Replicative की सतत उच्च संकल्प सूक्ष्म अवलोकन नवोदित खमीर में एजिंग
Summary
हम यहां उनकी पूरी replicative और / या कालानुक्रमिक उम्र के दौरान एक नवोदित खमीर कोशिकाओं की निरंतर और उच्च संकल्प सूक्ष्म इमेजिंग की अनुमति देता है कि एक microfluidic डिवाइस के आपरेशन का वर्णन.
Abstract
हम एक नवोदित खमीर कोशिकाओं को उनके पूरे जीवन काल के दौरान पता लगाया जा सकता है जिसमें एक साधारण microfluidic के सेटअप के उपयोग के प्रदर्शन. microfluidic चिप micropads की एक सरणी का उपयोग कर मां और बेटी की कोशिकाओं के बीच आकार अंतर का लाभ उठाते. Micropad और गिलास को कवर के बीच की दूरी एक खमीर सेल (3-4 सुक्ष्ममापी) के व्यास के समान है क्योंकि लोड करने पर, कोशिकाओं, इन micropads नीचे फंस रहे हैं. लदान प्रक्रिया के बाद, संस्कृति मध्यम लगातार अपने छोटे आकार के कारण पैड के नीचे बनाए रखा नहीं कर रहे हैं जो उभरते बेटी कोशिकाओं, बाहर flushes भी पूरे प्रयोग के दौरान एक निरंतर और परिभाषित वातावरण बनाता है, जो न केवल चिप के माध्यम से प्लावित है, लेकिन है. सेटअप एक ही प्रयोग में 50 तक व्यक्ति की कोशिकाओं अब, यदि आवश्यक हो, 5 दिनों के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित ढंग से नजर रखी जा सकता है कि इतनी कुशलता मां कोशिकाओं को बरकरार रखे. इसके अलावा, चिप की उत्कृष्ट ऑप्टिकल गुण उच्च की अनुमतिपूरी उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं का संकल्प इमेजिंग.
Introduction
खमीर नवोदित अनुसंधान 1 उम्र बढ़ने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव है. हाल ही में खमीर कोशिकाओं में उम्र बढ़ने replicative का अध्ययन जब तक हर कली मैन्युअल माँ सेल 2,3 से हटा दिया गया था, जिसमें एक विच्छेदन विधि की आवश्यकता होती है एक थका देने वाली प्रक्रिया थी. इस समस्या को हल करने के लिए, हम हाल ही में अपने पूरे जीवन काल 4 के दौरान व्यक्तिगत मां कोशिकाओं को ट्रैक करने में सक्षम एक उपन्यास microfluidic सेटअप प्रस्तुत किया.
हमारे microfluidic चिप में, खमीर कोशिकाओं (चित्रा 1 देखें) मुलायम इलास्टोमेर आधारित micropads में फंसे. मध्यम के एक निरंतर प्रवाह दूर नवगठित बेटी कोशिकाओं washes और ताजा पोषक तत्वों के साथ कोशिकाओं प्रदान करता है. एक ही प्रयोग में, 50 को मां की कोशिकाओं को उनके पूरे replicative उम्र भर एक पूरी तरह से स्वचालित ढंग से नजर रखी जा सकती है. Microfluidic चिप के उत्कृष्ट ऑप्टिकल गुणों के कारण, यह एक साथ खमीर कोशिका जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं (जैसे नजर रखने के लिए संभव है </उन्हें> फ्लोरोसेंट प्रोटीन) का उपयोग कर.
शास्त्रीय विच्छेदन विधि की तुलना में, microfluidic सेटअप पर्याप्त लाभ प्रदान करता है. यह पूरी उम्र बढ़ने के प्रयोग के दौरान एक परिभाषित और स्थिर वातावरण सुनिश्चित करता है. यह कोई महंगा विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और स्वचालित ध्यान और समय चूक क्षमताओं के साथ और साथ ही तापमान नियंत्रण सेल खेती के लिए सुसज्जित खुर्दबीन किसी पर चलाया जा सकता है. microfluidic चिप्स का उत्पादन और ऑपरेशन के कुछ ही दिनों के भीतर सीखा जा सकता है. इसके अलावा, कोशिकाओं को सीधे एक तेजी से बढ़ रही संस्कृति, मां कोशिकाओं की biotinylation की आवश्यकता है जो एक और हाल ही में प्रकाशित microfluidic विधि 5, पर एक लाभ से लोड किया जा सकता है. एक यहाँ वर्णित विधि क्रमिक परिवर्तन को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ संयुक्त सेलुलर आकारिकी में, खमीर के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण एक अभूतपूर्व ढंग से उम्र बढ़ने की. के लिए क्षमताएकल कक्षों का लंबे समय तक निगरानी भी खमीर कोशिका चक्र के अध्ययन के लिए अद्वितीय संभावनाएं प्रदान करता है.
एक इस विधि हाल ही में इस पांडुलिपि की समीक्षा में था, जबकि प्रकाशित किया गया था, जो प्रोटोकॉल 16 से biotinylation दूर करने के लिए अनुकूलित किया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित microfluidic विधि यह निरंतर उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ संयोजन में खमीर replicative उम्र डेटा का सरल और स्वचालित पीढ़ी सक्षम बनाता अनुसंधान बुढ़ापे में एक महत्वपूर्ण उपन्यास उपकरण है. इन विशेषताओं शास्त?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मितोचोन्द्रिअल morphologies स्कोरिंग के लिए सेल लोड प्रोटोकॉल और मार्कस डे Goffau और Guille Zampar के पहले संस्करण लिखने के लिए लौरा Schippers धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
References
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