Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

Summary

De mechanische eigenschappen van endotheliale glycocalyx gemeten door inkeping met micron bollen op AFM uitkragingen. Endotheelcellen werden gekweekt in een aangepaste kamer onder fysiologische voorwaarden stroom glycocalyx expressie te induceren. De gegevens werden geanalyseerd met een dunne film model de glycocalyx dikte en modulus te bepalen.

Abstract

Ons begrip van de interactie van leukocyten en de vaatwand tijdens leukocyt capture wordt beperkt door een onvolledig begrip van de mechanische eigenschappen van het endotheeloppervlak laag. Het is bekend dat adhesiemoleculen op leukocyten zijn niet gelijkmatig ten opzichte oppervlaktopografie ³ verdeeld, dat topografie beperkt lijmverbinding formatie met andere oppervlakken ^9, en fysiologische contactkrachten (≈ 5,0 tot 10,0 per microvillus pN) kan de microvilli comprimeren als slechts een derde van hun lengte rusten, de toegankelijkheid van moleculen aan het tegenoverliggende oppervlak ^{3, 7.} We beschouwen het endotheel als een twee-lagen structuur, de betrekkelijk stijve cellichaam, plus de glycocalyx, een zachte beschermende suiker coating op het luminale oppervlak ^6. Het is aangetoond dat de glycocalyx kan fungeren als een barrière om de hechting van leukocyten verminderen aan het endotheliale oppervlak ^4.In dit rapport hebben we beginnen met de vervormbaarheid van endotheliale oppervlakken aan te pakken om te begrijpen hoe de endotheliale mechanische stijfheid kunnen bindingsvorming beïnvloeden. Endotheliale cellen gekweekt in statische cultuur spreken zich niet uit robuust glycocalyx, maar cellen gekweekt onder fysiologische stromingscondities beginnen een benadering van de glycocalyx waargenomen in vivo ^2. De modulus van de endotheelcellen lichaam is gemeten met behulp van atomic force microscopie (AFM) om ongeveer 5 tot 20 kPa ^5. De dikte en structuur van de glycocalyx werden bestudeerd met elektronenmicroscopie ⁸ en de modulus van de glycocalyx is benaderd door indirecte methoden, maar voor zover wij weten, zijn er geen gepubliceerde verslagen van een directe meting van de glycocalyx modulus in levende cellen . In deze studie presenteren we inkeping proeven met een nieuwe AFM probe op cellen die zijn gekweekt in omstandigheden hun glycocalyx expressie maximaliseren make directe metingen van de modulus en de dikte van de endotheliale glycocalyx.

Protocol

1. Methoden

1,1 Cell Flow Kamer

Een stromingskamer, getoond in figuur 1, is geconstrueerd dat cellen kunnen worden gekweekt onder een afschuifsnelheid van 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ en vervolgens direct overgebracht naar een Asylum MFP3D AFM (Santa Barbara, CA).

1. De stromingskamer werd voorbereid voor de proef door eerst reinigen van de glaasjes in Piranha-oplossing (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ gedurende 15 min en vervolgens wassen met gedestilleerd water. Zij werden vervolgens gebakken tot droog en bedekt met aminopropyltriethoxysilaan (APTES) in een vacuüm afzettingskamer.
2. Een siliconen pakking werd gesneden met behulp van een Silhouette SD snijgereedschap. Dit liet ons toe om de stroom fijn kamerafmetingen voor het regelen van het debiet en shear stress tijdens celgroei. Typisch werd een kanaal uitgesneden 6,4 mm breed en 19 mm lang uit een plaat van 0,4 mm silicone. Het debiet nodig is om generate een afschuifspanning van 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ wordt berekend uitgaande van laminaire stroming in een rechthoekig kanaal met de vergelijking:

waarbij Q het debiet τ de schuifspanning μ is de viscositeit van het medium, hier aangenomen om 1,0 mPa (0,01 dyn * sec / cm ^2), h de hoogte en de breedte w van de stromingskamer .

3. Het bovenste deel van de stromingskamer is uitgelijnd met de pakking in de celkweekschaal en met een magnetische ring. De assemblage werd gevuld met isopropyl alcohol (IPA) voor sterilisatie.
4. Het volledige-stroomsysteem werd geassembleerd. De stroompoorten in de celkweekschaal aangesloten op driewegkleppen. De kleppen werden verbonden met 30 ml spuit te openens. IPA werd doorgespoeld, dat vervolgens werd met 30 ml medium McCoy's gewassen met 4% foetaal kalfsserum (FCS). Het systeem werd gevuld met 20 ml van de Vec Technologies celgroei medium. Deksels werden op de toppen van de injectiespuiten. De vangst reservoir spuit dop had een naald op zijn plaats om terug te gaan medium om de feed reservoir. Steriele 0,2 pm filters werden aan de luchtinlaten in de omslagen om verontreiniging van het systeem. De stroom kamer was dan klaar voor cel zaaien.

1,2 Cultuur van de Cel

1. Humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC's) en groeimedium werden gekocht bij Vec Technologies (Rensselaer, NY) en tot confluentie gekweekt in een T25 fles.
2. Het groeimedium werd uit de kolf verwijderd en de monolaag van cellen model met 2 ml van 2,5% trypsine. Zodra de cellen in oplossing werd het trypsinisatie geblust door toevoeging van 10 ml celkweekmedium aan de kolf.
3. The celsuspensie werd gedurende 5 min en het supernatant werd verwijderd. De cellen werden geresuspendeerd in 1 ml celkweekmedium (met serum) voor injectie in de stromingskamer.
4. De celsuspensie (0,5 ml, ~ 50.000 cellen) werd geladen in een spuit en geïnjecteerd in de stromingskamer via een driewegklep.
5. De cellen werden bezinken en het glazen substraat hechten gedurende 2 uur vóór stroming werd gestart. De cellen werden gekweekt onder stroming in een incubator bij 37 ° C gedurende 1 tot 5 dagen tot confluent.

1,3 Cantilever Voorbereiding en Cell Inspringen

1. Puntloze AFM cantilevers (nanowereld, Zwitserland) werden gereinigd salpeterzuur gedurende 5 min en gefunctionaliseerd met aminopropyltriethoxysilaan (APTES) in een kamer voor dampafzetting.
2. Een oplossing van 5 mg / ml gew NHS-sulfo-LC-biotine in gebufferde zoutoplossing Hank's (HBSS) bereid. De cantilevers werden ondergedompeld in de oplossing gedurende 15 min te conjugate het silaan met N-hydroxysuccinimide (NHS) chemie.
3. Een oplossing van biotine-vrij medium werd door het incuberen van 20 ml Vec Technologies celkweekmedium (waaronder serum) met 200 ul streptavadin kralen gedurende 12 uur. De bolletjes werden uit het medium met een magneet en het medium werd gefiltreerd door een 0,22 urn steriel filter.
4. De stromingskamer werd uit de celkweekschaal en de cellen werden gewassen in 37 ° C biotine-vrij medium.
5. Een voorraadoplossing van 1 pl van 2,4 urn parels gecoat met streptavidine in 1 ml van biotine vrij medium werd bereid, en 100 pl van de stock toegevoegd aan de celkweekschaal.
6. Streptavidine kralen werden opgepikt met de cantilever door de aanvoer van de tip over het glasoppervlak naast een kraal, terugtrekken, het positioneren van de top van de cantilever over de kraal, en vervolgens op de cantilever naar beneden op de kraal en rust gedurende enkele seconden.
7. De gevoeligheid van de cantilever was maatregeld door inspringen op een gebied van kale glas en met de helling van de curve de punt afbuiging als functie van spanning ingesteld.
8. De veerconstante van de cantilever werd berekend uit een thermische calibratie in de MFP3D software.
9. De gekalibreerde cantilever werd vervolgens gebruikt om streepje de monsters, zoals getoond in figuur 2. Deze 2,4 urn korrels hebben een groter contactoppervlak met het celoppervlak zodat de mechanische eigenschappen van de zacht glycocalyx laag kan worden gedetecteerd. De cantilever is geplaatst boven een cel nabij de celkern en zachte aanpak van de punt op de cel werd gebruikt om de cantilever hoogte ongeveer 3 urn boven het celoppervlak vastgesteld. De software werd gedurende 20 herhaalde indrukkingen met een snelheid van 1 um / sec tot maximaal kracht van 7 nN. Ongeveer 6 seconden verstreken tussen opeenvolgende contacten. Het is mogelijk om verschillende percentages van inspringing om te testen voor tijdsafhankelijke eigenschappen van de glycocalyx, hoewel deze eerste experimenten slechts een inkeping percentage (1 um / sec) gebruikt.

2. Inspringen Theorie

Inkeping in een elastisch half-ruimte met een bol met straal R kan worden beschreven met Hertz theorie waar de kracht van inspringing, F wordt gegeven door de vergelijking:

Waarbij δ is de inkeping diepte en E * is de verminderde modulus van het materiaal onder test (figuur 3). Bij een oneindig stijve indenter botst een uniforme elastische halfruimte wordt E * gegeven door de vergelijking:

3/50163eq3.jpg "/>
waarbij E de elasticiteitsmodulus en ν de Poisson verhouding van het materiaal. Recent werk met polymeerfilms geïnspireerd de ontwikkeling van een tweelaagse model voor het bepalen van de modulus en de dikte van dunne films ^1. Wij passen dit model celbiologie door behandeling van de glycocalyx een uniforme dunne zachte film op het oppervlak van het cellichaam. Met dit model verminderde de modulus van het systeem wordt:

Wanneer _GC E de modulus van de glycocalyx, E _cel de modulus van het cellichaam, P, Q en n constanten zijn die empirisch zijn bepaald uit het polymeer past en z wordt gegeven door de vergelijking:

Waarbij t de dikte van de glycocalyx laag. Een schema van deze parameters is weergegeven in figuur 3. Het model is aangetoond dat een nauwkeurige manier om de modulus en de dikte van een dunne film op stijver substraat ¹ zijn. Deze vergelijking kan worden gebruikt om de curves verkregen indrukking in cellen passen bij de modulus en de dikte van de endotheliale glycocalyx bepalen, zoals getoond in figuur 4.

Representative Results

In een typisch experiment werden 20 kracht-vs-afstand curves verkregen uit een bepaald gebied van de cel, meestal in de perinucleaire regio dichtbij, maar niet op de kern (binnen ~ 2 pm). De krommen werden aangepast om eventuele drift monster gedurende de duur van de meting en vervolgens gemiddeld om cantilever ruis, zoals getoond in figuur 4. De curven werden geanalyseerd en passen de twee lagen model dat is ontwikkeld voor het bepalen van de modulus en de dikte van dunne polymeerfilms ^1. Uit fits van de curven van 25 cellen, hebben wij vastgesteld dat de modulus van de luminale laag is 0,7 ± 0,5 kPa en de dikte van 380 ± 50 nm, zoals getoond in figuur 5. De modulus van het cellichaam is 16 ± 6 kPa. Deze waarden komen goed overeen met eerdere metingen van de modulus van het cellichaam en dikte van de glycocalyx ^{5, 8.}

Figuur 1. Onze celkweek apparaat. Flow over de kamer werd gedreven door de zwaartekracht uit het reservoir A tot C. Cellen werden uitgeplaat in de gesloten ruimte B die met magneten gehouden op het oppervlak van een gesloten cel schotel een Asylum AFM (Asylum, Santa Barbara CA ). Driewegkleppen op B stelde ons in staat om de stroom te stoppen. Een afdichtring creëerde een stromingskanaal 6,4 mm breed en 19 mm lang by 0,4 mm hoog. De gesloten kamer B werd snel verwijderd en de gesloten cel gerecht verhuisde direct in de AFM om te experimenteren. Het hoogteverschil D werd gehandhaafd door het pompen van vloeistof reservoir C naar A met een peristaltische pomp (niet getoond). Het geheel werd in een incubator gedurende de celkweek.

Figuur 2 Links:. Afbeelding van een console met een 2,4urn kraal (pijl) worden gemonteerd door biotine-streptavidine binding. Rechts: monolaag van endotheelcellen gekweekt onder stroming.

Figuur 3. Geometrie van de interactie van de kraal met straal R inspringen afstand δ in de cel. Glycocalyx, in het groen, een modulus van E _GC en een dikte t. Het cellichaam een modulus E _cel. De kracht die door de hiel naar de cel, F, wordt gemeten en de kracht versus afstand curve, figuur 4 wordt verkregen.

Figuur 4. Het gemiddelde kracht versus afstand curve voor een inkeping in een cel wordt weergegeven in rood. Een individuele inspringing getoond in de inzet. Gemarkeerde in het beeld zijn het contactpunt, waar de cantilever eerste raakt het luminale oppervlak, het luminale laag, waarin de helling van de curve wordt bepaald door de stijfheid van de glycocalyx, en het cellichaam, waar de helling is voornamelijk een functie van de cel body modulus. De getrokken curve van de tweelagige inkeping theorie wordt in blauw en de pasvorm voor de eenvoudigere Hertz model voor een elastische halve ruimte wordt weergegeven door de gestippelde zwarte lijn. Er waren vier vrije parameters in de tweelagige past. Waarden die voor deze specifieke fit waren: cell modulus = 15,9 kPa, luminaal laag modulus = 0,33 kPa, en luminale laagdikte = 420 nm. De vierde gemonteerd parameter is het contactpunt met de glycocalyx. Plaatsing van de x-oorsprong ten opzichte van het celoppervlak is arbitrair. Klik hier om groter bedrag bekijken .

5 "fo: inhoud-width =" 5.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5.jpg "/>
Figuur 5. Histogrammen van de eigenschappen van 25 cellen van de curve fits. Links: E _GC werd bepaald op 0,7 ± 0,5 kPa. Rechts: De dikte van de glycocalyx werd bepaald op 380 ± 50 nm.

Discussion

We gebruikten waarden berekend uit de tweelagige model en Hertz theorie de interactie van leukocyten in het bloed aan de endotheel wand model. We hebben berekend dat een microvillus de leukocyten met een diameter van 50 nm minder dan 10 pN belasting zou ongeveer 150 nm streepje, in de glycocalyx, slechts een fractie van de totale dikte. Dit betekent dat de glycocalyx, met eigenschappen zoals gemeten in dit experiment, is een belangrijke belemmering voor cel-cel interactie en kan een grote sterische hindering die de cellen moeten overwinnen tijdens de hechting cascade tijdens leukocytadhesie.

In het model dat hier we ongeveer de glycocalyx als een isotrope elastische constructie. Hoewel wij niet bewust van enige mechanische metingen aangeven dit niet het geval is, wat bekend is over de moleculaire structuur van de glycocalyx suggereert dat dit waarschijnlijk te simpel. In feite is de glycocalyx een complex en gevarieerdstructuur op het oppervlak van cellen. Het bestaat uit gerichte moleculaire structuren, mist een welbepaalde buitengrens, en waarschijnlijk verdicht dicht bij het celoppervlak. Terwijl de twee-lagen elastisch model hier gebruikte inzicht in de relatieve stijfheid van de glycocalyx gelegd door cellen, zouden toekomstige studies onderzoeken alternatieve mechanische beschrijvingen die verantwoordelijk zijn voor eventuele anisotropie en variërende dichtheid in de dikterichting. Het is ook mogelijk dat de glycocalyx niet uniform over verschillende gebieden van het celoppervlak. Dit zou niet blijkt uit de vastgestelde onderhavige gegevens omdat alle hier beschreven werden in het centrale gebied van de cel rond de kern.

De glycocalyx ook visco-elastische eigenschappen vertonen die niet in deze studie. Het is waargenomen dat in statische toestand, rode bloedcellen in haarvaten kan volledig de glycocalyx comprimeren, wheres circulerenderode bloedcellen niet ^10. Opgewekt door statische rode cellen waarschijnlijk zeer kleine (~ 3-10 Pa). Dit geeft de glycocalyx kan zeer zacht in reactie op trage compressie, maar aanzienlijk stijver in snellere compressie. De metingen werden uitgevoerd bij snelheden van 1 inkeping um / sec de stijfheid een circulerende cel kan tegenkomen simuleren, maar verder werken om de tijdsafhankelijke eigenschappen te onderzoeken wordt uitgevoerd.

AFM inkeping is gebruikt om rechtstreeks de modulus en de dikte van de endotheliale glycocalyx in levende cellen. De metingen geven aan dat de glycocalyx kan een belangrijke belemmering voor cel-cel contact en hechting zijn en waarschijnlijk dient als een belangrijke factor in het reguleren van de adhesie cascade tijdens ontsteking.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's Medium	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Endothelial Cell Growth Medium	Vec Technologies	MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid	JT Baker	9681-02
Hydrogen Peroxide	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Aldrich	440140-100ML
Isopropyl Alcohol	VWR	BDH8999-4
Trypsin	Cellgro	25-054-C1
Hank's Buffered Salt Solution	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
Streptavadin beads	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Tipless Cantilevers	Nanoworld	ARROW-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouette-SD
Silicone Rubber	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
30 ml Syringes	Benton Dickinson	309650
18 gauge needles	Benton Dickinson	305196
Extension Sets	Hospira	4429-48
4 way valves	Teleflex	W21372
Male/Female Port Caps	Smith’s Medical	MX491B
Peristaltic Pump	Watson-Marlow	401U/D
Peristaltic Tubing	Watson-Marlow	903.0016.016
sterile filters	Pall Life Science	4652