Använda högupplöst datortomografi för att visualisera den tredimensionella strukturen och funktion växt kärlsystem

Summary

Högupplösande röntgen datortomografi (HRCT) är en icke-förstörande diagnostisk bildteknik som kan användas för att studera strukturen och funktionen av växt vaskulatur i 3D. Vi visar hur HRCT underlättar utforskning av xylem nätverk inom ett brett spektrum av växtvävnader och arter.

Abstract

Högupplösande röntgen datortomografi (HRCT) är en icke-förstörande diagnostisk bildteknik med submikron upplösningsförmåga som nu används för att utvärdera strukturen och funktionen av växt xylem nätverk i tre dimensioner (3D) (t ex Brodersen m.fl. . 2010, 2011, 2012a, b). HRCT avbildning bygger på samma principer som medicinsk CT-system, men en hög intensitet synkrotron röntgenresultat källa i högre rumslig upplösning och minskad tid bildtagning. Här visar vi i detalj hur synkrotron-baserade HRCT (utförs vid Advanced Light Source-LBNL Berkeley, Kalifornien, USA) i kombination med Avizo mjukvara (VSG Inc., Burlington, MA, USA) används för att undersöka växter xylem i exciderad vävnad och växter som lever. Detta nya imaging verktyg tillåter användare att gå bortom traditionella statiska, 2D ljus eller mikrofoton elektron och prover studie med virtuella seriella sektioner i alla plan. Ett oändligt antal skivor i valfritt läge cen göras på samma prov, en funktion som är fysiskt omöjligt med traditionella mikroskopi metoder.

Resultaten visar att HRCT kan tillämpas på både örtartade och vedartade växter, och en rad växtorgan (dvs. blad, bladskaft, stjälkar, koffertar, rötter). Siffror som presenteras här bidra till att visa både en rad representativa anläggningar vaskulär anatomi och typen av detaljer ur HRCT datamängder, däribland söker efter kusten furu (Sequoia sempervirens), valnöt (Juglans spp.)., Ek (Quercus spp.)., Och lönn ( Acer spp.). träd plantor till solrosor (Helianthus annuus), vinrankor (Vitis spp.)., och ormbunkar (Pteridium aquilinum och Woodwardia fimbriata). Ut och torkade prover från vedartade arter är lättast att skanna och typiskt ger de bästa bilderna. Men senare förbättringar (dvs. snabbare genomsökningar och prov stabilisering) gjorde det possbelt att använda denna visualisering teknik på gröna vävnader (t.ex. bladskaft) och levande växter. Ibland någon krympning av hydratiserade grön växt vävnader orsakar bilder till oskärpa och metoder för att undvika dessa problem beskrivs. Dessa senaste framstegen med HRCT ger lovande nya insikter i växter vaskulär funktion.

Introduction

Vatten transporteras från växtrötter på bladen i en vaskulär vävnad som kallas xylem - ett nät av sammankopplade ledningar, fibrer och levande, metaboliskt aktiva celler. Transportfunktion av växt xylem måste upprätthållas för att leverera näringsämnen och vatten till bladen för fotosyntes, tillväxt, och i slutändan överlevnad. Vattentransport i xylem ledningar kan störas när xylem nätet äventyras av patogena organismer. Som svar på sådana infektioner anläggningar ofta producerar geler, tandkött och tyloses som ett sätt att isolera patogen spridning (t.ex. McElrone et al 2008, 2010). Torkstress kan också begränsa vattentransport i xylem. Som växter förlorar vatten under långvarig torka, bygger spänningen i xylem sav. Vatten under spänning är metastabil (dvs. vid en viss tröskel spänningen blir tillräckligt stor för att kavitera vattenpelare som finns i xylem ledningar). Efter kavitation inträffar kan en gasbubbla (emboli) bildas och fylla diruit, effektivt blockerar vatten rörelse (Tyree och Sperry 1989), ett fenomen analogt med tryckfallssjuka (dvs. "de böjer") i djupa hav dykare.

Trots betydelsen av xylem vattentransport för optimal anläggning fungerar som framgår av en stor mängd historiska och samtida litteratur om detta ämne (Tyree & Zimmermann, 2002,. Holbrook et al, 2005), finns det fortfarande aspekter av xylem nätverk som förblir svårfångade . Flera forskargrupper har nyligen börjat använda Högupplöst röntgen beräknad mikro-tomografi (HRCT) för att utvärdera finare detaljerna i trä anatomi och vaskulär vävnad (t.ex. Mayo et al, 2010, 2008, Mannes m.fl. 2010,. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012a, b; Maeda och Miyake, 2009, Steppe m.fl. 2004).. HRCT är en icke-förstörande teknik som används för att visualisera funktioner i det inre av fasta föremål och få digital information om sina 3-D strukturella egenskaper. HRCTskiljer sig från konventionella medicinska CAT-scanning i sin förmåga att lösa detaljer så små som en mikron i storlek, även för hög densitet objekt. Senaste framstegen inom synkrotronljus HRCT teknik har förbättrat bildupplösning och signal-brus-förhållande tillräckligt så att växt fartyg nätverk och intervessel anslutningar kan visualiseras, tilldelat 3D koordinater och exporteras för hydrauliska modellsimuleringar. Brodersen et al. (2011) fram nyligen denna teknik genom att kombinera 3D rekonstruktioner genereras av synkrotronstrålning HRCT med ett Fortran modell som automatiskt extraherar data från xylem nätverket vid mycket högre upplösning än någonsin möjligt med traditionella anatomiska metoder (dvs. seriell sektionering med en mikrotom och ta bilder med ljusmikroskop, t.ex. Zimmermann 1971). Detta arbete har också använts för att optimera hydrauliska modeller av xylem-systemet och identifiera unika egenskaper transporter (dvs. omvänt flöde i någon vessels under perioder av maximal transpirationen) (Lee et al., i granskning).

Synkrotron HRCT kan nu användas för att visualisera xylem funktionalitet, mottaglighet för kavitation och en växternas förmåga att reparera emboliseras ledningar. Underlåtenhet att återupprätta flödet i emboliseras ledningar minskar hydraulisk kapacitet, begränsar fotosyntes, och resulterar i anläggningar död i extrema fall (McDowell et al. 2008). Växter kan hantera emboli genom att avleda vatten runt blockeringar genom gropar som förbinder angränsande funktionella ledningar och genom att växa nya xylem att ersätta förlorad hydraulisk kapacitet. Vissa växter har förmågan att reparera avbrott i vattnet kolumnerna, men detaljerna i denna process i xylem under spänning har varit oklar i årtionden. Brodersen et al. (2010) visualiseras nyligen och kvantifierade påfyllning processen i levande vinstockar med HRCT. Framgångsrik fartyg påfyllning var beroende av vatten inflödet från levande celler som omger XYLem ledningar, där enskilda vattendroppar expanderat över tiden, fyllda kärl och tvingade upplösning av innesluten gas. Kapaciteten hos olika växter att reparera äventyras xylem fartyg och de mekanismer som styr dessa reparationer undersöks för närvarande.

Beskrivning av ALS anläggningen Beamline 8.3.2

Vårt arbete hittills har utförts på Hard röntgen Micro-tomografi Beamline 8.3.2 vid Advanced Light Source i Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA). Plantera prover placeras i en bly-fodrad ligger hutch 20 m från röntgenkällan, genererad av en 6 Tesla supraledande böj magnet dipol inom Advanced Light Source elektron lagring ring som arbetar vid en kritisk energi av 11,5 keV. En schematisk bild av slutstationen visas i figur 1. De röntgenstrålar in i buren med en stråle storlek av 40x ~ 4,6 mm och passerar genom provet som är monterad på en motordriven roterande stadium. Denutsända röntgenbilder kolliderar en kristall scintillator (två material som vanligen används är LuAG eller CdWO ₄₎ som omvandlar röntgenstrålar till synligt ljus som förmedlas via linser på en CCD för bildsamling. Kameran, scintillatorn och optik finns i en ljus tät låda som är på räls som gör provet till scintillator avstånd kan optimeras för faskontrast avbildning.

Alla prover är monterade på 10 cm diameter roterande led som i sin tur är monterad på horisontella och vertikala översättning stadier för prov positionering. En levande växtprov, med rotsystemet monterat i en specialbyggd anläggning grytlapp och bladverket i en akryl rör, kan ses i figur 2. Typiska exponeringstider kan variera från 0,1 till 1 sekund med 10-18 keV och skanna varaktighet kommer att variera från 5 till 40 min beroende på inställningarna optimerade för ett enskilt prov. För höga prov (typiskt nätverk växt xylem) kan data scans varakaklat genom att upprepa mätningen med provet vid olika höjder, som styrs automatiskt, så att sömlösa seriella sektioner längs en maximal provhöjd av ~ 10 cm. Största provbredd när avbildning vid 4,5 um resolutionen ~ 1 cm för prover som är nästan perfekt i vertikal riktning. Av data och bearbetningen avslutats med protokollet nedan. På grund av skillnaden i röntgen dämpning mellan luft och vatten, kan utmärkt bild kontrast erhållas i växter utan användning av kontrastmedel lösningar typiska medicinska CT-system. Den luftfyllda kärllumen är lätt att skilja från det omgivande vattenfyllda vävnad i hydratiserade växter.

Protocol

Protokoll detaljer beskrivs nedan skrevs speciellt för arbete på Advanced Light Source 8.3.2 beamline. Anpassningar kan krävas för arbete på andra synkrotron anläggningar. Korrekt säkerhet och strålning utbildning krävs för att användningen av dessa faciliteter.

1. Provberedning för levande växter

1. Odla växter i ~ 10 krukor cm diameter, och se till att den huvudsakliga stammen (eller del av anläggningen som ska skannas) så är centrerad som möjligt och orienterade vertikalt i potten. De fysiska dimensioner HRCT instrumentet hutch på avancerad gränser ljuskälla levande växter till ~ 1 m höjd. Som en konsekvens, är avbildning av levande växter bäst utförs på plantor / plantor odlade i små krukor. Beroende på experimentet kan olika jordtyper användas för att styra innehåll markfuktighet (t.ex. i torka experiment), och för vissa anläggningar med flexibla skott (t.ex. vinrankor) längre skott kan noggrant tucked in akryl röret beskrivs nedan (se figur 1 och 2).
2. Montera levande krukväxter i en skräddarsydd styv aluminium grytlapp. Topplattan höjd kan justeras för att rymma olika potten höjder. Den övre delen av plattan är utformad för att anpassa sig till toppen av markytan, och skjuter växt från centrum av den tvådelade platta. Syftet med grytlappen är att säkerställa anläggningens stammen hålls stadigt på plats för att minimera vibrationer eller prov rörelse. Minimera prov rörelse under en genomsökning är viktigt.
3. När monterade i hållaren, mäta potentialen stam vatten eller blad transpiration med hjälp av en Scholander kammare stil tryck eller en clip-on blad Porometer respektive att fastställa fysiologisk status av anläggningen före scanning.
4. Placera en tunnväggig akryl cylinder över anläggningen och ovanpå aluminiumfabrik hållaren och fäst den på plats med lera kitt för att stabiliseraprovet (Figur 2). Vibration eller rörelse av den övre bladen kommer att sändas ned stammen och orsaka växtvävnaden inom det skannade området att flytta, vilket slutligen leder till bildförvrängning. Cylindern används för att innehålla växter bladverk och förhindra växtblad från skaver mot andra delar av utrustning i buren som skulle resultera i vibrationer under en undersökning. Ytterligare plastfolie, pappershanddukar och tejp ska användas för att ytterligare minimera vibrationer och rörelse växtdelar (se problemen med prov rörelse i Figur 4). Att minska röntgenabsorption (som kan minska bildkvaliteten vid en given exponeringstid) bör innehåller cylindern ha så tunna väggar som möjligt samtidigt som tillräcklig styvhet för att utföra sin funktion.
5. Fäst den anpassade grytlappen till luft bärande scenen och lås den (skruv) på plats mellan röntgenkällan och bildsensorn och kamera utrustning. Positipå skaftet så vertikalt som möjligt och centrum på magnetiska fastspänningsanordningen bas för att säkerställa att provet stannar i synfältet under rotation.

2. Provberedning för färsk ut, växtvävnad

1. Färskt växtmaterial, vanligen stjälkar eller bladskaft, kan skannas efter omedelbar avlägsnande från en levande växt. Om avsikten med försöket är att visualisera hela den xylem nätet, vatten inom fartygen måste evakueras och ersättas med luft. För att göra detta, montera provet i en Scholander stil tryckkammare och tryck komprimerad luft eller kväve genom provet vid lågt tryck (<0,05 MPa) under ca 5 minuter. Arter skiljer sig i tid som krävs för att evakuera kärlet nätverket. Om avsikten är att utvärdera omfattningen av emboli bildas i den färska växtvävnad, då punktskatter prover från anläggningen med en ny rakblad och göra nedskärningar under vatten.
2. Linda provet i ett lager av Parafilm till prhändelse uttorkning under genomsökningen.
3. Montera provet i en borr-chuck fäst vid en metallplatta som är inskruvad i luftlagret stadiet. Center och orientera provet vertikalt såsom beskrivits ovan för att säkerställa att provet kvar i synfältet.

3. Provberedning för torkade Woody Vävnader

1. För optimal vävnadsprov visualisering och bild är det däremot nödvändigt att sakta torka hela provet Woody vävnad. Skär prover till ca 6 cm i längd. Välj prover som är så rak som möjligt i den riktade scan regionen och har en diameter på ≤ 1 cm.
2. Placera provet Woody vävnaden i en torkugn vid låg temperatur för att sakta torka provet utan att orsaka någon sprickbildning eller splittring av vävnaden. Denna process är sannolikt att skilja mellan arter och vävnader. För vedartade stammar, är 12 timmar i ett 40 ° C ugn typiskt tillräcklig för att ge utmärkt kontrast utan att orsaka betydande changes i den fysiska strukturen av stammen (se problem med snabb torkning visas i figur 3).
3. I vissa situationer är det önskvärt att ha en förvaltare markör i provet så att efterföljande dissektion och visualisering med svepelektronmikroskopi kan vara inriktade på specifika punkter i HRCT bilden. För att göra detta, anbringa en metall eller glas pärla eller tråd på utsidan av skaftet med Parafilm. En annan metod är att använda en silikonharts (t.ex. RTV-141, Bluestar Silicones, East Brunswick, NJ) som kan injiceras i en enda xylem ledning (se exempel i Brodersen m.fl. 2010). När härdat är silikonhartset tydligt i provet och lätt skiljas från de andra luftfyllda fartyg. Använd denna markör för att exakt lokalisera specifika områden av provet.
4. Montera provet i borrchucken och centrum, såsom beskrivits ovan.

4. Provberedning för Leaf Tissue för tvådimensionell (2D) Radiogram

1. För att visualisera kärlet innehållet i bladen i nära realtid, kan bladen skannas för att producera en 2D radiogram, liknar en tand röntgen. Montera bladet mellan två ark av tunn akrylplast och säkra kanterna med clips. Fäst sedan monterade provet till en post-hållare system och placera optiska kopplingsdäcket bredvid bildsystem och röntgenkällan.

5. Skanna provet i 8.3.2 Hutch

1. Bestäm förstoringen som fungerar bäst för din ansökan. ALS Beamline 8.3.2 har förmågan att skanna med objektiv med förstoringar av 2x, 5x och 10x. Dessa resultat i storlekarna pixel av 4,5, 2,25 och 0,9 pm, respektive. Beroende på förstoringen, måste provet vara av lämplig storlek, eftersom synfältet minskar med ökande förstoring. Se detaljer för val av kamera och objektiv och de resulterande parametrarna bilden i tabell 1.

	PCO.4000 (4008x2672)		PCO.Edge (2560x2160) (Optique Peter)
Lens	bildpunkt (im)	synfält (mm)	bildpunkt (im)	synfält (mm)
10x	0,9	3,6	0.65 (0.69)	1.7 (1.7)
5x (4x)	1,8	7,2	1.3 (1.72)	3.3 (4.4)
2x	4,5	18	3.25 (3.44)	8.3 (8.8)
1x	9	36	6,5 (-)	16,6 (-)

Tabell 1. Uppgifter om tillgängligakameror och objektiv på ALS 8.3.2.

2. Ställ röntgen energi till 15 keV. Detta har visat sig ge utmärkt bildkontrast för de flesta växter applikationer (se Brodersen et al. 2010, 2011, 2012a, b). Exponeringstider är i allmänhet beroende av tjockleken och densiteten hos provet (och därmed förstoringen som används) varierar mellan 100 och 1.000 ms. Längre exponeringstider (så länge som detektor pixlar inte mättas) kommer i allmänhet att leda till högre signal-brusförhållande, men till priset av ökade cykeltider.
3. Välj ett vinkelökning som är lämplig för din applikation. Prover roteras 180 ° vid en genomsökning, och antalet bilder som tagits under rotationen kan ha en betydande inverkan på storleken på datamängden, längd sökningen intervallet och sista bildkvalitet, men det är i allmänhet avtagande avkastning i kvalitet. Typiska genomsökningar utförs på 0,25 ° steg, vilket ger 721 bilder per sökning. Minska increment till 0,125 ° ger bättre bilder för att visualisera fina detaljer, men ger 1.440 bilder och därmed en mycket större datamängd (för en typisk område av intresse, innebär ~ 10-30 GB data vs 5 GB). Emellertid signal-brusförhållandet förbättras ofta och värd både den ökade tiden för sökningen och datastorlek. Torra stammar som sannolikt inte deformeras / krympa under en genomsökning kan utsättas för längre intervall (mindre vinkelökning) utan skada. När avbildning levande växter, där biologiska processer (t.ex. emboli reparation) sker på korta tidsskalor, väljer de kortare scan intervall är att föredra att begränsa eventuella skadliga effekter av röntgenstrålning på denna vävnad även om detta kommer i en potentiell förlust av bildkvalitet. Kortare scan intervall kan uppnås med hjälp av kontinuerlig Tomography inställning då provet kontinuerligt roterar medan bilderna tas.
4. För varje skanning måste "ljust fält" och "mörka fält" bilder kan corrected.. Ljusa fält bilder är bilder utan provet i balken. Dessa är ofta samlas före och efter skanning av provet genom horisontellt översätta provet. Mörka områden samlas genom att stänga röntgen avtryckaren detta mäts mängden signal kameran visar utan röntgen.

6. DATABEHANDLING

1. Överför "råa" 2D. TIF bilder, som exporterades från förvärvet dator till en filserver, en databehandling dator. Om datorn har tillräckligt RAM-minne, kan data kopieras till en så kallad "RAM-enhet" (en del av RAM-minnet visas som en hårddisk på datorn). På detta sätt programvaran inte har tillgång till en snurrande hårddisk, vilket är jämförelsevis långsam jämfört med en SSD-enhet eller flash-minne. Detta steg reducerar avsevärt den tid som krävs för att bearbeta datamängder.
2. Bilderna måste konverteras till en procent transmission skala. Beamline 8.3.2 har en egen background normalisering plug-in som kan laddas ner och användas med fritt tillgänglig programvara paket ImageJ eller Fiji ( http://fiji.sc/ ). Den subtraherar de mörka räknas från bilderna och normaliserar bildexemplen av de ljusa områdena för att ge bilder som visar procent överföring. Fyll normaliserade bilder till Octopus mjukvarupaketet ( http://www.inct.be/en/software/octopus ) och "rekonstruera" 3D dataset från 2D RAW. TIF filer med de angivna processtegen (Normalisera bilder, ring borttagning , sinogram skapande, parallell stråle rekonstruktion). Denna process ger sedan en serie av. TIF tvärgående (tvärsnittsarea) bilder som består av "voxlar" (volymetriska bildelement), alla med ett x, y, z-koordinat och intensitet som representerar x-ray linjär absorptionskoefficient.

7. Visualisering

1. Visualiseringze bunten av bilder i en av en mängd olika programpaket. Freeware (t.ex. Drishti, http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml ) kan användas för att visualisera volymer eller enstaka eller staplar av bilder (t.ex. ImageJ eller Fiji). Andra mjukvarupaket kan användas för 3D-visualisering. Vår forskargrupp använder Avizo programvarupaket ( http://www.vsg3d.com/avizo/overview ), men andra, såsom Amira ( http://www.amira.com/ ) och VGStudioMax ( http://www. volumegraphics.com / ) är också vanligt förekommande.
2. Fyll datamängder i systemminnet och visa provet i virtuella tvärgående, längsgående eller radiella orienteringar slice. På grund av de 3D-attribut datamängden, virtuella skivor genom sample kan roteras i alla plan för att anpassa de områden av intresse, en avsevärd förbättring jämfört med traditionella seriella ljusmikroskopi (se filmer 1-3 för detaljerade exempel).
3. För att visualisera provet som behövs i 3D, "segmentet" provet med samma mängd semi-automatiska och manuella rutiner i Avizo att separat kärl lumen eller andra strukturer från den omgivande vävnaden. Segmentering syftar till att definiera gränserna mellan objekt av intresse, vilket separera eller segmentering dem i separata regioner. Rendering volymer i 3D utförs av visualisering programvara. Ett sätt att göra detta är direkt volym rendering, där varje punkt i en volym antas att avge och absorbera ljus, mängden och färgen av utsläpp och upptag kan definieras med hjälp av en "färgkarta", och den resulterande projektion i en given riktning är visas på skärmen. Alternativt, är en trådram eller 3D-nätet ytan som representerar de segmenterade gränser konstruerade för att visa en 3D-modell av tHan struktur av intresse. Den 3D-nät består av polygonala element och det totala antalet element kommer att påverka både trohet av struktur reproduktion och storleken på den tillhörande datafilen (dvs. fler element leder till högre trohet, men större filstorlek). En mängd olika moduler bildbehandling finns tillgängliga inom visualisering programvara för att styra utgångar volym rendering, samt kontroll av ljusstyrka, kontrast, öppenhet, brusreducering, etc.

8. Kvantifiering

1. När segmentering har gjorts, är det möjligt att kvantifiera de strukturer målväxten eller funktionella förändringar i volym, längd, bredd, närvaro eller frånvaro av vatten, luft, etc. Till exempel, Brodersen et al. (2010) används Avizo programvara för att kvantifiera volymförändringen av vattendroppar inuti vinrankor påfyllning fartyg. Växterna skannas var 30 min under fyra till åtta timmar skapa en tid-laPSE sekvens fartyg påfyllning. Varje sökning rekonstruerades och laddas in Avizo, där enskilda droppar mättes över tid som deras volym ökade.

Representative Results

Synchotron HRCT skanningar har framgångsrikt genomförts på en mängd olika växtvävnader och arter med beamline 8.3.2 (Figur 5), och har gett nya insikter i struktur och funktion av växt xylem på oöverträffad upplösning i 3D. Visualisering och utforskning kapacitet som tillhandahålls av 3D rekonstruktioner (som visas i figur 6-8, och filmer 1-3) möjliggör exakt bestämning av läge och orientering av strukturer med xylem nät på båda utskurna prover och i levande växter.

I vissa situationer har prov rörelse eller oavsiktliga vibrationer orsakade snedvridningar i de slutliga bilderna, vilket gör att skanningar oanvändbara (t.ex. figur 4), men de förbättringar för att minska söktiden (med kontinuerlig tomografi) har minimerat de skadliga effekterna av sådana dataförluster eftersom många fler skanningar kan nu slutföras under begränsade beamtimetilldelas varje användare. Dessa kortare cykeltider möjliggör också upprepade mätningar av en enda kopia över tiden för att fånga dynamiken i processer som emboli spridning och reparation.

Figur 1. Schematisk prov scanning förfarande och inställning inuti buren vid ALS beamline 8.3.2 Övre vänster:. X-ray källstrålen (1) projiceras genom provet (2) som är ansluten till luften bord med en borrchuck som roterar under skanning. De röntgenstrålar som passerar genom provet träffar på en kristall scintillator (4) som fluorescerar synligt ljus som omriktas av en spegel (5) genom linserna (6) till en CCD-kamera (7) som fångar en digital bild. De "råa" 2D röntgenbilder (övre högra bild-exempel är en växt stam prov roteras 180 ° under en fullständig genomsökning vid en ökning av 0,25 ° resulterar i 720 2D-bilder) omvandlas och resultat i en stapel av tvärgående bilder (nere till höger) som används för 3D rekonstruktioner. Klicka här för att se större bild .

Figur 2. Bild tagen inne i buren i ALS beamline 8.3.2 visar en levande, krukväxter vinranka förberedd för skanning. Vinrankan finns i en akryl tub (1). X-ray beam in i buren till vänster (2), sedan passerar genom provet (t.ex. grapevine stammen) (3) och sedan in i en lätt tät låda som innehåller kameran, scintillatorn och optik (fält inte visas i denna bild ).

"FO: src =" / files/ftp_upload/50162/50162fig3highres.jpg "FO: content-width =" 4I "/>
Figur 3. Exempel på prov sprickbildning (betecknade med de vita pilarna) när en Woody rot (se här) utsattes för torkning för länge och / eller vid för hög temperatur. För att undvika denna skada och för att upprätthålla strukturell integritet och trohet till vävnad struktur vivo uttorkning kräver viss testning i förväg. Skalstock = 1 mm.

Figur 4. Bild snedvridningar, som här för många små vedartade rötter, resultat från rörelse av provet under genomsökningen perioden. I detta exempel en kolonn av små vedartade rötter (varje ljus vit fläck är en enda rot) fortfarande är knutna till en levande växt skannades och tydligen rört under genomsökningen och resultateted i den förvrängda bilden. För att övervinna det här problemet prover måste säkert stabiliseras med extra stoppning på insidan av akryl röret som omger anläggningen.

Figur 5. Exempel på tvärgående bilder av vedartade stammar skannas för (A) Coastal Redwood och (B) Valley Ek. Vita skala barer är 1,0 mm i båda bilderna. Klicka här för att se större bild .

Figur 6. 3D rekonstruktion av en stam som genereras från en HRCT genomsökning av en levande kust furu planta visas med en longitudinell och transverse plan exponerad. Merparten av xylem ses i denna bild är vattenfyllda, medan det finns luftfyllda kanaler i centrum av stammen (svart pil) som blev resultatet av kavitation under en torka experiment. Detta scan fångas även ledningar i agera av kaviterande-se de mellanliggande grå skala ledningar bildar en ring ungefär halvvägs mellan centrum och spindeln exteriör (vit pil).

Figur 7. Bild från Brodersen m.fl. 2012 -. Plant, Cell & Environment som visar 3D-rekonstruktion av xylem vaskulär arrangemang i två ormbunke arter skannas vid två olika punkter på ormbunksblad kärlknippena syns i blått medan den omgivande vävnaden är i grönt. I Pteridium aquilinum, det vaskulära bunDLE är optimerade för hög ledningsförmåga med många anslutningar i både ormbunksblad spets (a) och bas (c). Däremot har Woodwardia fimbriata en mycket mer konservativ vaskulär arrangemang med några kopplingar mellan buntar i ormbunksblad spetsen (b) och bas (d). De resulterande vaskulära system leda till höga fotosyntetiska priser i P. aquilinum men på bekostnad av låg tolerans för torka, medan W. fimbriata är optimerad för ormbunksblad livslängd med lägre fotosyntetiska priser men högre torka tolerans. Ormbunksblad spets och sektioner bas är ca 4 mm och 9 mm i diameter, respektive.

Figur 8. 3D-rekonstruktion genereras från en HRCT scan av valnöt stam xylem. Denna bild hjälper till att visa förmåga för att utforska vävnaden i otrolig upplösning som dessa är två intilliggande xylem ledningar som delar en sammankopplad vägg för en stor del av sin längd. Här har bildbehandling och utjämning bort den tunna delade kärlväggen i volymen rendering. Exakt läge och tjockleken hos detta kärlväggen kvarhålles i de råa bilddata och kan användas för att studera anslutning. Var och en av de anslutna fartyg i denna bild har ~ 40 nm i diameter.

Film 1. Klicka här för att se filmen .

Film 2. Klicka här för att se filmen .

Film 3.x/asset/supinfo/PCE_2524_sm_MovieS2.mov? v = 1 & s = 0f7e030bb72d2057d5a891215e375093e27e1102 "target =" _blank "> Klicka här för att se filmen.

Discussion

Synchotron HRCT ger växt biologer med en kraftfull, icke-förstörande verktyg för att utforska det inre arbetet i fabriken vaskulatur i otrolig detaljrikedom. Denna teknik har använts nyligen för att identifiera tidigare obeskriven anatomiska strukturer i Grapevine xylem som differentiellt förändrar anslutning xylem nätverk i olika vinrankor arter (Brodersen m.fl. 2012b, under tryckning.) - Denna anslutning kan drastiskt förändra möjligheten för vaskulära patogener och emboli att sprida destruktivt hela xylem nätverk. De första lyckade skanningar av levande växter har också visat fina skala detaljer av dynamiska processer som emboli spridning och reparation (Brodersen m.fl. 2010, McElrone m.fl. 2012 New Phytologist 196 (3) :661-665), och hjälpte till att blanda in den roll en specifik levande cell typ i reparera emboli-den rumsliga upplösningen från HRCT vid ALS 8.3.2 gjort detta möjligt. Detaljerad information om dessa processer och andra AspeCTS på xylem nätverk fortfarande svårfångad-HRCT sannolikt kommer att spela en viktig roll i det fortsatta upptäckt särskilt när det paras ihop med andra högupplösta metoder (t.ex. laser Capture mikrodissektion) och skulle kunna paras ihop med andra nyligen utvecklade avancerade visualiseringstekniker för användning i växtbiologi ( t.ex. Lee et al, 2006; Truernit et al, 2008; Jahnke m.fl. 2009,. Iyer-Pascuzzi m.fl. 2010).

Materials

See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2