Kontinuerlig høj opløsning Mikroskopisk Observation af Replikativ Aging i Spirende Gær
Summary
Vi beskriver her driften af en mikrofluid anordning, der tillader kontinuerlig og høj opløsning mikroskopisk billeddannelse af enkelte spirende gærceller under deres fuldstændige replikativ og / eller kronologisk levetid.
Abstract
Vi demonstrere brugen af en simpel microfluidic opsætning, hvor enkelt spirende gærceller kan spores hele deres levetid. Den microfluidic chip udnytter størrelsen forskellen mellem mor og datter celler ved hjælp af en vifte af micropads. Ved lastning, celler fanget under disse micropads, fordi afstanden mellem micropad og dækglasset svarer til diameteren af en gærcelle (3-4 um). Efter indlæsningen er dyrkningsmedium kontinuerligt skyllet gennem chippen, hvilket ikke kun skaber en konstant og defineret miljø hele eksperimentet, men også skyller de nye datter celler, som ikke opfanges under puderne på grund af deres mindre størrelse. Opsætningen bevarer mor celler så effektivt, at i et enkelt eksperiment op til 50 individuelle celler kan overvåges i en fuldautomatisk måde i 5 dage eller, hvis det er nødvendigt, længere. Desuden giver de fremragende optiske egenskaber af chip højOpløsning billeddannelse af celler under hele ældningsprocessen.
Introduction
Spirende gær er en vigtig model organisme til aldrende forskning 1.. Indtil for nylig studere replikativ aldring i gærceller var en besværlig proces, som kræver en dissektionsmetoden, hvor hver knop blev manuelt fjernet fra moderen cellen 2,3. For at løse dette problem, vi for nylig præsenterede en roman microfluidic setup i stand til at spore individuelle mor celler i hele deres levetid 4..
I vores microfluidic chip, er gærceller fanget under bløde elastomer-baserede micropads (se figur 1). En kontinuerlig strøm af medium skyller nydannede datter celler og giver cellerne med friske næringsstoffer. I et enkelt eksperiment, kan op til 50 Mor celler overvåges i en fuldt automatiseret måde i hele deres replikativt levetid. Grund af de fremragende optiske egenskaber af mikrofluid chip, er det muligt samtidigt at overvåge forskellige aspekter af gær cellebiologi (f.eks </em> ved anvendelse af fluorescerende proteiner).
Sammenlignet med den klassiske dissektionsmetoden giver microfluidic setup betydelige fordele. Det sikrer en defineret og konstant miljø under hele aldring eksperiment. Det kræver ingen dyre specialudstyr og kan køre på enhver mikroskop er udstyret med automatisk fokus og time-lapse evner samt temperatur-styring for celle dyrkning. Produktion og drift af de microfluidic chips kan læres i løbet af få dage. Derudover kan celler direkte indlæses fra en eksponentielt voksende kultur, en fordel frem for en anden nylig offentliggjort mikrofluid metode 5, som kræver biotinylering af mor celler. En Kombineret med høj opløsning billeddannelse, den her beskrevne metode kan anvendes til at måle gradvise ændringer i cellulær morfologi, aldring protein udtryk og lokalisering under gær i en hidtil uset måde. Muligheden forlangsigtede overvågning af enkelte celler giver også unikke muligheder for gær cellecyklus studier.
en Denne metode er for nylig blevet optimeret til at fjerne biotinylering fra protokol 16, som blev offentliggjort, mens dette manuskript var gennemgang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrofluid her beskrevne metode er et vigtigt nyt redskab i aldring forskning som det muliggør enkel og automatiseret generering af gær replikative levetid data i kombination med kontinuerlig høj opløsning billeddannelse. Disse egenskaber er væsentlige forbedringer i forhold til de eksperimentelle muligheder for klassiske dissektionsmetoden, men der er et par begrænsninger af metoden, der skal tages i betragtning.
Bemærk at den bestemte replikativ levetid kan blive påvirket af effekt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Laura Schippers til at skrive de første udgaver af cellens lastning protokollen og Marcus de Goffau og Guille Zampar for at lave mitokondrie morfologi.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
