Summary
贴壁脑血管的炎性白细胞隔离的方法
Abstract
我们描述的方法脑血管P.贴壁炎症细胞的分离和鉴定伯氏疟原虫 ANKA感染的小鼠。感染这种寄生虫的应变结果在诱导实验性脑疟疾，神经系统综合征的易感小鼠株，概括的某些重要方面介导的恶性疟原虫在人类1,2严重的疟疾。成熟形式的血液阶段疟疾感染的红细胞的表面上，这允许它们绑定到血管内皮细胞表达寄生蛋白质。这个过程导致的阻塞血液流动，导致缺氧，出血3，，也刺激炎性白细胞招聘网站的寄生虫封存。
不像其他的感染，即neutrotopic的病毒4-6，两个疟疾寄生的红血细胞（PRBC）以及相关联的inflammatory白细胞始终处于固定状态，而不是浸润脑实质内的血管。因此，为了避免污染螯合白细胞与非炎症性的循环细胞，广泛感染小鼠心脏内灌注器官提取和组织处理之前在此过程中是必需的，以除去血液舱。灌注后，大脑的收获和解剖小块。的组织结构进一步破坏胶原酶和DNA酶一酶处理由此产生的脑组织匀浆，然后离心分离上的Percoll梯度使脑幽静的白细胞分离（BSL）的髓鞘和其他组织碎片。计数中分离出细胞，然后洗净，用血球计数仪和荧光抗体染色后用流式细胞仪分析。
这个程序允许全面的表型特征的炎性白细胞迁移到大脑中重新响应各种刺激，包括中风，以及病毒或寄生虫感染。该方法还提供了一个有用的工具，用于评估新型的消炎治疗，在临床前动物模型。
Protocol
1。感染小鼠的P.伯氏疟原虫的ANKA
- 除霜取冻存P.伯氏疟原虫 ANKA PRBC。
- 抑制的脑疟疾抗BALB / c小鼠供体小鼠（8-12周龄）使用双手的约束技术。 100-200微升猪红细胞使用一个1毫升的胰岛素注射器（28G针）注入小鼠。常规1-2个供体小鼠注射。
- 在天4-5感染后（PI）从笼中取出供体小鼠，并将其放置在工作站或一次性垫。
- 轻轻地抑制小鼠的尾巴末端，用小剪刀剪尾巴尖（约1毫米）。另外，一个小尾巴，可以使用25 G针的穿刺。
- 从鼠标的尾部静脉接近尾声的磨砂年底的显微镜载片上，将一滴血。
- 成45°角放置一个第二滑动（扩频器）和备份到的血液的液滴。一旦血液中的沿边缘扩散，推动的吊具滑前夕NLY对面的血涂片的显微镜幻灯片。让涂抹在空气中干燥。
- 在100％甲醇，持续30秒，然后修复血涂片染色在新鲜制备的10分钟的吉姆萨滑动。
- 1分钟，用流动的水冲洗血涂片，让空气干燥和审查，在显微镜下（100倍，浸油）的幻灯片。列举1000红细胞和猪红细胞内，计算百分比原虫。供体小鼠原虫水平应达到2.5-5％之间，才可以感染实验动物流血。
- 采集血液从供体小鼠的眼窝出血，使用肝素的的微血细胞比容毛细管。所有的实验都符合沃尔特和伊丽莎·霍尔研究所动物伦理委员会的要求。根据当地动物伦理委员会要求的其他出血程序可能会用到。溶解所需量的血液，在RPMI培养基中的终浓度为1X10 6 pRBC/0.2毫升。想想看，正常小鼠血细胞比容是〜6×10 9的红血细胞/ 1毫升。
- 感染实验的C57BL / 6小鼠（8-12周龄），通过注入腹膜内（ip）1×10 6 pRBC/0.2毫升。
- 监控原虫感染小鼠，请按照下列步骤1.3-1.8。原虫血症应确定每2-3天开始第2天或3 PI
- 在C57BL / 6小鼠会表现为驼背的外观，严重的疟疾发病的时候总是毛皮和低活性。有些鼠标可以恢复在这个阶段，但发展自翻正反射损失表示不可逆的疾病和动物必须实施安乐死。
2。心内灌注小鼠脑提取
- 通过固定的500毫升水库60厘米柱支架的顶部连接到一列保持架组装手动重力灌注系统。将塑料管的底端水库，确保油管钳，控制缓冲流。连接管连接到一个23 G针。费尔l对水库PBS（保持在22°C），打开钳和缓冲运行通过管道，以除去所有的气泡。
- 安乐死P.伯氏疟原虫 ANKA的CO 2吸入受感染的小鼠。踏板的情况下，轨道和呼吸反应，确认死亡。
- 针安乐死鼠标背部上的一个塑料夹层板包含在一个塑料托盘的后腿和前爪。根据当地动物伦理委员会的要求麻醉，可管理的前心内pefusion开始。
- 用70％乙醇擦拭腹侧。
- 用大剪刀和镊子，打开沿正中线皮肤暴露胸腔。折叠和引脚的皮肤向两侧。
- 用细镊子和保持胸骨切开膈肌和切断胸骨两侧的肋骨。 ，请注意不要损坏任何大血管。
- 引脚的肋骨，胸骨松散的头。
- 保持心室机智Ĥ细钳和右心房用细剪刀小心地切割。
- 插入23G针连接到重力灌注系统进入PBS被运行时朝向升主动脉左心室。插入只有0.5厘米的针尖。
- 灌注鼠标为5分钟或直到出水是明确的。
- 取消固定鼠标，并把它放到它的腹部。用70％乙醇擦拭头。
- 用大剪刀，作一个切口正上方的脊髓型颈椎病领域。
- 用细剪刀，中位数尾部的喙切在颅底和剥离皮肤，以露出头骨。
- 握住头部，将一个小的剪刀的刀片的到每个轨道空腔和轨道之间作一个切口。
- 做一个纵向切割沿矢状缝，小心剥离头骨上每个大脑半球向外。
- 用锅铲轻轻抬起大脑，将其放入10 mL离心管中含有RPMI培养基。
3。分离脑幽静的白细胞（BSL）
- 工作在一个安全柜，地点的新鲜收获的脑含有3-5毫升的RPMI组织培养基的皮氏培养皿中的不锈钢的细胞过滤网（40-60筛目大小）的顶部。
- 脑组织切小块。
- 将脑组织的小片，通过细胞过滤网使用晶体柱塞。
- 脑匀浆转移到10毫升管中，离心，在250×g离心10分钟，在4℃下
- 溶解沉淀，3毫升的RPMI培养基中，含有0.05％胶原酶D和一2U/ml DNA酶
- 旋转混合物在室温下的30分钟。通过按压该混合物通过70微米尼龙细胞过滤和/或通过在冰上孵育5分钟，除去细胞碎片。
- 到7毫升30％的Percoll坐垫和离心机在400×g离心20分钟，在室温下（没有刹车）上铺脑匀浆。
- 沉淀重悬在1ml红细胞裂解缓冲液，在冰上孵育5分钟，以裂解贴壁PRBC，心内灌注，不能从大脑中删除。
- 加入9毫升RPMI培养基，洗涤细胞并离心，在250×g离心10分钟，在4℃下
- 重悬BSL含颗粒在50-100微升RPMI培养基中和到Eppendorf管中的传输单元。
- 稀释的细胞样品为5-10微升等分1:2的台盼蓝活细胞识别。
- 计数存活的细胞，在显微镜下用血细胞计数。从第6天PI起，当P.伯氏疟原虫的 ANKA感染小鼠显示神经系统体征，，20,000-100,000楼宇安全贷款计划可以恢复。
4。多色流式细胞术免疫分型BSL
- 离心细胞在250×g离心10分钟，在4℃，吸出上清和重悬沉淀在50μl的染色缓冲液（PBS，1％胎牛血清（FCS），EDTA2毫米）中。
- 加入1微升纯化anti-CD16/32的抗体（Fcblock）。
- 培养细胞10分钟在冰。
- 用1毫升的染色缓冲液洗细胞。细胞在250×g离心10分钟，在4℃下离心，吸出上清液。
- 在50μl的染色缓冲液含有预先确定的最佳稀释所需的荧光抗体， 即抗-CD4，抗-CD8，抗-TCR和抗NK1.1重悬细胞。
- 在冰上孵育1小时。
- 用1毫升的染色缓冲液洗细胞。细胞在250×g离心10分钟，在4℃下离心，吸出上清液。
- 重悬在100μl的PBS中的细胞。
- 转移细胞的流式细胞术的塑料管。
- 使用流式细胞仪，获取至少5,000-10,000事件。应包括适当的未染色的细胞对照组和荧光补偿样品的要求。
- 使用适当的流式细胞仪软件分析结果。
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Representative Results
图中的结果。 2显示比例和绝对数量不同的BSL人口的的灌流或unperfused疟疾病毒感染者和天真的控制小鼠的大脑恢复。隔离BSL议定书文本中所示，用PE-抗NK1.1和APC-抗-TCR-β抗体染色。与以前的研究结果7-9，αβTCR+ T细胞组成一个BSL池灌注感染疟疾的小鼠（第6天PI），大脑中的高比例。这个人口似乎是显着的人数不足非灌流动物大脑中（图2A-B）。具有相当高的百分比和双阴性细胞的总数（αβTCR - NK1.1 - ），在这些动物中（图2A-B）相关联的明显减少非灌注大脑中的T细胞的频率。高比例和数量上的双重否定细胞在unperfused的大脑是不是只存在于感染疟疾的老鼠，而且在北美工厂及工业经营毫升;已经控制，这表明这些细胞是本一起回收的炎性细胞，如果不进行心脏内灌注的脑血管中的非炎症性白细胞。
两个BSL分析的进一步的例子示于图中。图3和图。 4。简要地说，C57BL / 6小鼠，感染与 P 伯氏疟原虫 ANKA（1×10 6 PRBC）。白细胞募集到的大脑和神经系统症状（6-8天之间PI）的时间之间的关联已被证明在P.疟原虫 ANKA感染小鼠7-9。在这个特定的例子中，在第6天丕安乐死疟疾感染的小鼠，并如议定书的文字中描述的纯化的BSL。隔离BSL与PE-抗NK1.1，APC-抗-TCR-β，FITC-抗-CD4和PerCPCy5.5-抗-CD8α抗体染色。使用一个BD Biosciences公司的FACSCalibur流式细胞仪和黄鼠狼3.0.1软件进行的分析对样品进行了收购。通过表细胞通过正向和侧向散射光门控。隔离在天真和疟疾感染的小鼠的大脑（6天PI）表示，在顶部面板（图3）NK细胞，T淋巴细胞和自然杀伤T细胞（NK1.1 + TCR +细胞）的百分比。底部面板显示比例的CD4 +和CD8 + T淋巴细胞之间的门控NK1.1 - αβTCR+细胞（图3A）。图。图3B示出一个例子，其中的CD4 +和CD8 + T细胞脑多价螯合的绝对数量，计算在第6天丕与 P 伯氏疟原虫 ANKA。在一般情况下，20,000-100,000 BSL可以恢复大脑P.疟原虫 ANKA感染的小鼠。有几个因素，如圆周率，敏感性的小鼠品系或列入消炎治疗，可能会影响细胞的恢复。按常规，一个人的大脑提供足够的细胞抗体染色的1套。
在这个例子中提供网络连接克。 4脑多价螯合的T淋巴细胞的趋化因子受体的使用进行了分析。小鼠感染P.伯氏疟原虫 ANKA和BSL进行分离，在第6天丕染色细胞与APC-抗TCR-β，PE-抗-CXCR3和生物素化的抗CCR5抗体孵育，随后与链霉抗生物素蛋白-PerCPCy5.5共轭。样品采集和分析根据图。 3。的的直方图代表+的αβTCR细胞的百分比，其中包括疟疾感染和天真的对照组小鼠的总BSL。在中部和底部面板的等高线图显示CXCR3 + CCR5 +细胞在门控αβTCR+细胞的百分比。
图1。BSL进行分离和分析的过程的流程图从P.伯氏疟原虫 ANKA感染的小鼠。 （1）cryopreseved的等分P.伯氏疟原虫 ANKA猪红细胞解冻，1或2供体小鼠被感染。 （2）四天后parsitemia的供体小鼠的水平计算，供体小鼠感染实验小鼠采血，血液稀释准备。一种疟疾感染，然后设置严重的疟疾敏感的C57BL / 6小鼠。 （3）5-7天PI，老鼠安乐死的CO 2吸入，立即intracardially灌注删除所有流通的非贴壁细胞。 （4）脑，然后收获，和通过的组织胶原酶和DNA酶一BSL消化的脑匀浆准备，然后通过Percoll梯度分离，髓磷脂和细胞碎片。 （5）沉淀BSL然后洗涤，计数使用血球计数仪，荧光抗体染色，用流式细胞仪分析。
图2。大脑灌流或unperfused小鼠的的BSL分析中。 C57BL / 6小鼠，感染与 P 伯氏疟原虫 ANKA（1×10 6 PRBC）。第6天圆周率从灌流或unperfused动物的大脑进行收割。中分离出的BSL，与抗NK1.1和的抗TCR荧光抗体染色，并通过流式细胞术分析。 （A）点图描绘的NK细胞，T淋巴细胞，NK1.1 + TCR +细胞和双阴性细胞NK1.1 - TCR -在灌注（上图）unperfused（底部面板的百分比）疟疾感染和天真的对照组小鼠。 与 P（B）的双负细胞和T淋巴细胞的绝对数量，并计算出在第6天丕伯氏疟原虫的 ANKA和天真对照组。每个酒吧represe都新界南总区的3个样品的平均值±扫描电镜（SEM），* P> 0.05。
图3。NK细胞和T淋巴细胞中可检测到的P.脑疟原虫 ANKA感染的小鼠。 C57BL / 6小鼠，感染与 P 伯氏疟原虫 ANKA（1×10 6 PRBC）。提取后的第6天PI灌注实施安乐死的动物的大脑进行。中分离出的BSL，与抗NK1.1，抗TCR，抗-CD4，抗-CD8荧光抗体染色，并通过流式细胞术分析。 （A）顶部面板描绘的NK细胞，T淋巴细胞和NK1.1 + TCR +细胞在疟疾感染和天真的对照组小鼠的百分比。底部面板说明CD4 +和CD8 + T细胞在门控αβTCR+ NK1.1的百分比- （B）的绝对数量的脑多价螯合的CD4 +和CD8 + T细胞与 P在第6天丕计算伯氏疟原虫的 ANKA和天真对照组。每条线都表示平均3个±SEM。
图4，其中大部分迁移到大脑中的反应严重的疟疾感染的T淋巴细胞表达趋化因子受体CXCR3。 C57BL / 6小鼠，感染与 P 伯氏疟原虫 ANKA（1×10 6 PRBC）。第6天PI广泛灌注后实施安乐死的动物的大脑进行提取。中分离出的BSL，与抗TCR，抗-CXCR3和抗CCR5抗体染色，并通过流式细胞术分析。顶部面板的α描绘的百分比βT细胞在疟疾感染和天真的对照组。等高线图说明CXCR3 +（中间板）和CCR5 +（底部面板）门控αβTCR+淋巴细胞的细胞内的百分比。
| 问题 | 故障排除 |
| 不完整的灌注 |
|
| 没有足够的BSL恢复 |
|
表1中。
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Discussion
BSL的分离和分析的方法，它允许迁移到大脑响应于在实验小鼠模型中的组织损伤或感染的炎症细胞的定性和定量。的心脏内灌注器官提取前的血液舱和随后的细胞隔离步骤，用于除去的引入与非炎症性的循环中的白细胞的炎症细胞是有用的，以防止污染。鼠脑脊髓炎病毒等炎性细胞渗入脑实质5嗜神经性感染，这可能不是一个基本要求，但在啮齿类动物疟疾，其中特别是有关保持隔离受感染的红细胞和炎性白细胞浸润脑组织的血管内，而不是。因此，感染疟疾的小鼠心脏内灌注不仅要分析BSL建议，但也可能是有用的寄生虫组织封存10,11评估。非炎症性循环中的白细胞，不成熟的形式的疟疾寄生虫是无法坚持的血管内皮细胞的灌注过程中，应予以删除。相反，附着猪红细胞（成熟的裂殖体）似乎仍然在脑血管内。P.伯氏疟原虫 ANKA表达荧光素酶的转基因寄生虫已经生成12和这种类型的分析是有价值的资源。感染荧光素酶表达的线后，寄生虫，可以通过以下来确定组织封存成像灌注大脑从受感染的动物，使用的IVIS系统10,11。一个直接的比较天6-7 PI灌注动物和小鼠大脑，大脑中的特定阶段的记者寄生虫感染寄生虫封存（即表达荧光素酶只在裂殖阶段），进一步验证这种方法将是有益的。
一传统的组织学方法进行分析的重要的缺点组织浸润细胞，这些技术不允许评估需要识别一个以上的细胞标记他们的识别（ 即 NK1.1 +αβTCR+ CD1D限制NKT细胞或CD4的细胞群+ Foxp3 +的调节性T细胞）。不同组织学，流式细胞仪分析炎性白细胞是适合多种抗体染色的，全面的表型特征的细胞浸润7,9,13提供了一个非常有用的工具。此外，该方法是足够敏感的检测发生在频率低至1-3％的总的血管内渗透，不仅包括内源性也继转移细胞，以及抗原特异性T细胞的细胞群。P.伯氏疟原虫的 ANKA转基因寄生虫表达MHC I和MHC II-限制性表位OVA 14 +，CD8 + T细胞，可检测到来自OT - I小鼠之间BSL Ly5.2 + C57BL / 6 PBTG感染小鼠，提供的证据表明，炎症性T细胞迁移到大脑防治疟疾寄生虫特定的14。
分析BSL也是有用的，新颖的抗炎治疗的临床前动物模型中以评估潜在的。例如，单克隆抗体的能力CXCR3趋化因子IFN-γ诱导蛋白10（IP-10），以防止脑血管浸润和减轻疾病的症状与严重的疟疾已成功地证明使用方法11。
回收从一个单独的脑细胞的总数，该方法可能具有的一个限制是，通常是足够的抗体染色的一组。因此，可能需要另外的实验中，如果超过4-6细胞标记所需的分析。在一般情况下，该过程是容易进行的。唯一的步骤，可能需要一些初步的培训是心内灌注。克服潜在的问题，可能是有用的，在表1中列出一些提示。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢吴利亚纳马茨凯维奇技术援助。这项工作可以通过维多利亚州政府运营基础设施的支持，澳大利亚政府国家健康与医学研究委员会IRIISS和项目资助1031212。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 | |
References
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