着することができないと灌流手順で削除する必要があります。これとは対照的に、付着したPRBC（成熟シゾント）は、脳の血管内に留まるように見えます。P.ルシフェラーゼを発現ベルゲイ ANKAトランスジェニック原虫は12を生成し、この種の分析のための貴重な資源であるされています。ルシフェラーゼ発現ラインで感染後、寄生組織隔離はIVISシステム10,11を使用して 、感染した動物から灌流された脳のイメージングによって決定することができる。ステージ固有のレポーター寄生虫（のみシゾント段階でルシフェラーゼを発現IE）に感染したマウスの灌流動物と脳の脳内日6-7π上の寄生虫隔離の直接の比較は、この方法のさらなる検証のために有用であろう。
1組織浸潤細胞の分析のための伝統的な組織学的なアプローチの重要な欠点は、これらの技術はそれらの識別（ すなわち NK1.1 +αβTCR+ CD1dの拘束性NKT細胞またはCD4のために複数の細胞マーカーの認識を必要とする細胞集団の評価ができないということです+ FOXP3 +制御性T細胞）。組織学とは異なり、炎症性白血球のフローサイトメトリー分析は、細胞浸潤7,9,13の包括的な表現型の特性評価のための非常に便利なツールを提供する、複数の抗体染色に適している。また、この方法では、内因性だけでなく、養子移入細胞ならびに抗原特異的T細胞だけでなく含む、潜入合計血管内の1-3％という低い周波数で発生する細胞集団を検出するのに十分に敏感である。P. OVA 14からのMHC IとMHC II拘束性エピトープを発現するトランスジェニックベルゲイ ANKA寄生虫+ CD8 + T細胞がLy5.2のBSLの間で検出された+のC57BL / 6 PbTG感染マウスは、炎症性T細胞は、中の脳への移行という証拠を提供することができるマラリアへの応答は、寄生虫特有の14アール。
BSLの分析では、前臨床動物モデルにおける新規抗炎症治療の可能性を評価することも有用である。例えば、脳血管内浸潤を防ぎ、重症マラリアに関連する疾患の症状を緩和するCXCR3ケモカインIFN-γ誘導タンパク質10（IP-10）に対するモノクローナル抗体の能力は、これを正常に使用して実証されている方法11。
このメソッドは持っているかもしれないという一つの制限は、1個々の脳から回収した細胞の総数は、抗体染色の1セットのために、一般的に十分であるということです。以上の4から6の細胞マーカーを分析のために必要な場合はこのように別々の実験が必要になることがあります。一般に、プロシージャは実行することは容易である。いくつかの初期のトレーニングを必要とするかもしれない唯一のステップは、心臓内の血流である。潜在的な問題を克服するために有用かもしれないいくつかのヒントは、 表1に記載されています。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者は、技術支援のためにミスリアナMackiewiczに感謝したいと思います。この作品は、ビクトリア州政府業務インフラのサポートとオーストラリア政府は国立保健医療研究評議会IRIISSとプロジェクト無償1031212により可能となった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
References
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