Brug High Resolution Computed Tomography at visualisere de tredimensionelle struktur og funktion af dyrs vaskulatur

Summary

Høj opløsning røntgen computertomografi (HRCT) er en ikke-destruktiv diagnostisk billeddannelsesteknik, som kan anvendes til at studere strukturen og funktionen af ​​plante vaskulatur i 3D. Vi viser, hvordan HRCT letter udforskning af veddet netværk på tværs af en bred vifte af plantevæv og-arter.

Abstract

Høj opløsning x-ray computertomografi (HRCT) er en ikke-destruktiv diagnostisk billeddannelse teknik, med sub-micron opløsning kapacitet, der nu bruges til at evaluere strukturen og funktionen af anlægget xylem netværk i tre dimensioner (3D) (f.eks Brodersen et al . 2010; 2011; 2012a, b). HRCT billeddannelse er baseret på de samme principper som medicinsk CT-systemer, men en høj intensitet synkrotron x-ray kilde resulterer i højere rumlig opløsning og faldt billede erhvervelse tid. Her vil vi vise i detaljer, hvordan synkrotron-baserede HRCT (udføres på Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) i kombination med Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) bliver brugt til at udforske plante xylem i udskårne væv og levende planter. Dette nye imaging værktøj giver brugerne mulighed for at bevæge sig ud over traditionelle statiske, 2D lys eller elektronmikrofotografier og studere prøver ved hjælp af virtuelle serielle sektioner i ethvert plan. Et uendeligt antal skiver i en retning cen ske på den samme prøve, en funktion, der er fysisk umuligt anvendelse af traditionelle mikroskopi metoder.

Resultaterne viser, at HRCT kan anvendes på både urteagtige og træagtige plantearter, og en række planteorganer (dvs. blade, bladstilke, stængler, stammer, rødder). Tallene her bidrager til at påvise både en række repræsentative plante vaskulær anatomi og typen af detaljer udvundet af HRCT datasæt, herunder scanninger for kysten redwood (Sequoia sempervirens), valnød (Juglans spp.), Eg (Quercus spp.), Og ahorn ( acer spp.) plantemateriale til træer til solsikker (Helianthus annuus), vindruer (Vitis spp.), og bregner (Pteridium aquilinum og Woodwardia fimbriata). Udskåret og tørrede prøver fra træsorterne er lettest at scanne og typisk giver de bedste billeder. Imidlertid har de seneste forbedringer (dvs. hurtigere scanninger og prøve stabilisering) gjort det possenelig at bruge denne visualisering teknik på grønne væv (f.eks bladstilke) og i levende planter. Ved lejlighed nogle krympning af hydratiserede grønne plantevæv får billeder til at sløre og metoder til at undgå disse problemer er beskrevet. Disse nylige fremskridt med HRCT giver lovende nye indsigter i plante vaskulære funktion.

Introduction

Vandet transporteres fra planterødder til bladene i en karvæv kaldet xylem - et netværk af indbyrdes forbundne ledninger, fibre og levende, metabolisk aktive celler. Transport funktion af plante xylem skal opretholdes til at levere næringsstoffer og vand til blade til fotosyntese, vækst og i sidste ende overlevelse. Vand transport i veddet ledninger kan blive forstyrret, når veddet netværket kompromitteret af patogene organismer. Som svar på disse infektioner planter ofte producerer geler, gummier og tyloses som et middel til at isolere patogen spredning (f.eks McElrone et al 2008; 2010). Tørke stress kan også begrænse vandtransport i veddet. Som planter mister vand under langvarig tørke, spænding bygger i veddet saft. Vand under spænding er metastabile (dvs. ved en vis tærskel spændingen bliver stor nok til at kavitere vand kolonner i xylem ledninger). Efter kavitation opstår, kan en gas boble (emboli) danne og udfylde conduit, effektivt blokerer vandbevægelse (Tyree og Sperry 1989), et fænomen, analog med dykkersyge (dvs. "de bøjer sig") i dybe hav dykkere.

Trods betydningen af veddet vandtransport for optimal plante funktion påvist via et stort system af historisk og nutidig litteratur om dette emne (Tyree & Zimmermann, 2002;. Holbrook et al, 2005), er der stadig aspekter af veddet netværk, der forbliver undvigende . Flere forskergrupper har for nylig begyndt at anvende Høj opløsning x-ray computertomografi mikro-tomografi (HRCT) for at evaluere finere detaljer i træ anatomi og karvæv (f.eks Mayo et al; 2010, 2008; Mannes m.fl. 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012a, b; Maeda og Miyake, 2009; Steppe et al 2004).. HRCT er en destruktiv teknik, der anvendes til at visualisere funktioner i det indre af faste genstande og opnå digital information om deres 3D-strukturelle egenskaber. HRCTafviger fra konventionel medicinsk CAT-scanning i sin evne til at opløse detaljer så små som en mikron i størrelse, selv for high density objekter. Nylige fremskridt inden synkrotron HRCT-teknologi har forbedret billedopløsning og signal-støj-forholdet tilstrækkeligt, således at plante fartøj net og intervessel forbindelser kan visualiseres, tildelt 3D koordinater, og eksporteres til hydrauliske modelsimuleringer. Brodersen et al. (2011) for nylig fremført denne teknik ved at kombinere 3D rekonstruktioner genereret af synkrotron HRCT med et Fortran-model, der automatisk trækker data fra veddet netværk på meget højere opløsning end nogensinde var muligt med traditionelle anatomiske metoder (dvs. seriel sektionering med en microtome og billedoptagelse med lysmikroskopi, f.eks Zimmermann 1971). Dette arbejde er også blevet brugt til at optimere hydrauliske modeller af veddet, og identificeret unikke egenskaber transport (dvs. reverse flow i nogle vessels i perioder med spidsbelastning transpiration) (Lee et al., i gennemgang).

Synkrotron HRCT kan nu anvendes til at visualisere xylem funktionalitet, følsomhed over for kavitation, og en planternes evne til at reparere emboliserede ledninger. Manglende genetablere flow i emboliserede ledninger reducerer hydraulisk kapacitet, grænser fotosyntese, og resulterer i plante død i ekstreme tilfælde (McDowell et al. 2008). Planter kan klare emboli ved at omdirigere vand omkring blokeringer via gruber forbinder tilstødende funktionelle kanaler, og ved at dyrke nye xylem til at erstatte tabt hydraulisk kapacitet. Nogle planter har evnen til at reparere brud i vandet kolonner, men detaljerne i denne proces i veddet under spænding er forblevet uklart i årtier. Brodersen et al. (2010) for nylig visualiseret og kvantificeret genpåfyldning proces i levende vinstokke med HRCT. Vellykket fartøj genpåfyldning var afhængige af vand tilstrømning fra levende celler omgiver xylem ledninger, hvor individuelle vanddråber udvidet med tiden, fyldte kar og tvang opløsningen af ​​indesluttet gas. Kapaciteten af ​​forskellige planter til at reparere kompromitterede xylem fartøjer og de mekanismer, der styrer disse reparationer er i øjeblikket ved at blive undersøgt.

Beskrivelse af ALS facilitet beamline 8.3.2

Vores arbejde til dato er blevet udført på Hard X-ray Micro-Tomography beamline 8.3.2 på Advanced Light Source i Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA). Plant prøver anbringes i en bly-foret Hutch ligger 20 m fra x-ray kilde, der genereres af en 6 Tesla superledende bend magnet dipol inden for Advanced Light Source elektron lagerring opererer på et kritisk energi på 11,5 KeV. En skematisering af endestationen er vist i figur 1.. De røntgenstråler ind i bur med en stråle størrelse på 40x ~ 4,6 mm og passerer gennem prøven, der er monteret på en motoriseret roterende fase. Dentransmitterede røntgenstråler kolliderer med en krystal scintillator (to materialer, der almindeligvis anvendes, er LuAG eller CdWO _4), som omdanner røntgenstråler til synligt lys, som videresendes via linser over på en CCD til billedsamling. Kameraet, scintillator og optik er indeholdt i en lystæt boks, der er på skinner, der gør det muligt for prøve-til-scintillator afstand kan optimeres til fasekontrast billeddannelse.

Alle prøver er monteret på 10 cm diameter roterende fase, som igen er monteret på horisontale og vertikale oversættelse faser for prøve positionering. En levende plante prøve, med rodsystemet monteret i et specialbygget anlæg grydelap og løvet indeholdt i en akryl rør, kan ses i figur 2. Typiske eksponeringstider kan variere fra 0,1 til 1 sekund ved hjælp 10-18 KeV, og scanning varighed vil variere fra 5 til 40 minutter afhængigt af indstillingerne optimeret til en bestemt prøve. For høje prøver (typisk af plantebeskyttelsesmidler xylem net), kan data scanninger værefliser ved at gentage målingen med prøven i forskellige højder, som styres automatisk, så sømløse serielle sektioner langs en maksimal prøve højde på ~ 10 cm. Største prøve bredde, når billedbehandling på 4,5 um opløsning er ~ 1 cm for prøver, der er næsten perfekt i lodret retning. Datagenerering og forarbejdningen er afsluttet brug af protokollen anført nedenfor. På grund af forskellen i x-ray dæmpning mellem luft og vand, kan fremragende billedkontrast opnås i planter uden anvendelse af kontrastmidler opløsninger typiske medicinske CT-systemer. Det luftfyldte karhulrummet er let at skelne fra den omgivende vandfyldte væv i hydratiserede planter.

Protocol

Protokol detaljer beskrevet nedenfor, blev skrevet specielt til arbejde på Advanced Light Source 8.3.2 beamline. Tilpasninger kan være påkrævet for arbejde på andre synkrotron faciliteter. Korrekt sikkerhed og strålingsbeskyttelse uddannelse er nødvendig for anvendelsen af ​​disse faciliteter.

1. Sample Preparation for Levende Planter

1. Dyrke planter i ~ 10 cm diameter pots, og sikre, at hovedstammen (eller del af planten, der skal scannes), som er centreret som muligt og orienteret vertikalt i potten. De fysiske dimensioner af HRCT instrument Hutch på Advanced Light Source grænser levende planter til ~ 1 meters højde. Som følge heraf er billeddannelse af levende planter bedst udført på kimplanter / udplantningsplanter dyrkes i små potter. Afhængigt af forsøget, kan forskellige jordtyper anvendes til at styre jordens vandindhold (fx i tørke eksperimenter), og for nogle planter med fleksible skud (f.eks vinstokke) længere skud kan være omhyggeligt tucked i acrylrør beskrevet nedenfor (se figur 1 og 2).
2. Monter levende potteplanter i en skræddersyet stiv aluminium grydelap. Toppladen kan indstilles til at rumme en række pot højder. Toppen af ​​pladen er udformet til at flugte med toppen af ​​jordoverfladen, og de plantearter rager frem fra midten af ​​den todelte plade. Formålet med grydelappen er at sikre anlægget stamceller holdes fast på plads for at minimere vibrations-eller prøve bevægelse. Minimering prøve bevægelse under en scanning er af afgørende betydning.
3. Når monteret i holderen, måle stammen vandpotentiale eller blad transpiration under anvendelse af en Scholander stil trykkammer eller en clip-on blad Porometer henholdsvis at bestemme den fysiologiske status af anlægget inden scanning.
4. Placer en tyndvægget akryl cylinder over anlægget og på toppen af ​​aluminiumsværk holderen og fastgør det på plads med ler kit til at stabilisereprøve (fig. 2). De vibrationer og bevægelse af det øvre blade sendes ned stilken og forårsage plantevævet i det scannede område til at bevæge sig i sidste ende fører til billedforvrængning. Cylinderen anvendes til at indeholde plante løv og forhindre blade fra gnide mod andre stykker udstyr i Hutch, der ville resultere i vibrationer under en scanning. Yderligere plastfolie, papirhåndklæder og tape bør anvendes til yderligere at minimere vibration og bevægelse af plantedele (se problemer forbundet med prøve bevægelse i figur 4). For at mindske sin x-ray absorption (som kan reducere billedkvaliteten ved en given eksponering tid), bør der indeholder cylinder have så tynde vægge som muligt og samtidig opretholde tilstrækkelig stivhed til at udføre sin funktion.
5. Sæt skik grydelap til luftleje scenen og låse den (skrue) på plads mellem x-ray kilde og billedsensoren og kameraudstyr. Posipå skaftet så lodret som muligt og centrum på magnetisk chuck bund for at sikre at prøven forbliver i synsfeltet under rotation.

2. Sample Preparation for Friske, udskåret Plant Tissue

1. Frisk plantemateriale, typisk stængler eller bladstilke, kan scannes efter øjeblikkelig fjernelse fra en levende plante. Hvis hensigten med forsøget er at visualisere hele det veddet netværket, vand inden fartøjerne skal fjernet og erstattet med luft. For at gøre dette, skal du montere prøven i en Scholander stil trykkammer og skub trykluft eller nitrogen gennem prøven ved lavt tryk (<0,05 MPa) i ca 5 min. Arter vil adskille sig i den tid, der kræves for at evakuere beholderen netværket. Hvis hensigten er at vurdere omfanget af embolisme dannelse i frisk plantevæv, derefter punktafgiftspligtige prøver fra anlægget med en frisk barberblad og gøre snit under vand.
2. Pak prøven i et lag af Parafilm til prbegivenhed udtørring under scanningen.
3. Montere prøven på et bor-patron fastgjort til en metalplade, som er skruet ind i luftleje fase. Center og orientere prøven vertikalt som beskrevet ovenfor for at sikre at prøven forbliver i synsfeltet.

3. Sample Forberedelse til Tørrede Woody Væv

1. For optimal vævsprøve visualisering og kontrasten i billedet, er det nødvendigt at langsomt dehydrere hele woody vævsprøve. Skåret prøver til cirka 6 cm lang. Udtage der er så lige som muligt i den målrettede scan regionen og har en diameter på ≤ 1 cm.
2. Anbring woody vævsprøven i en tørreovn ved lav temperatur til langsomt at tørre prøven uden at forårsage revnedannelse eller spaltning af vævet. Denne proces er sandsynligvis variere mellem arter og væv. For woody stilke, er 12 timer i en 40 ° C ovn typisk tilstrækkelig til at levere fremragende kontrast uden at forårsage signifikante changes i den fysiske struktur af stammen (se problemer med hurtig tørring vist i figur 3).
3. I nogle situationer er det ønskeligt at have en betroet markør i prøven, således at efterfølgende dissektion og visualisering med scanningselektronmikroskopi kan orienteres til specifikke steder i HRCT billede. For at gøre dette, anbringer et metal eller glasperle eller wire til ydersiden af ​​stilken med Parafilm. En anden fremgangsmåde er at anvende en siliconeharpiks (f.eks RTV-141, Bluestar Silicones, East Brunswick, NJ), som kan injiceres i en enkelt xylem ledning (se eksempler i Brodersen et al 2010). Når hærdet, siliconeharpiksen er klart synlig i prøven og let at skelne fra de andre luftfyldte fartøjer. Brug denne markør til præcist at lokalisere specifikke områder af prøven.
4. Montere prøven i borepatronen og midten som beskrevet ovenfor.

4. Sample Forberedelse til Leaf Tissue for to dimensionelle (2D) radiogrammer

1. At visualisere beholderindholdet i blade i nær-realtid, kan bladene blive scannet at frembringe et 2D radiogram, svarende til en dental x-ray. Monter bladet mellem to plader af tynd akryl plast, og fastgør kanterne med clips. Fastgør derefter monterede prøve til en post-holder system og position den optiske breadboard siden af ​​billeddannende system og x-ray kilde.

5. Scanning af prøven i 8.3.2 Hutch

1. Beslut forstørrelsen der vil fungere bedst for din ansøgning. ALS beamline 8.3.2 har evnen til at scanne med objektiver med forstørrelser på 2x, 5x, og 10x. Disse medfører billedpixeldata størrelser på 4,5, 2,25 og 0,9 um hhv. Afhængigt af forstørrelsen, skal prøven være af passende størrelse, som synsfeltet falder med stigende forstørrelse. Se detaljer for valg af kamera og objektiv, og det resulterende billede parametre i tabel 1.

	PCO.4000 (4008x2672)		PCO.Edge (2560x2160) (Optique Peter)
Lens	pixel (um)	synsfelt (mm)	pixel (um)	synsfelt (mm)
10x	0,9	3,6	0.65 (0.69)	1.7 (1.7)
5x (4x)	1,8	7,2	1.3 (1.72)	3.3 (4.4)
2x	4,5	18	3.25 (3.44)	8.3 (8.8)
1x	9	36	6.5 (-)	16,6 (-)

Tabel 1. Detaljerede tilgængeligkameraer og objektiver på ALS 8.3.2.

2. Sæt x-ray energi til 15 keV. Dette har vist sig at give fremragende billedkvalitet kontrast til de fleste planter ansøgninger (se Brodersen et al. 2010, 2011, 2012a, b). Eksponeringstider i almindelighed afhænger af tykkelsen og densiteten af ​​prøven (og således forstørrelsesgraden anvendes) på mellem 100 og 1000 msek. Længere eksponeringstider (så længe detektorbilledpunkter ikke er mættede) vil generelt føre til højere signalstøjforhold, men på bekostning af øgede scanningstider.
3. Vælg en vinkeltilvækst der er relevant for din ansøgning. Prøver drejet 180 ° under en scanning, og antallet af billeder taget under rotationen kan have en betydelig indvirkning på størrelsen af ​​datasættet, længden af ​​scanningen interval, og det endelige billede kvalitet, men der er generelt faldende afkast i kvalitet. Typiske scanninger udføres ved 0,25 ° intervaller, hvilket giver 721 billeder pr scanning. Reducere de increment til 0,125 ° resulterer i bedre billeder til at visualisere fine detaljer, men udbyttet 1.440 billeder og dermed en meget større datasæt (for en typisk område af interesse, betyder ~ 10-30 GB data mod 5 GB). Imidlertid er signal-støj-forholdet ofte forbedret og værd at både den øgede scanningstiden og data størrelse. Tørre stængler, som næppe vil blive deformeret / krympe under en scanning kan udsættes for længere intervaller (mindre vinkeltilvækst) uden skade. Når imaging levende planter, hvor biologiske processer (f.eks emboli reparation) finder sted på korte tidsskalaer, vælger de kortere scanneintervaller er at foretrække at begrænse potentielle skadelige virkninger af røntgenstråling på dette væv-selvom dette kommer på et potentielt tab af billedkvalitet. Kortere scanneintervaller kan opnås ved hjælp af kontinuerlig Tomography indstilling, i hvilken prøven kontinuerligt roterer mens billederne er taget.
4. For hver scanning, skal "lyse felt" og "mørke felt" billeder være corrected. Bright felt billeder er billeder uden prøven i strålen. Disse er ofte indsamlet før og efter scanningen af ​​prøven horisontalt oversætte prøven. Mørke felter opsamles ved at lukke røntgen lukkertidsprioriteret dette målt mængden af ​​signal kameraet viser uden røntgenstråler.

6. Data Processing

1. Overfør de "rå" 2D. TIF-billeder, der blev eksporteret fra købet computer til en filserver, til en databehandling computer. Hvis computeren har tilstrækkelig RAM, kan dataene kopieres til en såkaldt "RAM Drive" (en del af RAM vises som en harddisk på computeren). På denne måde software ikke har adgang til en roterende harddisk, som er relativt langsom sammenlignet med en solid state-drev eller flashhukommelsen. Dette trin reducerer den mængde af tid, der kræves til at behandle datasæt.
2. Billederne skal omdannes til en procent transmission skala. Beamline 8.3.2 har en brugerdefineret background normalisering plug-in, som kan downloades og bruges med den frit tilgængelige softwarepakker ImageJ eller Fiji ( http://fiji.sc/ ). Det trækker de mørke tællinger fra billederne og normaliserer prøven billeder ved de lyse felter for at give billeder, der viser procent transmission. Indlæs normaliserede billeder ind i Octopus softwarepakke ( http://www.inct.be/en/software/octopus ) og "rekonstruere" 3D datasæt fra de 2D rå. TIF-filer ved hjælp af de udpegede bearbejdningstrin (Normaliser billeder, Ring fjernelse , Sinogram skabelse, Parallel stråle rekonstruktion). Denne proces giver derefter en række. TIF tværgående (tværsnit) billeder består af "voxels" (volumetriske pixel elementer), hver med en x, y, z-koordinat og intensitet værdier repræsenterer x-ray lineær absorptionskoefficient.

7. Visualisering

1. Visualiseringze stablen af ​​billeder i et af en række software-pakker. Freeware (f.eks drishti, http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml ) kan anvendes til at visualisere mængder eller individuelle eller stakke af billeder (f.eks ImageJ eller FIJI). Andre softwarepakker kan anvendes til 3D. Vores forskergruppe bruger Avizo softwarepakken ( http://www.vsg3d.com/avizo/overview ), men andre, såsom Amira ( http://www.amira.com/ ) og VGStudioMax ( http://www. volumegraphics.com / ) er også almindeligt anvendt.
2. Indlæs datasæt i systemets hukommelse og vise prøven i virtuelle tværgående, langsgående, eller radiale skive orienteringer. På grund af de 3D-egenskaber af datasættet, virtuelle skiver gennem sample kan drejes i enhver plan for at tilpasse med de regioner af interesse, en væsentlig forbedring i forhold til traditionelle seriel lysmikroskopi (se film 1-3 for detaljerede eksempler).
3. At visualisere prøven efter behov i 3D, "segment" prøven ved hjælp af forskellige semi-automatiske og manuelle rutiner i Avizo at adskille karlumener eller andre strukturer fra omgivende væv. Segmentering refererer til at definere grænserne mellem objekter af interesse, således adskiller eller segmentere dem i separate regioner. Rendering mængder i 3D udføres af visualisering software. En fremgangsmåde til at gøre dette er direkte volumengengivelse, hvor hvert punkt i et volumen antages at udsende og absorberer lys, mængden og farven af ​​emission og absorption kan defineres ved anvendelse af en "colormap", og det resulterende fremspring i en given retning er vises på skærmen. Alternativt fremstilles en trådramme eller 3D mesh flade, som udgør de segmenterede grænser konstrueret til at vise en 3D-model af tHan struktur af interesse. 3D mesh består af polygonale elementer, og det samlede antal elementer vil påvirke både nøjagtigheden af strukturen reproduktion og størrelsen af den tilhørende datafil (dvs. flere elementer fører til højere kvalitet, men større filstørrelse). En række billedbehandling moduler er til rådighed inden for visualisering software til at styre lydstyrken rendering udgange, samt kontrol af billedets lysstyrke, kontrast, gennemsigtighed, støjreduktion, osv.

8. Kvantificering

1. Når segmentering er opnået, er det muligt at kvantificere målplanten strukturer eller funktionelle ændringer i volumen, længde, bredde, tilstedeværelse eller fravær af vand, luft osv. For eksempel Brodersen et al. (2010) brugte Avizo software til at kvantificere mængdeændringen af ​​vanddråber ind vinstok genpåfyldning fartøjer. Planter blev scannet hver 30 min i løbet af 4-8 timer at skabe en tid-laPSE sekvens af fartøjets genpåfyldning. Hver scanning blev rekonstrueret og indlæst i Avizo, hvor de enkelte dråber blev målt over tid, da deres volumen steg.

Representative Results

Synchotron HRCT scanninger er blevet gennemført med succes på en bred vifte af plantevæv og-arter ved hjælp af beamline 8.3.2 (figur 5), og har givet ny indsigt i struktur og funktion af plante xylem på hidtil uset opløsning i 3D. Visualisering og udforskning kapaciteter tilvejebragt af 3D rekonstruktioner (som illustreret i figur 6-8, og film 1-3) giver mulighed for præcis bestemmelse af placering og orientering af strukturer med veddet netværk på begge udskårne prøver og i levende planter.

I nogle situationer har prøve bevægelse eller utilsigtede vibrationer forårsaget fordrejninger i de endelige billeder, gøre de scanninger ubrugelige (f.eks figur 4), men forbedringerne at nedbringe scan tid (med kontinuerlig tomografi) har minimeret de skadelige virkninger af sådanne data tab, fordi mange flere scanninger kan nu afsluttet i den begrænsede beamtimeafsat til hver enkelt bruger. Disse kortere scanningstider også gøre det muligt for gentagne målinger af en enkelt replikat over tid for at fange dynamikken i processer som emboli spredning og reparation.

Figur 1. Skematisk af prøve scanningsproceduren og opsætning inde i bur ved ALS beamline 8.3.2 Øverst til venstre:. The x-ray kildestråle (1) forventes gennem prøven (2), der er fastgjort til luftbordet med en borepatron, der roterer under scanningen. De røntgenstråler, som passerer gennem prøven kolliderer med en krystal scintillator (4), som fluorescerer synligt lys, der er omdirigeret af et spejl (5) gennem linser (6) til et CCD-kamera (7), der optager et digitalt billede. De "rå" 2D x-ray billeder (øverste højre billede-eksempel er en plante stamceller prøve drejet 180 ° i løbet af en fuld scanning på en stigning på 0,25 ° resulterer i 720 2D-billeder) omdannes og resulterer i en stabel af tværgående billeder (nederst til højre), der anvendes til 3D rekonstruktioner. Klik her for at se større figur .

Figur 2. Billede, der tages i det bur af ALS beamline 8.3.2 viser en levende, indkapslede vinstok forberedt til scanning. Vinen er indeholdt i en akryl rør (1). The x-ray stråle kommer ind i buret til venstre (2), passerer derefter gennem prøven (f.eks grapevine stammen) (3) og derefter ind i en lystæt boks, der indeholder kameraet, scintillatoren og optik (boks ikke vist på billedet ).

"Fo: src =" / files/ftp_upload/50162/50162fig3highres.jpg "fo: indhold-bredde =" 4in "/>
Figur 3. Eksempel på sample krakning (betegnet med de hvide pile), når en træagtig root (ses her) blev underkastet tørring for længe og / eller ved for høj en temperatur. At undgå dette tab og opretholde strukturel integritet og trofasthed vævsstruktur i vivo dehydrering kræver nogle forsøg før tid. Scale bar = 1 mm.

Figur 4. Billede forvridninger, som det ses her talrige små træagtige rødder, resultat fra bevægelse af prøven under scanningen periode. I dette eksempel en kolonne af små træagtige rødder (hver lyse hvid plet er en enkelt root) stadig er fastgjort til en levende plante blev scannet og tilsyneladende flyttet under scanningen, og resultateted i det forvrængede billede. at overvinde dette problem prøver skal sikkert stabiliseret med yderligere polstring af acrylrør omgiver planten.

Figur 5. Eksempler på tværgående billeder af woody stilke scannes for (A) Coastal Redwood og (B) Valley Oak. Hvide skala barer er 1,0 mm på begge billeder. Klik her for at se større figur .

Figur 6. 3D rekonstruktion af en stamme genereret fra en HRCT scanning af en levende kystnære redwood unge træ er vist med en langsgående og transverse plan eksponeret. meste af veddet ses på dette billede er vandfyldt, mens der er luftfyldte kanaler i midten af stammen (sort pil), der førte fra kavitation under en tørke eksperiment. Denne scanning også fanget ledninger i den handling kaviterende-se de mellemliggende gråskala ledninger danner en ring omkring halvvejs mellem centrum og frempind ydre (hvid pil).

Figur 7. Billede fra Brodersen et al 2012 -. Plant, Cell & Miljø demonstrerer 3D rekonstruktion af veddet vaskulær arrangement i to bregne arter scannet på to forskellige punkter på frond vaskulære bundter er synlige i blåt, mens det omkringliggende væv er i grønt. I Pteridium aquilinum, det vaskulære bunvaser er optimeret for høj ledningsevne med mange forbindelser i både frond spids (a) og basen (c). I modsætning hertil har Woodwardia fimbriata en langt mere konservativ vaskulær arrangement med få forbindelser mellem bundterne i frond spids (b) og base (d). De resulterende vaskulære ordninger føre til høje fotosyntetiske satser i P. aquilinum men på bekostning af lav tolerance over for tørke, mens W. fimbriata er optimeret til frond levetid med lavere fotosyntetiske satser men højere tørke tolerance. Frond spids og bundsektioner er omkring 4 mm og 9 mm i diameter, hhv.

Figur 8. 3D rekonstruktion genereret fra en HRCT scanning af valnød stamceller xylem. Dette billede hjælper med at demonstrere evnen til at udforske væv i utrolig opløsning som disse er to tilstødende xylem ledninger, der deler et sammenkoblet væg for meget af deres længde. Her har den billedbehandling og udglatning fjernet den tynde delte karvæg i volumen rendering. Nøjagtige placering og tykkelsen af ​​denne karvæggen tilbageholdes i de rå billeddata og kan anvendes til at studere forbindelse. Hver af de tilsluttede fartøjer i dette billede har ~ 40 um diameter.

Movie 1. Klik her for at se film .

Movie 2. Klik her for at se film .

Movie 3.x/asset/supinfo/PCE_2524_sm_MovieS2.mov? v = 1 & s = 0f7e030bb72d2057d5a891215e375093e27e1102 "target =" _blank "> Klik her for at se film.

Discussion

Synchotron HRCT giver plantebiologer med en stærk, ikke-destruktiv værktøj til at udforske de indre funktioner af plante vaskulatur i utrolige detaljer. Denne teknologi er blevet brugt for nylig til at identificere tidligere ubeskrevet anatomiske strukturer i Grapevine xylem der differentielt ændrer xylem netværksforbindelse i forskellige vinavlsprodukter arter (Brodersen et al 2012b, i pressen.) - Dette tilslutningsmuligheder kan drastisk ændre evne vaskulære patogener og emboli at sprede destruktivt hele xylem net. De første succesfulde scanninger af levende planter har også afsløret fine skala detalje af dynamiske processer som emboli spredning og reparation (Brodersen et al 2010; McElrone et al 2012 Nyt Phytologist 196 (3) :661-665), og hjalp med at inddrage den rolle en specifik levende celle type i reparation blodprop-den rumlige opløsning, som HRCT hos ALS 8.3.2 gjort dette muligt. Specifikt om disse processer og andre Aspects af veddet netværk er stadig undvigende-HRCT vil sandsynligvis spille en central rolle i den fortsatte opdagelse især når parret med andre høj opløsning teknikker (f.eks Laser Capture mikrodissektion), og kan parres med andre nyligt udviklede avancerede visualiseringsteknikker til brug i plantebiologi ( fx Lee et al, 2006; Truernit et al, 2008; Jahnke et al 2009. Iyer-Pascuzzi et al 2010).

Materials

See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2