EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼
Summary
단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.
Abstract
프로테오믹스 연구는 전례없는 정밀도 진핵 세포 프로테옴의 인상적인 복잡성을 밝혔다. 지금 세포에있는 단백질은 주로 고립 된 개체로하지 존재하지만, 대부분의 경우 모든 생명 기능을위한 셀의 조립 라인을 형성, 인간 10 명 이상, 많은 다른 단백질과 관련있는 생물학적 활성을 발휘하는 일반적으로 인정 개념이다. 1 이 multiprotein의 어셈블리의 기능과 구조의 2 지식은 자세한 분석을 위해 우수한 품질과 충분한 양에서의 공급이 필요합니다. 세포에서 많은 단백질 단지의 소수는 진핵 세포에서 특히 네이티브 소스에서 해당 추출을 금지하고, 재조합 생산을 필요로한다. 배큘로 바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS)는 진핵 생물의 단백질을 생산하는 데 특히 유용한 것으로 입증되었습니다,의 활동은 종종 번역 후 처리에 의존하는 다른 일반적으로 사용되는 발현 시스템은 종종 할 수있는지원하지 3. BEVS 관심의 유전자가 차례로 선택의 단백질을 생산하는 곤충 세포 배양을 감염 삽입 된 재조합 배큘로 바이러스를 사용합니다. MultiBac 특히 많은 소단위를 포함하는 진핵 세포 단백질 단지의 생산을위한 맞춤형 된 BEVS이다. 4 효율적인 단백질 생산과 단지를위한 중요한 전제 조건 이상적으로 구현 될 수있는 식 실험에 관련된 모든 단계에 대한 강력한 프로토콜입니다 표준 작업 절차 (SOP)와 비교 쉽게 전문가가 아닌 사용자도 따랐다. 유럽 분자 생물학 연구소 (EMBL)에서 MultiBac 플랫폼은 단백질의 소규모 분석 외래 단백질 생산 특성에 최적화 된 설계 baculoviral 게놈에 유전자의 삽입부터 시작 multiprotein의 복잡한 발현 실험에 관련된 모든 단계에 대한 SOP를 사용 생산 시편. 5-8 플랫폼EMBL 그르노블에서 오픈 액세스 모드로 설치되어 학계 및 단백질의 복잡한 연구 프로젝트를 가속화하는 업계의 많은 과학자를 지원하고 있습니다.
Introduction
생물학적 활성은 단백질과 세포 기능을 촉진하기 위해 콘서트에서 역할을 다른 생체 분자의 어셈블리에 의해 제어됩니다. 주목할만한 예는 메신저 RNA에 DNA에 들어있는 유전 정보를 표기 기계 있습니다. 인간, 100 개 이상의 단백질이다 RNA 중합 효소 II와 같은 TFIID, TFIIH 등과 같은 일반적인 전사 인자. 9 다른 예제를 포함하여 10 더 소단위 대형 multiprotein의 단지를 형성 유전자를 속기 정의와 규제 과정에서 함께 온 리보솜, 단백질 합성, 또는 진핵 생물의 핵 봉투를 통해 생체 분자를 왕복을 담당하는 핵 기공 복합체를 촉매 많은 단백질과 RNA 분자로 구성. 셀에 기본적으로 모두 다 성분계 시스템의 상세한 건축 및 생화학 해부 그들의 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 원핵 세포와 eukar의 구조 규명yotic 리보솜은, 예를 들어, 이러한 고분자 기계 셀에 자신의 지정된 기능을 수행하는 방법에 전례없는 통찰력을 항복 특징 이벤트를 창설. 10,11
리보솜은 최대 세포 질량의 30 %가 리보솜으로 구성되어 있다는 사실로 인해 배양 세포에서 내인성 물질을 정화하여 자세한 연구를위한 충분한 질과 양에서 얻을 수 있습니다. RNA 중합 효소 II는 다른 중요한 단지의 압도적 인 다수가있는 그러나 존재 이미 효모 문화의 적은 크기의 순서로 풍부한, 많은 천 리터 전사의 중심이 필수적인 복합의 세부 원자 뷰를 얻기 위해 처리해야했습니다. 12 따라서 원시 세포, 그리고 훨씬 낮은 금액 네이티브 소스 재료에서 적절하게 정제 할 수 없습니다. 자세한 구조와 기능 분석에 액세스 같은 단지를 렌더링하려면 재조합 테를 사용하여 이종의 생산을 필요로chniques.
재조합 단백질 생산은 생명 과학 연구에 큰 영향을 미쳤다. 대부분의 단백질은 재조합 생산, 그들의 구조와 기능은 높은 해상도 해부 하였다. 구조 유전체학 프로그램은 높은 처리량 (HT) 모드에서 전체 생물의 유전자 제품의 레퍼토리를 해결하기 위해 많은 생물의 게놈의 해명의 장점을 가지고있다. 단백질 구조의 수천 따라서 결정되었습니다. 지금까지, 재조합 단백질 생산을위한 가장 다산 사용되는 시스템은 E.되었습니다 대장균, 많은 발현 시스템이 호스트 외래 생산 년 동안 개발하고 세련되었다. E.에서 단백질 생산을 가능하게하는 기능의 과다를 숨겨 플라스미드 대장균 상업 제공자의 전체 카탈로그를 작성하십시오.
하지만, E. 대장균은 많은 진핵 생물의 단백질을 생산하는 것이 적합하지 않은 특정 제한 사항이 있습니다 및 P의많은 소단위와 관절 단백질 복합체. 따라서, 진핵 호스트 단백질 생산은 증가 최근 몇 년 동안 선택의 방법이되었다. 진핵 생물의 단백질을 생산하기 위해 특별히 잘 적응 시스템은 실험실에서 재배 곤충 세포 배양을 감염 외래 유전자를 운반하는 재조합 배큘로 바이러스에 의존 배큘로 바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS)입니다. MultiBac 시스템은 특히 많은 소단위 (그림 1) 진핵 세포 단백질 단지의 생산에 맞게 조정되어 더 최근에 개발 된 BEVS입니다. MultiBac는 2004 년에 처음 도입되었다. 13는 도입 이후, MultiBac 지속적으로 세련되어 있고, 취급을 간단하게 목적 단백질의 품질을 개선하고 일반적으로 효율적인 표준 운영 절차 (SOP에)를 설계하여 비 전문가 사용자에게 시스템에 액세스 할 수 있도록하는 스트림 – 늘어서있다. 4 MultiBac는 AC에 전 세계적으로 많은 실험실에서 구현되었습니다ademia 산업. 그르노블에서 EMBL에서 다국적 액세스 프로그램은 그들의 연구를 발전이 생산 시스템을 사용하고자 과학자 MultiBac 플랫폼에서 전문적인 교육을 제공하기 위해 유럽위원회에 의해 장소에 넣어했다. 그들은 EMBL 그르노블에서 MultiBac 시설에 운영에 있기 때문에 지금까지 접근되지 않은 많은 단백질 복합체의 구조와 기능 MultiBac으로 제작 샘플을 사용하여 해명했다. 4 다음에서 MultiBac 생산의 필수적인 단계는 프로토콜에 요약되어있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그림 2와 3의 비디오 스냅 샷 Multigene 사 표현의 cDNA를에서 로봇을 이용한 세대에서 전체 프로세스를 설명하는 단백질 생산을위한 곤충 세포 배양 감염으로 모든 방법을 구성합니다. 새로운 시약 (플라스미드 및 바이러스) 및 강력한 프로토콜을 표준 운영 절차에 의존하는 파이프 라인을 사용하기 위해 개발되었습니다. 전체 파이프 라인은 그르노블에서 EMBL에서 플랫폼 기술로 구현되?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 크리스토프 Bieniossek, 사이먼 Trowitzsch, 다니엘 피츠 제럴드, 유이치로 타카, 크리스티안 Schaffitzel, 이본 Hunziker, 티모시 리치몬드와 도움과 조언 버거 실험실의 과거와 현재의 회원을 감사드립니다. MultiBac 플랫폼과 개발했습니다 아낌없이 스위스 국립 과학 재단 (SNSF) 직원은 국립 공들인 (ANR)와 센터 국립 공들인 Scientifique (CNRS)와 유럽위원회 (EC) 등의 자금 지원 기관에서 지원하는 프레임 워크 프로그램 (FP) 6과 7. 다국적 액세스에 대한 지원은 EC FP7 프로젝트 P-CUBE (에 의해 제공됩니다 www.p-cube.eu )와 BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). 과학의 프랑스 교육부는 특히 투자 회사 디 Avenir에서 프로젝트 FRISBI 통해 EMBL에서 MultiBac 플랫폼을 지원하기 위해 인정 받고 있습니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
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