Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist
Summary
We beschrijven hier de werking van een microfluïdische apparaat dat continue en hoge-resolutie microscopische beeldvorming van enkele ontluikende gistcellen kunnen gedurende hun volledige replicatie en / of chronologische levensduur.
Abstract
We demonstreren het gebruik van een eenvoudige microfluïdische setup, waarbij enkele gist cellen gedurende hun gehele levensduur kan worden gevolgd. De microfluïdische chip maakt gebruik van het verschil in grootte tussen moeder en dochter cellen met behulp van een array van micropads. Bij laden, worden de cellen gevangen onder deze micropads, omdat de afstand tussen de micropad en dekglas is vergelijkbaar met de diameter van een gistcel (3-4 um). Na het laden wordt kweekmedium continu doorgespoeld chip, die niet alleen zorgt voor een constante en gedefinieerde milieu gedurende het gehele experiment, maar ook spoelt de nieuwe dochtercellen, die niet onder de elektroden vanwege hun kleinere afmetingen behouden. De setup behoudt moedercellen zo efficiënt dat in een experiment tot 50 individuele cellen kunnen worden gecontroleerd op volledig geautomatiseerde wijze gedurende 5 dagen of eventueel langer. Bovendien, de uitstekende optische eigenschappen van de chip mogelijk highResolutie beeldvorming van cellen tijdens het hele verouderingsproces.
Introduction
Ontluikende gist is een belangrijk modelorganisme voor veroudering onderzoek 1. Tot voor kort studeren replicatieve veroudering in gistcellen een bewerkelijk proces waarbij een uitsnijmethode, waarbij elke top handmatig werd uit de moedercel 2,3. Om dit probleem op te lossen, hebben we onlangs een nieuwe microfluïdische setup staat om individuele moeder cellen te volgen gedurende hun hele levensduur 4.
In onze microfluïdische chip, worden gistcellen gevangen onder zacht elastomeer gebaseerde micropads (zie figuur 1). Een continue stroom van medium spoelt nieuw gevormde dochtercellen dat de cellen met verse voeding. In een experiment, kan tot 50 moedercellen worden gecontroleerd op volledig geautomatiseerde wijze gedurende de gehele replicatieve levensduur. Door de uitstekende optische eigenschappen van de microfluïdische chip, is het mogelijk om verschillende aspecten van gist celbiologie (bijv. gelijktijdig controleren </em> met behulp van fluorescerende eiwitten).
Vergeleken met de klassieke uitsnijmethode, de microfluïdische opstart biedt aanzienlijke voordelen. Het zorgt voor een gedefinieerde en constante milieu gedurende de hele veroudering experiment. Het vereist geen dure gespecialiseerde apparatuur en kan worden uitgevoerd op elke microscoop uitgerust met automatische scherpstelling en time-lapse vaardigheden en temperatuur-controle voor celkweek. De productie en exploitatie van de microfluïdische chips geleerd kan worden binnen een paar dagen. Daarnaast kunnen cellen direct worden geladen van een exponentieel groeiende kweek, een voordeel boven andere onlangs microfluïdische wijze 5 dat biotinylering van moedercellen vereist. Een combinatie met hoge-resolutie afbeelding, de hier beschreven werkwijze kan worden gebruikt om geleidelijke veranderingen te meten in cellulaire morfologie, eiwit expressie en lokalisatie tijdens gist veroudering op een ongekende manier. De mogelijkheid omlangdurige bewaking van de afzonderlijke cellen biedt ook unieke mogelijkheden voor gist celcyclus studies.
Deze methode is een onlangs geoptimaliseerd om de biotinylering van het protocol 16, dat werd gepubliceerd terwijl dit manuscript in beoordeling verwijderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De microfluïdische hier beschreven methode is een belangrijk nieuw instrument in het verouderen onderzoek als het in staat stelt eenvoudig en automatisch genereren van gist replicative levensduur data in combinatie met een continue hoge resolutie imaging. Deze eigenschappen zijn belangrijke verbeteringen in de experimentele mogelijkheden van de klassieke uitsnijmethode, maar er zijn enkele beperkingen van de methode waarmee rekening moet worden gehouden.
Merk op dat de bepaalde replicatieve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen Laura Schippers bedanken voor het schrijven van de eerste versies van de cel laden protocol en Marcus de Goffau en Guille Zampar voor het maken van mitochondriale morfologie.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
