Ved hjelp av høyoppløselig CT for å visualisere tredimensjonale struktur og funksjon Plant vasculature

Summary

Høy oppløsning x-tomografi (HRCT) er en ikke-destruktiv diagnostisk avbildningsteknikk som kan brukes til å studere strukturen og funksjonen av anlegget vaskulatur i 3D. Vi viser hvordan HRCT forenkler utforskning av Xylem nettverk over et bredt spekter av plantemateriale og arter.

Abstract

Høy oppløsning x-ray computertomografi (HRCT) er en ikke-destruktiv bildediagnostikk teknikk med sub-micron oppløsning evne som nå brukes til å evaluere struktur og funksjon av anlegget Xylem nettverk i tre dimensjoner (3D) (f.eks Brodersen et al . 2010; 2011; 2012a, b). HRCT bildebehandling er basert på de samme prinsippene som medisinsk CT-systemer, men en høy intensitet synkrotron x-ray kilde resultater i høyere romlig oppløsning og redusert image oppkjøpet tid. Her viser vi i detalj hvordan synkrotron-baserte HRCT (utført ved Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) i kombinasjon med Avizo programvare (VSG Inc., Burlington, MA, USA) blir brukt til å utforske plante Xylem i excised vev og levende planter. Denne nye imaging verktøy lar brukerne til å gå utover tradisjonelle statiske, 2D lys eller elektron mikrografer og studere prøver å bruke virtuelle serielle seksjoner i alle plan. Et uendelig antall skiver i alle retninger cen skje på samme prøve, en funksjon som er fysisk umulig å bruke tradisjonelle mikroskopi metoder.

Resultatene viser at HRCT kan brukes til både urteaktige og treaktige planter, og en rekke plante organer (dvs. blader, petioles, stengler, kofferter, røtter). Tallene som presenteres her bidra til å vise både en rekke representative anlegg vaskulær anatomi og den typen detaljer hentet fra HRCT datasett, inkludert skanner for kysten redwood (Sequoia sempervirens), valnøtt (Juglans spp..), Eik (Quercus spp.)., Og lønn ( Acer spp.). tre saplings til solsikker (Helianthus annuus), vinranker (Vitis spp..) og bregner (Pteridium aquilinum og Woodwardia fimbriata). Skåret og tørket prøver fra woody arter er lettest å skanne og gir vanligvis de beste bildene. Imidlertid har de siste forbedringer (dvs. raskere skanner og prøve stabilisering) gjort det possusynlige å bruke denne visualiseringen teknikken på grønne vev (f.eks petioles) og i levende planter. I anledning krympe litt til hydrert grønn plante vev vil føre til at bilder til uskarphet og metoder for å unngå disse problemene beskrives. Disse siste fremskritt med HRCT gir lovende ny innsikt i anlegget vaskulær funksjon.

Introduction

Vannet transporteres fra planterøttene til bladene i en vaskulær vev kalt Xylem - et nettverk av sammenhengende rør, fiber og levende, metabolsk aktive celler. Transport funksjon av anlegget Xylem må opprettholdes for å levere næringsstoffer og vann til bladene for fotosyntese, vekst, og til slutt overlevelse. Vanntransport i Xylem rør kan bli forstyrret når Xylem nettverket kompromittert av patogene organismer. Som svar på slike infeksjoner planter ofte produsere gels, tannkjøtt, og tyloses som et middel for å isolere patogen spredning (f.eks McElrone et al 2008; 2010). Tørkestress kan også begrense vanntransport i Xylem. Som plantene mister vann under langvarig tørke, bygger spenningen i Xylem saft. Vann under spenning er metastabil (dvs. ved en viss terskel spenningen blir stor nok til å kavitere vannsøyler inneholdt i Xylem rør). Etter kavitasjon oppstår, kan en gassboble (emboli) dannes og fylle condUiT, effektivt blokkerer vann bevegelse (Tyree og Sperry 1989), et fenomen analogt til dykkersyke (dvs. "svingene") i dypvannsdykkere.

Til tross for viktigheten av Xylem vann transport for optimal plante funksjon som demonstrert av en omfattende samling av historiske og moderne litteratur om dette emnet (Tyree & Zimmermann, 2002;. Holbrook et al, 2005), er det fortsatt deler av Xylem nettverk som forblir unnvikende . Flere forskningsmiljøer har nylig begynt å bruke høy oppløsning x-ray computertomografi mikro-tomografi (HRCT) til å vurdere finere detaljer av tre anatomi og vaskulær vev (f.eks Mayo et al; 2010, 2008, Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. 2011, 2012a, b, Maeda og Miyake, 2009; Steppe et al 2004).. HRCT er en destruktiv teknikk som brukes til å visualisere funksjoner i det indre av faste gjenstander og til å få digital informasjon på sine 3-D strukturelle egenskaper. HRCTskiller seg fra konvensjonell medisinsk CAT-scanning i sin evne til å løse detaljer så små som en mikron i størrelse, selv for høy tetthet objekter. Nylige fremskritt innen synkrotron HRCT teknologi har bedret bildeoppløsning og signal til støy-forhold tilstrekkelig slik at anlegget fartøy nettverk og intervessel tilkoblinger kan bli visualisert, tildelt 3D koordinater, og eksportert for hydrauliske modellsimuleringer. Brodersen et al. (2011) har nylig fremmet denne teknikken ved å kombinere 3D rekonstruksjoner generert av synkrotron HRCT med en Fortran modell som automatisk trekker ut data fra Xylem nettverk på mye høyere oppløsning enn noensinne var mulig med tradisjonelle anatomiske metoder (dvs. seriell seksjonering med en mikrotom og fotografering med lysmikroskopi, f.eks Zimmermann 1971). Dette arbeidet har også blitt brukt til å optimalisere hydrauliske modeller av Xylem system og identifisert unike egenskapene transport (dvs. motsatt retning i noen vessels i perioder med topp transpirasjon) (Lee et al., i gjennomgang).

Synkrotron HRCT kan nå brukes til å visualisere Xylem funksjonalitet, mottakelighet for kavitasjon, og en plantenes evne til å reparere embolized rør. Unnlatelse av å re-etablere flyt i embolized rør reduserer hydraulisk kapasitet, grenser fotosyntesen, og resulterer i plante død i ekstreme tilfeller (McDowell et al. 2008). Planter kan takle emboli ved å avlede vann rundt blokkeringer via groper forbinder tilstøtende funksjonelle kanaler, og ved å dyrke nye Xylem å erstatte tapt hydraulisk kapasitet. Noen planter har evnen til å reparere brudd i vannmassene, men detaljene i denne prosessen i Xylem under spenning har vært uklart i flere tiår. Brodersen et al. (2010) har nylig visualiseres og kvantifisert påfylling prosessen i live grapevines bruker HRCT. Vellykket fartøy påfylling var avhengig av vann tilstrømningen fra levende celler rundt Xylem rør, der enkelte vanndråper utvidet over tid, fylt fartøyer, og tvunget oppløsningen av innesluttet gass. Kapasiteten på ulike planter for å reparere kompromitterte Xylem fartøy og mekanismene som styrer disse reparasjonene blir nå etterforsket.

Beskrivelse av ALS anlegget Beamline 8.3.2

Vårt arbeid hittil har vært gjennomført på Hard X-ray Micro-tomografi Beamline 8.3.2 på Advanced Light Source i Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA). Plant Prøvene plasseres i en bly-lined hutch ligger 20 meter fra x-ray kilde, generert av en 6 Tesla superledende bend magnet dipol innenfor Advanced Light Source elektron lagring ring som drives ved en kritisk energi på 11,5 KeV. En skjematisk av endestasjonen er vist i figur 1. The X-stråler inn i bur med en bjelke størrelse på 40x ~ 4,6 mm og passerer gjennom prøven som er montert på en motorisert roterende scene. Denoverførte røntgen impinge på en krystall scintillator (to materialer som vanligvis brukes er Luag eller CdWO ₄₎ som konverterer røntgenbilder til synlig lys som er videresendt via linser bort på en CCD for bildesamling. Kameraet, scintillator og optikk er med i en lys tett boks som er på skinner som gjør at prøven til scintillator avstand til å være optimalisert for fase kontrast bildebehandling.

Alle prøver er montert på 10 cm i diameter roterende stadium som i sin tur er montert på horisontale og vertikale oversettelse stadier for prøven posisjonering. En levende plante prøven, med rot-systemet montert i en tilpasset bygget plante gryteklut og løvverk inneholdt i en akryl tube, kan sees i Figur 2. Typiske eksponeringstider kan variere 0,1 til 1 sek ved hjelp 10-18 KeV og skanner varighet vil variere 5-40 min avhengig av innstillingene optimalisert for en enkelt prøve. For høye prøver (typisk for plante Xylem nettverk), kan data skanninger væreflislagt ved å gjenta målingen med prøven ved forskjellige høyder, som styres automatisk, slik at sømløse serielle seksjoner langs en maksimal prøve høyde ~ 10 cm. Maksimal prøve bredde når bildebehandling på 4,5 mikrometer oppløsning er ~ 1 cm for prøver som er nesten perfekt i vertikal retning. Data generasjon og behandling er fullført ved å bruke protokollen listet nedenfor. På grunn av forskjellen i x-ray dempningen mellom luft og vann, kan utmerket bildekontrasten oppnås i planter uten bruk av kontrastmidler løsninger som er typiske for medisinske CT-systemer. De luftfylte årehulrommet er lett skjelnes fra det omgivende vann-fylt vev i hydratiserte planter.

Protocol

Protokoll detaljer beskrevet nedenfor ble skrevet spesielt for arbeid på Advanced Light Source 8.3.2 beamline. Tilpasninger kan være nødvendig for arbeid på andre synkrotron anlegg. Forsvarlig sikkerhet og stråling opplæring er nødvendig for bruk av disse fasilitetene.

1. Prøveopparbeidelse for levende planter

1. Dyrke planter i ~ 10 cm diameter potter, og sørge for at de viktigste stammen (eller en del av anlegget som skal skannes) er som sentrert som mulig og vertikalt i potten. De fysiske målene på HRCT instrument bur på Advanced Light Source grenser leve planter til ~ 1 meter i høyde. Som en konsekvens, er avbildning av levende planter best utført på frøplanter / ungtrær dyrket i små potter. Avhengig eksperimentet kan forskjellige jordtyper brukes til å kontrollere jordfuktighet (f.eks i tørke eksperimenter), og for enkelte planter med fleksible skyter (f.eks vinstokker) lengre skuddene kan være forsiktig tucked inn akryl røret beskrevet nedenfor (se figur 1 og 2).
2. Monter levende potteplanter i en skreddersydd stiv aluminium gryteklut. Topplaten kan justeres i høyden å imøtekomme en rekke av potten høyder. Toppen av platen er utformet for å justere med toppen av jordoverflaten, og anlegget stikker ut fra midten av den todelte plate. Formålet med gryteklut er å sikre anlegget stammen holdes fast på plass for å redusere vibrasjoner eller prøven bevegelse. Minimere prøve bevegelse under en skanning er viktig.
3. Når montert i holderen, måle stammen vannpotensial eller blad transpirasjon ved hjelp av en Scholander stil trykkammer eller et klipp-on blad porometer, henholdsvis for å bestemme den fysiologiske status av anlegget før skanning.
4. Plasser en tynnvegget akryl sylinder over anlegget og på toppen av aluminiumverket holderen og sikres på plass med leire kitte å stabilisereprøve (figur 2). Hvilkensomhelst vibrasjon eller bevegelse av øvre løvverk vil bli overført ned stammen og forårsake plantevev innenfor skannede området til å flytte, og leder til bildeforvrengning. Sylinderen brukes til å inneholde plante trær og hindre plante blader fra å gni mot andre deler av utstyret i bur som ville resultere i vibrasjoner under en skanning. Ytterligere plastfolie, papirhåndklær, og båndet skal brukes til ytterligere å redusere vibrasjon og bevegelse av plantedeler (se problemer forbundet med prøven bevegelse i Figur 4). Å redusere sin x-ray absorpsjon (som kan redusere bildekvaliteten på et gitt eksponeringstid), bør inneholder sylinder har så tynne vegger som mulig og samtidig opprettholde tilstrekkelig stivhet til å utføre sin funksjon.
5. Fest den egendefinerte gryteklut til luft peiling scenen og låse den (skrue) på plass mellom x-ray kilde og bildesensoren og kamera utstyr. Posipå stammen så vertikal som mulig og senter på magnetisk chuck underlaget for å sikre at prøven forblir i synsfeltet under rotasjon.

2. Prøveopparbeidelse for Fresh, excised Plant Tissue

1. Frisk plantemateriale, typisk stengler eller petioles, kan skannes etter umiddelbar fjerning fra en levende plante. Hvis hensikten med forsøket er å visualisere helheten av Xylem nettverk, vann innen fartøyene må evakueres og erstattet med luft. For å gjøre dette, montere prøven i Scholander stil trykkammeret og presse trykkluft eller nitrogen gjennom prøven ved lavt trykk (<0,05 MPa) i ca 5 min. Arter vil variere i tid som er nødvendig å evakuere fartøyet nettverket. Hvis hensikten er å evaluere graden av emboli formasjonen i frisk plantevev, deretter avgiftsetaten prøver fra anlegget ved hjelp av en frisk barberblad og foreta kutt under vann.
2. Pakk prøven i et lag av Parafilm til prhendelse uttørking under skanningen.
3. Montere prøven i en drill-chuck festet til en metallplate som er skrudd inn i luftlager scenen. Center og orientere prøven vertikalt som beskrevet ovenfor for å sikre at prøven forblir i synsfeltet.

3. Prøveopparbeidelse for Tørket Woody vev

1. For optimal vevsprøve visualisering og bildekontrasten, er det nødvendig å sakte dehydratisere hele woody vevsprøve. Skjær prøver til ca 6 cm i lengde. Velg prøvene som er så rett som mulig i målrettet skanningen regionen og har en diameter på 1 cm ≤.
2. Plasser woody vevsprøve inn en tørkeovn ved lav temperatur til langsomt tørke prøven uten å forårsake noen sprekkdannelse eller splitting av vevet. Denne prosessen vil trolig variere mellom arter og vev. For treaktige stammer, er 12 timers i en 40 ° C ovnen typisk tilstrekkelig til å gi god kontrast uten å forårsake betydelige changes i den fysiske strukturen av stammen (se problemer med hurtig tørking demonstrert i Figur 3).
3. I noen situasjoner er det ønskelig å ha en fiduciary markør innenfor prøven slik at en etterfølgende disseksjon og visualisering med scanning elektronmikroskopi kan rettes til bestemte punkter i HRCT bildet. For å gjøre dette, påføre et metall eller glassperle eller wire til utsiden av stammen med Parafilm. En annen metode er å bruke en silikonharpiks (f.eks RTV-141, Bluestar Silikoner, East Brunswick, NJ) som kan injiseres inn i en enkelt Xylem ledning (se eksempler i Brodersen mfl. 2010). Herdet er silikonharpiks tydelig i prøven og lett skilles fra de andre luftfylte fartøy. Bruk denne markøren å nettopp finne spesifikke regioner av prøven.
4. Montere prøven i borechuck og sentrum som beskrevet ovenfor.

4. Prøveopparbeidelse for Leaf Tissue for todimensjonale (2D) Radiograms

1. Å visualisere fartøy innholdet i bladene i nær sanntid, kan bladene bli skannet for å produsere en 2D radiogram, ligner på en dental x-ray. Monter bladet mellom to ark av tynn akryl plast, og sikre kantene med klipp. Fest deretter montert prøven til et post-holder systemet og posisjon den optiske breadboard ved siden av imaging system og x-ray kilde.

5. Skanning prøven i 8.3.2 Hutch

1. Bestem forstørrelse som vil fungere best for ditt bruksområde. ALS Beamline 8.3.2 har evnen til å skanne med objektiver med forstørrelse av 2x, 5x og 10x. Disse resultat i bildepiksel størrelser på 4,5, 2,25, og 0,9 mikrometer, henholdsvis. Avhengig forstørrelsen, må prøven være av passende størrelse, som synsfeltet avtar med økende forstørrelse. Se detaljer for valg av kamera og objektiv og de ​​resulterende bildeparametere i tabell 1.

	PCO.4000 (4008x2672)		PCO.Edge (2560x2160) (Optique Peter)
Lens	pixel (mikrometer)	synsfelt (mm)	pixel (mikrometer)	synsfelt (mm)
10x	0.9	3.6	0.65 (0.69)	1.7 (1.7)
5x (4x)	1.8	7.2	1.3 (1.72)	3.3 (4.4)
2x	4.5	18	3.25 (3.44)	8.3 (8.8)
1x	9	36	6,5 (-)	16,6 (-)

Tabell 1. Detaljer om tilgjengeligekameraer og objektiver på ALS 8.3.2.

2. Still x-ray energi til 15 keV. Dette har vist seg å gi utmerket bildekontrasten for de fleste plante programmer (se Brodersen mfl.. 2010, 2011, 2012a, b). Eksponeringstiden er generelt avhengig av tykkelsen og tettheten av prøven (og dermed forstørrelsen brukes) varierer mellom 100 og 1000 msek. Lengre eksponeringstider (så lenge detektor piksler ikke er mettet) vil generelt føre til høyere signal til støyforhold, men på bekostning av økte skannetidene.
3. Velg en kantete inkrement som passer for din søknad. Prøver er rotert 180 ° i løpet av en skanning, og antall bilder som er tatt i løpet av rotasjonen kan ha en betydelig innvirkning på størrelsen av datasettet, lengden av skanningen intervallet, og endelige bildekvaliteten, men det er generelt avtagende avkastning i kvalitet. Typiske skanninger utføres på 0,25 ° trinn, noe som gir 721 bilder per scan. Redusere de Utgiftert til 0.125 ° resulterer i bedre bilder for å visualisere fine detaljer, men gir 1440 bilder og dermed en mye større datasett (for en typisk område av interesse, betyr ~ 10-30 GB med data mot 5 GB). Imidlertid er signalet til støyforhold ofte forbedret og verdt både økt skannetiden og datastørrelsen. Tørre stilker som er usannsynlig å deformere / krympe under et søk kan bli utsatt for lengre intervaller (mindre kantete økning) uten skade. Når bildebehandling levende planter, der biologiske prosesser (f.eks emboli reparasjon) finner sted på korte tidsskalaer, velger de kortere skanning intervallene er å foretrekke for å begrense potensielle skadevirkninger av x-ray stråling på dette vevet-selv om dette kommer på et potensielt tap av bildekvalitet. Kortere skanning intervaller kan oppnås ved hjelp av kontinuerlig Tomography innstillingen under som utvalget kontinuerlig roterer mens bildene blir tatt.
4. For hver skanning, må "lyse feltet" og "mørke feltet" bilder være corrected.. Lyse feltet bilder er bilder uten prøven i strålen. Disse er ofte samlet før og etter avsøkning av prøven ved horisontalt oversette prøven. Mørke felt er samlet ved å lukke x-ray shutter-dette målte mengden signal kameraet viser uten x-stråler.

6. Data Processing

1. Overfør "rå" 2D. TIF-bilder, som ble eksportert fra oppkjøpet datamaskinen til en filserver, til en databehandling datamaskin. Hvis datamaskinen har tilstrekkelig RAM, kan data bli kopiert til en såkalt "RAM Drive" (en del av RAM vises som en harddisk på datamaskinen). På denne måten programvaren ikke har tilgang til en spinnende harddisk, som er relativt treg sammenlignet med en solid state drive eller flash-minne. Dette trinnet reduserer tiden det tar å behandle datasett.
2. Bildene må konverteres til en prosent overføring skala. Beamline 8.3.2 har en tilpasset background normalisering plug-in som kan lastes ned og brukes med fritt tilgjengelig programvare pakker ImageJ eller Fiji ( http://fiji.sc/ ). Det trekker de mørke teller fra bildene og normaliserer illustrasjonsbilder av de lyse feltene for å gi bilder som viser prosent overføring. Laste normaliserte bilder inn i Octopus programvarepakken ( http://www.inct.be/en/software/octopus ) og "rekonstruere" 3D datasett fra 2D rå. TIF-filer ved hjelp av utpekte prosesstrinn (Normaliser bilder, Ring fjerning , Sinogram skapelse, Parallel stråle rekonstruksjon). Denne prosessen gir deretter en rekke. TIF tverrskips (tverrsnittsareal) bilder sammensatt av "voksler" (volumetriske pixel elementer), hver med en x, y, z-koordinat og intensitet verdier som representerer x-ray lineær absorpsjonskoeffisient.

7. Visualisering

1. Visualize bunken av bilder i en av en rekke programvarepakker. Freeware (f.eks Drishti, http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml ) kan brukes til å visualisere volumer eller individuelle eller stabler av bilder (f.eks ImageJ eller Fiji). Andre programvarepakker kan brukes for 3D visualisering. Vår forskningsgruppe bruker Avizo programvarepakken ( http://www.vsg3d.com/avizo/overview ), men andre som Amira ( http://www.amira.com/ ) og VGStudioMax ( http://www. volumegraphics.com / ) er også ofte brukt.
2. Laste datasett inn i systemminnet og vise prøven i virtuelle tverrstilt, langsgående, eller radial slice orientering. På grunn av 3D attributter av datasettet, virtuelle skiver gjennom sample kan roteres i alle plan å samordne med regioner av interesse, en betydelig forbedring over tradisjonelle serielle lysmikroskopi (se filmer 1-3 for detaljerte eksempler).
3. Å visualisere prøven som trengs i 3D, "segment" prøven med forskjellige semi-automatiske og manuelle rutiner i Avizo å skille fartøy lumen eller andre konstruksjoner fra omkringliggende vev. Segmentering refererer til definere grenser mellom objekter av interesse, og dermed separere eller segmentere dem i egne regioner. Rendering volumer i 3D er utført av visualisering programvare. En metode for å gjøre dette på er direkte volumgjengivelse, hvor hvert punkt i et volum antas å sende ut og absorbere lys, mengden og fargen av utslipp og absorpsjon kan defineres ved hjelp av en "fargekart", og den resulterende projeksjon i en gitt retning er vises på skjermen. Alternativt blir en trådramme eller 3D mesh overflate representerer segmenterte grenser konstruert for å vise en 3D-modell av than struktur av interesse. Den 3D mesh er sammensatt av polygonale elementer, og det totale antallet elementer vil påvirke både fidelity av struktur reproduksjon og størrelsen på den tilhørende datafilen (dvs. flere elementer fører til høyere kvalitet, men større filstørrelse). En rekke bildebehandlingsprogrammer moduler er tilgjengelige innenfor visualisering programvare for å styre volumet rendering utganger, samt kontroll for bildets lysstyrke, kontrast, åpenhet, støyreduksjon, etc.

8. Kvantifisering

1. Når segmentering er gjort, er det mulig å kvantifisere målet plante strukturer eller funksjonelle endringer i volum, lengde, bredde, tilstedeværelse eller fravær av vann, luft, etc. For eksempel, Brodersen mfl.. (2010) som brukes Avizo programvare å kvantifisere volumet endring av vanndråper inne grapevine påfylling fartøy. Planter ble skannet hvert 30 min over fire til åtte timer å lage en gang-laPSE sekvens av fartøy påfylling. Hver scan ble rekonstruert og lastet inn Avizo, der den enkelte dråper ble målt over tid som deres økte.

Representative Results

Synchotron HRCT skanninger har blitt implementert på et bredt utvalg av plantemateriale og arter som bruker beamline 8.3.2 (figur 5), og har gitt ny innsikt i struktur og funksjon av anlegget Xylem på enestående oppløsning i 3D. Visualisering og leting evner tilbys av 3D rekonstruksjoner (som illustrert i fig 6-8; og filmer 1-3) muliggjør presis bestemmelse av plasseringen og orienteringen av strukturer med Xylem nettverkene på begge utskårende prøver og i levende planter.

I noen situasjoner har utvalget bevegelse eller utilsiktede vibrasjoner forårsaket skjevheter i de siste bildene, rendering skanner ubrukelige (f.eks figur 4), men forbedringene for å redusere søketiden (med kontinuerlig tomografi) har minimert de skadelige effektene av slike data tap fordi mange flere skanninger kan nå være ferdig i begrenset beamtimeallokert til hver bruker. Disse kortere skannetidene også aktivere gjentatte målinger av en enkelt replikat over tid for å fange dynamikken i prosesser som emboli spredning og reparasjon.

Figur 1. Skjematisk av prøven skanning prosedyre og oppsett inne bur ved ALS beamline 8.3.2 Øvre venstre:. Røntgenbilde kilde stråle (1) blir projisert gjennom prøven (2) som er festet til luft bordet med en chuck som roterer under skanning. Den x-stråler som passerer gjennom prøven impinge på en krystall scintillator (4) som fluorescerer synlig lys som er omdirigert av et speil (5) gjennom linser (6) til et CCD-kamera (7) som fanger et digitalt bilde. "Rå" 2D røntgenbilder (øverst til høyre bilde-eksempel er en plante stilk prøve roteres 180 ° i løpet av en full scan på en økning på 0,25 ° resulterer i 720 2D-bilder) er transformert og resultere i en bunke med tverrgående bilder (nederst til høyre) som brukes for 3D rekonstruksjoner. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Bilde tatt inne i bur for ALS beamline 8.3.2 viser en live, rote grapevine forberedt for skanning. Vintreet finnes i en akryl tube (1). Den røntgenstråle entrer hutch til venstre (2), passerer så gjennom prøven (f.eks grapevine stammen) (3) og deretter går inn i en lys tett boks inneholdende kameraet, scintillator og optikk (boksen ikke vist i dette bildet ).

"Fo: src =" / files/ftp_upload/50162/50162fig3highres.jpg "fo: content-width =" 4in "/>
Figur 3. Eksempel på prøven cracking (markert med hvite piler) når en treaktig rot (sett her) ble utsatt for tørking for lenge, og / eller ved for høy temperatur. For å unngå denne skaden, og for å opprettholde strukturelle integritet og trofasthet til vev struktur i vivo dehydrering krever noen tester på forhånd. Målestokk = 1 mm.

Figur 4. Bilde forvrengninger, sett her for mange små treaktige røtter, resultat fra bevegelse av prøven under skanningen perioden. I dette eksempelet en kolonne av små woody røtter (de lyse hvit flekk er en enkelt root) fortsatt festet til en levende plante ble skannet og tydeligvis flyttet under skanningen og resultateted i forvrengt bilde. å overvinne denne utgaven prøver må være sikkert stabilisert med ekstra polstring inni akryl røret omgir anlegget.

Figur 5. Eksempler på tverrgående bilder av woody stammer skannet for (A) Coastal Redwood og (B) Valley Oak. Hvite skala barer er 1,0 mm i begge bildene. Klikk her for å se større figur .

Figur 6. 3D rekonstruksjon av en stamme som genereres fra en HRCT skanning av en levende kyst redwood sapling vist med en langsgående og transverse flyet eksponert. Mesteparten av Xylem sett i dette bildet er vann-fylt, mens det er luftfylte rør i sentrum av stammen (sort pil) som resulterte fra kavitasjon under en tørke eksperiment. Denne skanningen også tatt rør i lov av kaviterende-se de mellomliggende gråtoner rør danner en ring rundt halvveis mellom sentrum og stammen utvendig (hvit pil).

Figur 7. Bilde fra Brodersen m.fl. 2012 -. Plant, Cell og miljø demonstrere 3D rekonstruksjon av Xylem vaskulær arrangement i to fern arter skannet på to forskjellige punkter på frond Vaskulær bunter er synlige i blått, mens det omkringliggende vevet er i grønt. I Pteridium aquilinum, vaskulær bunDLEer er optimalisert for høy ledningsevne med mange forbindelser i både frond spissen (A) og basen (c). I kontrast har Woodwardia fimbriata en mye mer konservativ vaskulær ordning med få forbindelser mellom buntene i frond spissen (b) og basen (d). De resulterende vaskulære ordninger føre til høye fotosyntetiske priser i P. aquilinum men på bekostning av lav toleranse for tørke, mens W. fimbriata er optimalisert for frond levetid med lavere fotosyntetiske priser, men høyere tørke toleranse. Frond spissen og uedle seksjoner er omtrent 4 mm og 9 mm i diameter, henholdsvis.

Figur 8. 3D rekonstruksjon generert fra en HRCT scan av valnøtt stammen Xylem. Dette bildet bidrar til å demonstrere evnen til å utforske vev i utrolig oppløsning som disse er to tilstøtende Xylem rør som deler en sammenhengende vegg for mye av sin lengde. Her har bildebehandling og glatting fjernet den tynne delte åreveggen i volumgjengivelse. Nøyaktig plassering og tykkelsen av denne åreveggen beholdes i de rå bildedata og kan brukes til å studere tilkobling. Hver av de tilkoblede skip i bildet har ~ 40 mikrometer diameter.

Movie 1. Klikk her for å se filmen .

Movie 2. Klikk her for å se filmen .

Movie 3.x/asset/supinfo/PCE_2524_sm_MovieS2.mov? v = 1 & s = 0f7e030bb72d2057d5a891215e375093e27e1102 "target =" _blank "> Klikk her for å se filmen.

Discussion

Synchotron HRCT gir plante biologer med en kraftig, ikke-destruktiv verktøy for å utforske den interne driften av anlegget blodkar i utrolige detaljer. Denne teknologien har vært brukt nylig for å identifisere tidligere ubeskrevet anatomiske strukturer i grapevine Xylem som differensielt endre Xylem nettverkstilkobling i ulike grapevine arter (Brodersen m.fl. 2012b, in press.) - Denne tilkoblingen kan drastisk forandre evne vaskulære patogener og emboli å spre destruktivt hele Xylem nettverk. De første vellykkede skanninger av levende planter har også avdekket finskalaen detalj av dynamiske prosesser som emboli spredning og reparasjon (Brodersen m.fl. 2010; McElrone et al 2012 Phytologist 196 (3) :661-665), og bidro til å implisere rolle en bestemt levende celler i reparasjon emboli-romlig oppløsning levert av HRCT ved ALS 8.3.2 gjorde dette mulig. Nærmere om disse prosessene og andre AspeCTS av Xylem nettverk fortsatt unnvikende-HRCT vil trolig spille en sentral rolle i videre funn spesielt når parret med andre høyoppløselige teknikker (f.eks Laser Capture mikrodisseksjon), og kan være forbundet med andre nyutviklede avanserte visualiseringsteknikker for bruk i plantebiologi ( f.eks Lee et al, 2006; Truernit et al, 2008; Jahnke et al 2009;. Iyer-Pascuzzi et al 2010).

Materials

See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2