Met behulp van hoge resolutie Computed Tomography om de driedimensionale structuur en functie van Plant vaatstelsel Visualiseer

Summary

Hoge resolutie x-ray tomografie (HRCT) is een niet-destructieve diagnostische beeldvormingstechniek die kan worden gebruikt om de structuur en functie van planten vasculatuur in 3D onderzoeken. We laten zien hoe HRCT vergemakkelijkt verkenning van xyleem netwerken over een breed scala van planten weefsels en soorten.

Abstract

Hoge resolutie x-ray tomografie (HRCT) is een niet-destructieve diagnostische beeldtechniek met sub-micron resolutie capaciteit die nu wordt gebruikt om de structuur en functie van planten xyleem netwerk evalueren in drie dimensies (3D) (bv. Brodersen et al. . 2010; 2011; 2012a, b). HRCT beeldvorming is gebaseerd op dezelfde principes als medische CT systemen, maar een hoge intensiteit synchrotron x-ray source resulteert in hogere ruimtelijke resolutie en verlaagde beeldacquisitie tijd. Hier tonen we in detail hoe synchrotron gebaseerde HRCT (uitgevoerd bij de Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combinatie met Avizo software (VSG Inc, Burlington, MA, USA) wordt gebruikt om planten xyleem verkennen weggesneden weefsel en levende planten. Deze nieuwe imaging tool stelt gebruikers in staat verder te gaan dan de traditionele statische, 2D licht of electronenmicroscoop en studie monsters met behulp van virtuele seriële secties in elk vlak. Een oneindig aantal segmenten in elke oriëntatie ceen worden gemaakt op hetzelfde monster, een functie die fysiek onmogelijk is met traditionele microscopie methoden.

Resultaten tonen aan dat HRCT kan worden toegepast op zowel kruidachtige en houtachtige plantensoorten, en verschillende plantenorganen (bijvoorbeeld bladeren, bladstelen, stengels, stammen, wortels). Gepresenteerde cijfers hier ertoe bijdragen dat zowel een reeks representatieve planten vasculaire anatomie en het type van detail uit HRCT datasets, zoals scans voor kust redwood (Sequoia sempervirens), walnoot (Juglans spp.), Eik (Quercus spp.), En esdoorn ( Acer spp.) plantgoed aan zonnebloemen (Helianthus annuus), wijnstokken (Vitis spp.), en varens (Pteridium aquilinum en Woodwardia fimbriata). Uitgesneden en gedroogde monsters van houtige soorten zijn het gemakkelijkst te scannen en levert doorgaans de beste foto's. Echter, recente verbeteringen (dwz snellere scans en monster stabilisatie) maakte het Possbaar om deze visualisatie techniek te gebruiken op groen weefsels (bijv. bladstelen) en in levende planten. Bij gelegenheid enige krimp van gehydrateerde groene plant weefsels zal veroorzaken afbeeldingen om onscherpte en methoden om te voorkomen dat deze problemen worden beschreven. Deze recente ontwikkelingen met HRCT bieden veelbelovende nieuwe inzichten in fabriek vasculaire functie.

Introduction

Water wordt vervoerd van plantenwortels op de bladeren in een vasculair weefsel genaamd xyleem - een netwerk van onderling verbonden leidingen, vezels, en wonen, metabolisch actieve cellen. Transportfunctie van plantaardige xyleem moeten worden gehandhaafd om voedingsstoffen en water te leveren aan de bladeren voor fotosynthese, groei, en uiteindelijk overleven. Vervoer over water in xyleem leidingen kan worden verstoord wanneer de xyleem-netwerk in het gedrang komt door pathogene organismen. In reactie op dergelijke infecties installaties vaak gels, gommen en thyllen als middel om pathogeen spread isolaat (bv. McElrone et al. 2008; 2010). Droogte stress kan het vervoer over water ook beperken in xyleem. Zoals planten verliezen water tijdens langdurige droogte, spanning bouwt in het xyleem sap. Water onder spanning is metastabiel (dat wil zeggen op een bepaalde drempel van de spanning groot genoeg wordt om water kolommen in xyleem leidingen caviteren). Na cavitatie optreedt, kan een gasbel (embolie) vormen en vul de condvisitors, het effectief blokkeren van beweging van het water (Tyree en Sperry 1989), een fenomeen dat analoog aan decompressieziekte (dwz "de bochten") in diepzee duikers.

Ondanks het belang van xyleem vervoer over water voor een optimale planten functie, zoals aangetoond door een grote hoeveelheid historische en hedendaagse literatuur over dit onderwerp (Tyree & Zimmermann, 2002;. Holbrook et al., 2005), zijn er nog aspecten van xyleem netwerken die blijven ongrijpbaar . Verschillende onderzoeksgroepen hebben onlangs begonnen gebruik te maken van hoge resolutie X-stralen computertomografie micro-tomografie (HRCT) om fijnere details van hout anatomie en vasculair weefsel (bijv. Mayo et al. evalueren; 2010, 2008; Mannes et al. 2010;. Brodersen et al. 2010. , 2011, 2012a, b; Maeda en Miyake, 2009; Steppe et al. 2004).. HRCT een destructieve techniek om functies in het inwendige van vaste objecten visualiseren en digitale informatie op de 3-D structuur te verkrijgen. HRCTverschilt van conventionele medische-CAT scanning in zijn vermogen om gegevens zo klein als een micron groot lossen, zelfs voor hoge dichtheid voorwerpen. Recente ontwikkelingen in de synchrotron HRCT technologie is verbeterd beeldresolutie en signaal-ruisverhouding voldoende, zodat planten schipverkeer en intervessel verbindingen kunnen worden gevisualiseerd, toegewezen 3D-coördinaten, en geëxporteerd voor hydraulische simulaties. Brodersen et al.. (2011) onlangs naar voren van deze techniek door de combinatie van 3D-reconstructies gegenereerd door synchrotron HRCT met een Fortran model dat automatisch de gegevens van het xyleem-netwerk haalt bij veel hogere resolutie dan ooit mogelijk was met traditionele anatomische methoden (dwz seriële snijden met een microtoom en het vastleggen van beelden met licht microscopie, bijvoorbeeld Zimmermann 1971). Dit werk is ook gebruikt om hydraulische modellen optimaliseren van het xyleem systeem en geïdentificeerd unieke kenmerken van transport (bijv. tegenstroom in sommige vessel tijdens periodes van piek transpiratie) (Lee et al.., in review).

Synchrotron HRCT kan nu gebruikt worden om xyleem functionaliteit gevoeligheid voor cavitatie en planten vermogen geëmboliseerd leidingen repareren visualiseren. Niet herstellen stroming in geëmboliseerd leidingen vermindert hydraulisch vermogen, grenzen fotosynthese, en resulteert in planten dood in extreme gevallen (McDowell et al.. 2008). Planten kunnen omgaan met embolieën door het omleiden van water rond blokkades via putten aansluiten van aangrenzende functionele leidingen, en door de groeiende nieuwe xyleem om verloren hydraulische capaciteit te vervangen. Sommige planten hebben de mogelijkheid om pauzes in het water kolommen te herstellen, maar de details van dit proces in xyleem onder spanning zijn bleef onduidelijk voor decennia. Brodersen et al.. (2010) onlangs gevisualiseerd en gekwantificeerd het vullen in levende wijnstokken met HRCT. Succesvolle schip bijvullen was afhankelijk van het water instroom van levende cellen rondom de XYLem leidingen, waar individuele waterdruppels uitgebreid na verloop van tijd, vol schepen, en gedwongen de ontbinding van ingesloten gas. De capaciteit van de verschillende planten om gecompromitteerd houtvaten en de mechanismen die deze reparaties te herstellen worden momenteel onderzocht.

Beschrijving van de ALS-faciliteit Beamline 8.3.2

Ons werk tot nu toe is verricht op de harde X-stralen micro-tomografie Beamline 8.3.2 op de Advanced Light Source in Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA). Plant monsters worden in een met lood beklede hok op 20 meter van de röntgenbron, gegenereerd door een 6 Tesla supergeleidende magneet bocht dipool in de Advanced Light Source elektron opslag ring werkend bij een kritische energie van 11,5 KeV. Een schema van het eindstation wordt getoond in Figuur 1. De x-stralen Voer het hok met een bundelgrootte van 40x ~ 4,6 mm en door het monster dat is gemonteerd op een gemotoriseerde roterende podium. Deovergebrachte x-stralen van invloed zijn op een kristal scintillator (twee materialen vaak gebruikt zijn LuAG of CdWO ₄₎ die x-stralen om te zetten in zichtbaar licht dat wordt doorgegeven via lenzen op een CCD voor beeld collectie. De camera, scintillator en optica in een lichtdichte doos die op rails waarmee de gemengd met scintillator afstand worden geoptimaliseerd voor fase contrast beeldvorming.

Alle monsters worden aangebracht op de 10 cm diameter roterende fase die op zijn beurt gemonteerd op horizontale en verticale vertaling fasen voor monster positionering. Een levend plantenmonster, met het wortelstelsel gemonteerd in een op maat gemaakte houder plantpot en het blad in een acryl buis te zien in figuur 2. Typische blootstellingstijden kunnen variëren 0,1-1 sec met 10-18 KeV en scan lengtes variëren 5-40 min afhankelijk van de optimale instellingen voor een bepaald monster. Voor grote steekproeven (typisch van plantaardige xyleem netwerken), kunnen de gegevens scans wordenbetegelde door herhaling van de meting met het monster op verschillende hoogten, die automatisch wordt bestuurd, waardoor naadloze seriecoupes langs een maximum monsterhoogte van ~ 10 cm. Maximale sample breedte, in beeldvorming op 4,5 micrometer resolutie is ~ 1 cm voor monsters die bijna perfect in verticale richting. Genereren en verwerking voltooid met de onderstaande protocol. Vanwege het verschil in x-ray demping tussen lucht en water kunnen uitstekende beeldcontrast worden verkregen in planten zonder het gebruik van contrast oplossingen typisch medische CT systemen. De met lucht gevulde vat lumen is gemakkelijk te onderscheiden van het omringende water gevulde weefsel in gehydrateerde planten.

Protocol

Protocol gegevens die hieronder worden beschreven zijn speciaal geschreven voor het werk op de Advanced Light Source 8.3.2 bundellijn. Aanpassingen nodig zijn voor werkzaamheden op andere synchrotron faciliteiten. Een goede veiligheid en stralingsbescherming opleiding is vereist voor gebruik van deze faciliteiten.

1. Monstervoorbereiding voor levende planten

1. Verbouwen in ~ 10 cm diameter potten, en ervoor zorgen dat de stam (of gedeelte van de plant te scannen) en gecentreerd mogelijk verticaal georiënteerd in de pot. De fysieke afmetingen van de HRCT instrument hok op de Advanced Light Source grenzen levende planten naar ~ 1 m hoog. Bijgevolg wordt beeldvorming van levende planten best uitgevoerd zaailingen / saplings gekweekt in kleine potten. Afhankelijk van het experiment, verschillende bodemtypes worden gebruikt om vochtgehalte (bijvoorbeeld droogte in experimenten) besturen en sommige planten met flexibele scheuten (bijv. wijnstokken) meer scheuten kunnen zorgvuldig tucked in de acrylaat buis beschreven (zie figuren 1 en 2).
2. Koppel de live potplanten in een op maat gemaakte stijve aluminium pot houder. De bovenplaat hoogte kan worden aangepast aan verschillende hoogten pot tegemoet. De bovenkant van de plaat is ontworpen uitgelijnd met de bovenkant van het oppervlak en de plant uitsteekt uit het midden van de tweedelige plaat. Het doel van de pot houder is ervoor te zorgen de plant stengel stevig op zijn plaats gehouden aan trillingen of monster beweging te minimaliseren. Het minimaliseren van monster beweging tijdens een scan is van essentieel belang.
3. Eenmaal gemonteerd in de houder, het meten van de stam water potentiële of blad transpiratie met behulp van een Scholander stijl drukkamer of een clip-on leaf porometer, respectievelijk de fysiologische status van de installatie te bepalen voordat u kunt scannen.
4. Plaats een dunwandige acryl cilinder over de plant en op de top van de aluminiumfabriek houder en zet hem op zijn plaats met klei stopverf het stabiliseren van demonster (figuur 2). Elke trilling of beweging van de bovenste bladeren worden verzonden langs de stengel en veroorzaken het plantenweefsel binnen het gescande gebied te bewegen, wat uiteindelijk leidt tot beeldvervorming. De cilinder wordt gebruikt om plantfoliage bevatten en bladeren van de planten te voorkomen wrijven tegen andere onderdelen van de uitrusting in het hok die zou resulteren in trillingen tijdens een scan. Extra plastic, papieren handdoeken, en tape worden gebruikt ter minimalisering trilling en beweging van plantendelen (zie problemen met voorbeeld beweging in figuur 4). Om de x-ray absorptie (die kan de beeldkwaliteit afnemen bij een bepaalde blootstellingstijd) te verminderen, moet de met cilinder hebben dunne wanden mogelijk met behoud van voldoende stijfheid om de functie uit te voeren.
5. Bevestig de aangepaste pot houder om de lucht lager stadium en vergrendel deze (schroef) op zijn plaats tussen de röntgenbron en de beeldsensor en de camera-apparatuur. Positiop de steel zo loodrecht mogelijk en centrum op magnetische klem Base wordt het monster blijft in het gezichtsveld tijdens rotatie.

2. Monstervoorbereiding voor Fresh, weggesneden Plant Tissue

1. Verse plant materiaal, meestal stengels of bladstelen, kan worden gescand nadat onmiddellijke verwijdering van een levende plant. Als het de bedoeling van het experiment is het geheel van het xyleem netwerk water visualiseren in de vaten worden geëvacueerd en vervangen door lucht. Om dit te doen, monteer het monster in een Scholander stijl drukkamer en druk perslucht of stikstof door het monster bij lage druk (<0,05 MPa) gedurende ongeveer 5 minuten. Species verschillen in de tijd die nodig is om het schip netwerk evacueren. Indien de bedoeling is om de omvang van embolie vorming in de verse plantenweefsel vervolgens accijns monsters evalueren van de plant met een verse scheermesje en de delen onder water te maken.
2. Wikkel het monster in een laag van Parafilm om prevenement uitdroging tijdens de scan.
3. Monteer het monster in een drill-boorkop bevestigd aan een metalen plaat die is geschroefd in de lucht lager podium. Center en oriënteren het monster verticaal zoals hierboven beschreven om het monster te verzekeren blijft het gezichtsveld.

3. Monstervoorbereiding voor Gedroogde Woody Tissues

1. Voor optimale weefselmonster visualisatie en beeldcontrast, moet langzaam drogen de gehele woody weefselmonster. Doorsneden ongeveer 6 cm. Monsters kiezen die zo recht mogelijk in de beoogde scangebied en een diameter van ≤ 1 cm.
2. Plaats de houtachtige weefselmonster in een droogoven bij lage temperatuur om het monster langzaam drogen zonder enige scheuren of barsten van het weefsel. Dit proces is waarschijnlijk verschillen tussen soorten en weefsels. Voor houtachtige stengels, 12 uur in een 40 ° C oven is meestal voldoende om een ​​uitstekend contrast te bieden zonder significante change in de fysieke structuur van de steel (zie problemen met snelle droging aangetoond in Figuur 3).
3. In sommige situaties is het wenselijk om een ​​fiduciaire marker in het monster zodanig dat de volgende dissectie en visualisatie met scanning elektronenmicroscopie kunnen worden gericht naar specifieke punten in het HRCT beeld. Hiertoe aanbrengen van een metalen of glazen kraal of draad aan de buitenzijde van de steel met Parafilm. Een andere methode is om een siliconenhars (bijvoorbeeld RTV-141, Bluestar Silicones, East Brunswick, NJ) die kunnen worden geïnjecteerd in een xylem leiding (zie voorbeelden in Brodersen et al. 2010). Eenmaal uitgehard, de siliconenhars duidelijk zichtbaar in het monster en gemakkelijk te onderscheiden van de andere lucht gevulde vaten. Gebruik deze markering om precies te lokaliseren specifieke regio's van het monster.
4. Monteer het monster in de boorkop en midden, zoals hierboven beschreven.

4. Monstervoorbereiding voor Leaf Tissue voor tweedimensionale (2D) radiogrammen

1. Om vatinhoud in bladeren in near-real-time visualiseren, kunnen de bladeren worden gescand naar een 2D-radiogram, vergelijkbaar met een tandheelkundige x-ray te produceren. Monteer het blad tussen twee vellen van dunne acrylaat, en zet de randen met clips. Bevestig vervolgens het gemonteerde monster tot een post-houder systeem en de positie van de optische breadboard naast de imaging-systeem en x-ray bron.

5. Het scannen van de Sample in de 8.3.2 Hutch

1. Bepaal de vergroting die het beste zal werken voor uw toepassing. ALS Beamline 8.3.2 heeft de mogelijkheid om te scannen met lenzen met vergrotingen van 2x, 5x, 10x en. Deze resulteren in beeldpixel afmetingen van 4,5, 2,25 en 0,9 pm, respectievelijk. Afhankelijk van de vergroting, moet het monster van geschikte grootte, zoals het gezichtsveld af met toenemende vergroting. Zie details voor de keuze van camera en de lens en het resulterende beeld parameters in tabel 1.

	PCO.4000 (4008x2672)		PCO.Edge (2560x2160) (Optique Peter)
Lens	pixel (pm)	gezichtsveld (mm)	pixel (pm)	gezichtsveld (mm)
10x	0,9	3,6	0.65 (0.69)	1.7 (1.7)
5x (4x)	1,8	7,2	1.3 (1.72)	3.3 (4.4)
2x	4,5	18	3.25 (3.44)	8.3 (8.8)
1x	9	36	6.5 (-)	16,6 (-)

Tabel 1. Details over beschikbarecamera's en lenzen bij ALS 8.3.2.

2. De x-ray energie 15 keV. Dit blijkt een uitstekende beeldcontrast voor bijna alle plants (zie Brodersen et al.. 2010, 2011, 2012a, b). Belichtingstijden algemeen afhankelijk van de dikte en dichtheid van het monster (en dus de vergroting gebruikt) tussen 100 en 1000 msec. Langere belichtingstijden (zolang detector pixels niet verzadigd) zal in het algemeen leiden tot hogere signaal-ruisverhouding, maar ten koste van een verhoogde scantijden.
3. Kies een hoekige increment die geschikt is voor uw toepassing. Monsters worden 180 ° gedraaid tijdens een scan, en het aantal beelden genomen tijdens de rotatie kan een aanzienlijke impact van de grootte van de dataset, de duur van de scan interval, en de uiteindelijke beeldkwaliteit hebben, maar er zijn over het algemeen afnemende meeropbrengsten in kwaliteit. Typische scans worden uitgevoerd op 0,25 ° stappen, waardoor 721 beelden per scan. Het verlagen van de incrementelet tot 0,125 ° resulteert in betere beelden te visualiseren fijne details, maar geeft 1.440 beelden en dus een veel grotere dataset (voor een typische gebied van belang, betekent ~ 10-30 GB data vs 5 GB). Echter, de signaal-ruisverhouding verbeterd en vaak moeite waard zowel de toegenomen scantijd en gegevensvolume. Droge stengels die waarschijnlijk vervormen / krimpen tijdens een scan kan worden met langere intervallen (kleinere hoek increment) zonder schade. Bij beeldvorming planten, waarin de biologische processen (bijvoorbeeld embolie repair) plaats op korte tijdschalen, kiezen voor de kortere intervallen scan de voorkeur potentieel schadelijke effecten van röntgenstraling beperken op dit weefsel, hoewel dit komt op een mogelijk verlies van beeldkwaliteit. Kortere intervallen scan kan worden bereikt met behulp van de Continuous Tomografie instelling waarin het monster continu draait, terwijl de beelden worden opgenomen.
4. Voor elke scan, moet "helderveld" en "dark field" beelden zijn corrected. Helderveld beelden zijn beelden zonder het monster in de balk. Deze worden vaak verzameld voor en na het doorlopen van het monster door het monster horizontaal vertalen. Donkere velden worden verzameld door het sluiten van de x-ray ontspanknop deze gemeten hoeveelheid signaal de camera vertoont zonder x-stralen.

6. Data Processing

1. Breng de "ruwe" 2D. TIF-afbeeldingen, die zijn uitgevoerd door de acquisitie computer naar een file server, op een gegevensverwerking computer. Als de computer voldoende RAM, kunnen de gegevens worden gekopieerd naar een zogenaamde "RAM Drive" (een deel van het RAM als harde schijf van de computer). Op deze manier de software niet hoeft te een draaiende harde schijf, die langzaam relatief is ten opzichte van een solid state drive of flash-geheugen. Deze stap vermindert de hoeveelheid tijd die nodig is datasets verwerken.
2. De beelden moet worden omgezet in een percentage transmissie schaal. Bundellijn 8.3.2 heeft een aangepaste background normalisering plug-in die kan worden gedownload en gebruikt worden met de vrij beschikbare software pakketten ImageJ of Fiji ( http://fiji.sc/ ). Het trekt de donkere tellingen van de beelden en normaliseert het monster beelden door de heldere gebieden over te geven beelden die procent transmissie tonen. Laad genormaliseerde beelden in de Octopus software pakket ( http://www.inct.be/en/software/octopus ) en "reconstrueren" van de 3D-dataset van de 2D-rauw. TIF-bestanden met behulp van de daarvoor bestemde bewerkingsstappen (Normaliseren beelden, Ring verwijderen , sinogram creatie, parallelle bundel reconstructie). Dit proces levert dan een reeks. TIF dwars (dwarsdoorsnede) beelden uit "voxels" (volumetrische pixelelementen), elk met een x, y, z coördinaat en intensiteit waarden voor de x-ray lineaire absorptiecoëfficiënt.

7. Visualisatie

1. VisualisatieZE de stapel beelden in een van verschillende softwarepakketten. Freeware (bijv. Drishti, http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml ) kan worden gebruikt om volumes of individuele of stapels beelden (bijv. ImageJ of FIJI) visualiseren. Andere softwarepakketten worden gebruikt voor 3D visualisatie. Onze onderzoeksgroep maakt gebruik van de Avizo softwarepakket ( http://www.vsg3d.com/avizo/overview ), maar anderen, zoals Amira ( http://www.amira.com/ ) en VGStudioMax ( http://www. volumegraphics.com / ) worden ook vaak gebruikt.
2. Laad datasets in het systeemgeheugen en geeft het monster in virtuele dwars, lengte, of radiale slice oriëntaties. Door de 3D-eigenschappen van de dataset, virtuele schijven via de sample draaibaar in elk vlak aan te sluiten bij de regio's van belang, een aanzienlijke verbetering ten opzichte van traditionele seriële lichtmicroscopie (zie Films 1-3 voor gedetailleerde voorbeelden).
3. Het monster visualiseren behoefte in 3D, "segment" het monster met de verschillende semi-geautomatiseerde en handmatige routines in Avizo naar vat lumen of andere structuren scheiden van het omringende weefsel. Segmentatie verwijst naar het definiëren van grenzen tussen objecten van belang, dus scheiden of segmenteren ze in afzonderlijke regio's. Rendering volumes in 3D wordt uitgevoerd door de visualisatie software. Een methode om dit te doen is direct volume rendering, waarbij elk punt in een volume wordt aangenomen uitzenden en licht absorberen, de hoogte en de kleur van emissie en absorptie kan worden vastgesteld met een "colormap", en de resulterende projectie in een bepaalde richting is op het scherm. Als alternatief wordt een wireframe of 3D-net oppervlak die de gesegmenteerde grenzen geconstrueerd om een ​​3D-model van t zienHij structuur van belang. De 3D mesh bestaat uit veelhoekige elementen, en het totale aantal elementen zowel de betrouwbaarheid van structuur reproductie en de grootte van het bijbehorende gegevensbestand (dwz meer elementen leidt tot betere kwaliteit maar groter bestand) beïnvloeden. Een verscheidenheid van beeldverwerking modules zijn beschikbaar in de visualisatie-software om het volume rendering uitgangen, alsmede de controle voor het imago van helderheid, contrast, transparantie, ruisonderdrukking, etc. te controleren

8. Kwantificatie

1. Zodra segmentatie werd uitgevoerd, is het mogelijk om de plant structuren of functionele veranderingen te kwantificeren in volume, lengte, breedte of afwezigheid van water, lucht, enz. Bijvoorbeeld Brodersen et al.. (2010) gebruikt Avizo software te kwantificeren de volumeverandering van waterdruppels in grapevine bijvullen schepen. Planten werden gescand elke 30 min gedurende vier tot acht uur waardoor een time-lapse volgorde van het schip bij te vullen. Elke scan werd gereconstrueerd en geladen in Avizo, waar individuele druppels werden gemeten in de tijd als hun volume toegenomen.

Representative Results

Synchrotron HRCT scans zijn met succes geïmplementeerd op een breed scala van planten weefsels en diersoorten met behulp van bundellijn 8.3.2 (figuur 5), en hebben nieuwe inzichten in de structuur en functie van planten xyleem met een ongekende resolutie in 3D. De visualisatie en exploratie van de door de 3D ​​reconstructie (zoals geïllustreerd in figuren 6-8 en films 1-3) maken een precieze bepaling van de locatie en oriëntatie van structuren met het xyleem netwerken aan beide uitgesneden monsters en in levende planten.

In sommige situaties zijn monster beweging of onbedoelde trillingen veroorzaakt verstoringen in de uiteindelijke beelden, waardoor de scans onbruikbaar (bijvoorbeeld figuur 4), maar de verbeteringen aan scantijd te verlagen (met continue tomografie) hebben geminimaliseerd de schadelijke effecten van die gegevens verliezen omdat veel meer scans kan nu worden afgerond in de beperkte beamtimetoegewezen aan elke gebruiker. Deze kortere scantijden ook in staat stellen herhaalde metingen van een enkele herhaling in de tijd om de dynamiek van processen zoals embolie verspreiding en reparatie vast te leggen.

Figuur 1. Schematische voorstelling van sample scannen procedure en setup in het hok bij ALS bundellijn 8.3.2 Linksboven:. De x-ray source balk (1) wordt geprojecteerd door het monster (2) die aan de lucht tafel bevestigd met een boorkop die draait tijdens het scannen. De röntgenstralen die door het monster op een kristal treffen scintillator (4) dat zichtbaar licht die omgeleid door een spiegel (5) door lenzen (6) een CCD camera (7) dat een digitaal beeld vangt fluoresceert. De "ruwe" 2D x-ray beelden (rechtsboven beeld-voorbeeld is een plant stam steekproef rotatie van 180 ° gedurende een volledige scan op een toename van 0,25 ° resulteert in 720 2D-beelden) getransformeerd en resulteren in een stapel van transversale beelden (rechtsonder) die worden gebruikt voor de 3D-reconstructies. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. Beeld genomen in het hok van de ALS bundellijn 8.3.2 toont een live, ingemaakte wijnstok voorbereid voor het scannen. De wijnstok is opgenomen in een acryl buis (1). De röntgenbundel gaat het hok naar links (2) en door het monster (bijvoorbeeld de stam wijnstok) (3) en dan in een lichtdichte doos met de camera, scintillator en optica (niet getoond in box beeld ).

"Fo: src =" / files/ftp_upload/50162/50162fig3highres.jpg "fo: inhoud-width =" 4in "/>
Figuur 3. Voorbeeld monster kraken (aangeduid met de witte pijlen) als een houtachtige wortel (hier) werd onderworpen aan drogen te lang en / of op te hoge temperatuur. Om deze schade te voorkomen en de structurele integriteit en klankgetrouwheid weefselstructuur in handhaven vivo uitdroging vereist enige testen van tevoren. Schaal bar = 1 mm.

Figuur 4. Beeldvervorming, zoals hier Voor vele kleine houtachtige wortels gevolg van de beweging van het monster tijdens de scan periode. In dit voorbeeld wordt een kolom van kleine houtachtige wortels (elke heldere witte vlek is een wortel) nog steeds vast aan een levende plant werden gescand en blijkbaar bewogen tijdens de scan en het resultaated in de vervormde afbeelding. Om dit probleem op monsters te overwinnen moeten veilig worden gestabiliseerd met extra padding in de acrylaat buis rondom de plant.

Figuur 5. Voorbeelden van dwarse beelden van houtige stengels gescand voor (A) Coastal Redwood en (B) Valley Oak. Witte schaal bars zijn 1,0 mm in beide beelden. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 6. 3D reconstructie van een stam gegenereerd uit een HRCT scan van een levende kust-redwood sapling getoond met een longitudinale en transverse vlak blootgesteld. meeste xyleem gezien in dit beeld water gevuld, terwijl er lucht gevulde buizen in het midden van de steel (zwarte pijl) dat door cavitatie geleid tijdens een droogte experiment. Deze scan ook gevangen leidingen in de handeling van het cavitatie-zie de tussenliggende grijstinten leidingen vormen een ring ongeveer halverwege tussen het centrum en de stuurpen buitenkant (witte pijl).

Figuur 7. Afbeelding van Brodersen et al. 2012 -. Plant, Cell & Milieu het aantonen van de 3D-reconstructie van xyleem vasculaire regeling in twee varensoorten gescand op twee verschillende punten op de frond vaatbundels zijn zichtbaar in blauw terwijl het omliggende weefsel is in het groen. In Pteridium aquilinum de vasculaire bundles zijn geoptimaliseerd voor hoge geleidbaarheid met veel verbindingen in zowel de frond tip (a) en base (c). Daarentegen Woodwardia fimbriata een veel conservatieve vasculaire arrangement met weinig aansluitingen tussen de bundels in de frond tip (b) en base (d). De resulterende vasculaire regelingen leiden tot hoge fotosynthetische tarieven in P. aquilinum maar ten koste van de lage tolerantie voor droogte, terwijl W. fimbriata is geoptimaliseerd voor frond een lange levensduur met lagere fotosynthetische tarieven, maar hogere droogte tolerantie. Schijfjes tip en onderaan ongeveer 4 mm en 9 mm in diameter, respectievelijk.

Figuur 8. 3D reconstructie gegenereerd uit een HRCT scan van walnoot stam xyleem. Dit beeld helpt om aan te tonen van de capaciteit voor het verkennen van het weefsel in een ongelooflijke resolutie als deze zijn twee aangrenzende xyleem leidingen die een onderling verbonden muur voor een groot deel van hun lengte te delen. Hier zijn de beeldverwerking en glad verwijderd van de dunne gedeelde vaatwand in het volume rendering. Exacte locatie en de dikte van de vaatwand wordt vastgehouden in de ruwe beeldgegevens en kunnen worden gebruikt om verbindingen te bestuderen. Elk van de aangesloten schepen in deze afbeelding zijn ~ 40 micrometer diameter.

Film 1. Klik hier om naar de film te bekijken .

Movie 2. Klik hier om naar de film te bekijken .

Movie 3.x/asset/supinfo/PCE_2524_sm_MovieS2.mov? v = 1 & s = 0f7e030bb72d2057d5a891215e375093e27e1102 "target =" _blank "> Klik hier om film te bekijken.

Discussion

Synchrotron HRCT biedt plantenbiologen met een krachtige, niet-destructieve tool om de innerlijke werking van plantaardige vaatstelsel verkennen in ongelooflijk veel details. Deze technologie is onlangs gebruikt om niet eerder beschreven anatomische structuren in grapevine xyleem die differentieel xyleem netwerkconnectiviteit te veranderen in verschillende grapevine soorten (Brodersen et al. 2012b, in press.) Te identificeren - deze connectiviteit kan drastisch veranderen, het vermogen van vasculaire pathogenen en embolie te verspreiden destructief in xyleem netwerken. De eerste succesvolle scans van levende planten hebben ook aangetoond fijne schaal detail van dynamische processen zoals embolie verspreiding en reparatie (Brodersen et al. 2010; McElrone et al. 2012 Nieuw Phytologist 196 (3) :661-665), en hielp om de rol van impliciete een specifieke levende cel-type in het repareren van embolie-de ruimtelijke resolutie die door HRCT bij ALS 8.3.2 heeft dit mogelijk gemaakt. Bijzonderheden over deze processen en andere Aspects van xyleem netwerken nog steeds ongrijpbaar-HRCT zal waarschijnlijk een belangrijke rol in de voortdurende ontdekking vooral wanneer gecombineerd met andere hoge resolutie technieken (bijv. Laser Capture Microdissection) spelen, en kan worden gecombineerd met andere recent ontwikkelde geavanceerde visualisatietechnieken voor gebruik in plantenbiologie ( bijvoorbeeld Lee et al., 2006; Truernit et al., 2008; Jahnke et al. 2009;. Iyer-Pascuzzi et al. 2010).

Materials

See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2