Vi presenterer en teknikk for merking enslige nevroner i sentralnervesystemet (CNS) av<em> Drosophila</em> Embryoer, som tillater analyse av neuronal morfologi ved enten overført lys eller konfokal mikroskopi.
I denne artikkelen beskriver vi hvordan du individuelt merke nevroner i de embryonale CNS av Drosophila melanogaster etter juxtacellular injeksjon av lipofile fluorescerende membran markør DII. Denne metoden gjør det mulig visualisering av neuronal celle morfologi i stor detalj. Det er mulig å merke en celle i CNS: celle organer av target nevroner er visualisert henhold DIC optikk eller ved ekspresjon av et fluorescerende genmarkør eksempel GFP. Etter merking kan DII bli omdannet til en permanent brun flekk ved photoconversion å tillate visualisering av cellemorfologi med overført lys og DIC optikk. Alternativt kan Dii-merkede celler observeres direkte med konfokalmikroskopi, slik genetisk innført fluorescerende reporter proteiner for å bli colocalised. Teknikken kan brukes i noe dyr, uavhengig av genotype, som gjør det mulig å analysere mutant fenotyper ved enkelt celle oppløsning.
Kjennskap neuronal morfologi på nivået av individuelle celler er en viktig forutsetning for å forstå neuronal tilkobling og CNS-funksjonen. Derfor, fra de tidligste dagene av nevrovitenskap, har forskerne forsøkt å utvikle enkelt celle merking teknikker (se 7 for en historisk behandling av denne saken). Klassiske metoder som Golgi farging gir utmerket oppløsning av neuronal morfologi, men er ikke egnet hvis man søker å merke en spesiell type nervecelle i en rettet måte, som farging oppstår i en tilfeldig måte. Utvikling av metoder for farging enkeltceller ved intracellulær eller juxtacellular injeksjon av fargestoffer fra en microelectrode adressert kravet om spesifikk merking.
Anvendelsen av enkelt Nevron fargestoff injeksjon til Drosophila presentert en stor utfordring, på grunn av den lille størrelsen av både organismen og dens neuroner. Likevel, enkelt Nevron farging av embryonale Drosophila </em> Nevroner ble oppnådd i midten av 1980-tallet i laboratoriet av Corey Goodman 15. Mens metoden har vært utpreget nyttig og har gitt noen viktige innsikter i mekanismene for neuronal utvikling i Drosophila over de siste 20-30 år (2 f.eks, 10), har mange arbeidstakere skvatt unna det, hovedsakelig på grunn av sine tekniske krav.
Tilgjengeligheten i de senere år av genetiske teknikker for neuronal merking i Drosophila har også bidratt til upopularitet av enkelt Nevron fargestoff injeksjon. GAL4-regissert uttrykk for membran målrettede GFP konstruerer kan gi god oppløsning av nevrale morfologi 1, 20. Imidlertid har denne metoden visse begrensninger: den ofte uunngåelig uttrykk for GFP i flere celler kan skjule strukturen i enkelte nerveceller og en GAL4 driver linje kan ikke være tilgjengelig for å kjøre uttrykk i en bestemt nevron av interesse. Den MARCM (Mosaic Analyse med Repressible Cell Marker) metode 8 kan gi merking av hovedsak enhver Nevron på individ cellenivå, men kan ikke med hell brukes i embryo og tidlig larven grunn av treg omsetningen av GAL80 proteinet.
Gitt disse begrensningene av genetisk merking, tror vi at enkelt Nevron fargestoff injeksjon i Drosophila embryo forblir en verdifull teknikk og fortjener bredere anvendelse. Å fremme dette målet, gir vi her en detaljert beskrivelse av metoden. En illustrasjon av sin makt er gitt av vår siste redegjørelse for morfologi av komplett sett av interneurons i abdominal neuromeres på slutten Drosophila embryo 14. Denne studien, som viste både morfologiske variasjon av individuelle nevrale celletyper og prinsippene for neuromere organisasjon i CNS av embryoet, ville ikke vært mulig med noen annen tiden tilgjengelig merking metoden.
En stor fordel med Drosophila som modellsystem er at det tillater analyse av utvikling og funksjon av nivået av enkeltceller. Dette er spesielt nyttig om nervesystemet, hvor mangfoldet av celletyper er eksepsjonelt høy og funksjon og morfologi av nabocellene kan være helt annerledes.
Metoden vi her presenterer tillater merking av individuelle nevroner med et fargestoff som kan enten omdannes til et permanent flekk eller undersøkt direkte ved fluorescens mikroskopi. Det avslører…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra DFG til GMT
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
REAGENTS | |||
DAB | Sigma-Aldrich | D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
DiI | Invitrogen/Molecular Probes | D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
Glycerol | Roth | 3783 | 70% in PBS |
Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
PBS | 1x | ||
TRIS | Roth | 4855 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
EQUIPMENT | |||
Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
DC – amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
Coverslips | Menzel | BB018018A1 | 18 x 18 mm |
Coverslips | Menzel | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
Flat Capillaries | Hilgenberg | outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
Object Slides | Marienfeld Superior | 1000000 | |
Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1.