Summary
内皮糖萼的机械特性测定压痕使用AFM的悬臂上的微米大小的球体。内皮细胞培养在一个自定义的腔室，在生理流动条件下，诱导糖萼表达。使用薄膜的模型，以确定具有糖萼厚度和弹性模量的数据进行了分析。
Abstract
我们理解白细胞捕获期间的白细胞与血管壁的相互作用的限制由内皮表面层的机械性能的一个不完整的理解。它是已知的非均匀分布的白细胞粘附分子相对于表面拓朴图3，该地形限制粘结形成其他的表面9，并且，生理上的接触力（≈5.0 - ：10.0，PN每微绒毛）可以为压缩的微绒毛少三分之一其休息的长度，增加分子的可访问性的相对表面3，7。我们认为，血管内皮细胞的两层结构，相对刚性的单元主体，加上糖萼腔表面6上，一个软保护糖衣。它已被证明，糖复合物可以作为阻挡减少白细胞粘附于内皮表面4。在这份报告中，我们着手解决的内皮细胞表面的变形，以了解血管内皮的机械刚度，可能会影响债券的形成。静态培养中生长的血管内皮细胞不表达一个强大的糖复合物，但在生理流动条件下生长的细胞开始观察体内的糖复合物。内皮细胞体的模量，已使用原子力显微镜（AFM）测定的，是大约5到20千帕5。的糖复合物中的厚度和结构进行了研究，使用电子显微镜8，和已糖复合物的模量的近似使用间接的方法，但就我们所知，没有已经发表在活细胞中的蛋白质复合物的弹性模量的直接测量的报告。在这项研究中，我们提出了一个新的原子力显微镜探针对细胞已培养的条件下，最大限度地发挥他们的糖被表达马压痕实验科的直接测量的弹性模量和厚度的内皮糖萼。
Protocol
1。方法
1.1细胞流动室
甲流室， 如图1中所示，构建了使细胞可为1.0帕（10达因/厘米2）的剪切下生长，然后直接转移到一个的庇护MFP3D原子力显微镜（圣巴巴拉，加利福尼亚州）。
- 流动室，制备实验首先通过清洗载玻片的Piranha溶液（3:1 H 2 SO 4：H 2 O 2）为15分钟，然后用蒸馏水洗涤。然后将它们进行烘烤，以干燥和涂有氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）在真空沉积室中。
- 有机硅垫片被切断使用剪影SD刀具的。这使我们能够精细地控制用于控制细胞的生长期间的流动速率和剪切应力的流动腔室的尺寸。通常情况下，一个信道被切断6.4毫米宽了19毫米，长为0.4mm的硅树脂的片材。的流量所需的属特1.0帕（10达因/厘米2）的剪切应力的计算假设层流中的矩形通道与方程：
其中 Q是流率，τ是剪切应力，μ是介质的粘度，这里假定为1.0毫帕（0.01达因*秒/ cm 2），h是高度和w是流动室的宽度。
- 的流动腔室的顶部件对齐的垫圈中的细胞培养皿中，并与磁性环固定。该组件填充用异丙醇（IPA）进行灭菌。
- 全流系统的组装。细胞培养皿中的流通口连接到三通阀。连接打开的阀门30ml注射器第IPA冲洗通过该系统，然后用4％的胎儿小牛血清（FCS）的McCoy的培养基用30ml洗涤。该系统，然后用20毫升的VEC技术细胞生长培养基填充。盖被放置在顶部的注射器。捕捞水库注射器的帽针在移动中储饲料。不育0.2μm的过滤器被安装在盖的进气口，以防止系统的污染。流动腔细胞接种的准备。
1.2细胞培养
- 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和生长培养基购自VEC技术（伦斯勒，NY），并生长至汇合在T25药剂。
- 除去生长培养基中，从烧瓶中，并用2毫升2.5％的胰蛋白酶释放的细胞单层。一旦细胞是在溶液中，向烧瓶中的细胞培养液中加入10毫升的胰蛋白酶消化，骤冷。
- 钍E细胞悬浮液离心5分钟，并除去上清液。将细胞重新悬浮在1ml注入流动室的细胞培养基（含血清）。
- 将细胞悬浮液（0.5毫升，约50,000个细胞）被加载到一个注射器中，并注入流动室通过一个三通阀。
- 细胞被允许定居，并坚持到玻璃基板流开始前2小时。在细胞生长根据流的培养箱中在37℃，进行1〜5天，直到汇合。
1.3悬臂的制备和细胞压痕
- 无针尖AFM的悬臂（纳米世界，瑞士）在硝酸中清洗5分钟，并用氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）在蒸镀室官能。
- 5毫克/毫升（重量）NHS-磺基-LC-生物素的Hank缓冲盐溶液（HBSS）中制备的溶液。在悬臂被淹没在溶液中15分钟，以共轭门硅烷N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）化学。
- VEC技术细胞培养介质（包括血清）的20毫升培养12小时streptavadin珠用200μl的溶液是由无生物素培养基中。在珠，用磁铁从培养基中除去，并通过0.22μm的无菌过滤器过滤介质。
- 流动室除去从细胞培养皿中，并在37℃的无生物素培养基将细胞洗涤。
- 1微升2.4μm的珠粒涂有链霉抗生物素蛋白在1ml无生物素培养基中的储备溶液制备，并加入100微升的股票的细胞培养皿中。
- 链霉亲和素珠被拾起的悬臂通过登陆在玻璃表面上的胎圈，缩回旁边的前端，在胎圈定位在悬臂的先端，然后向下按压悬臂到胎圈和休息的几秒钟。
- 在悬臂的时间测量的灵敏度d的缩进到裸露的玻璃的区域和使用的曲线的斜率设置作为电压的函数的尖端偏转。
- 在悬臂的弹簧常数，然后计算热校准在MFP3D软件。
- 然后将校准悬臂用于缩进的样品，如在图2中示出。这些2.4微米珠提供了一个较大的接触面积，使与细胞表面的软糖萼层的机械性能，可以检测。该悬臂被定位在附近的细胞核的细胞到细胞里的前端用来设置上方约3微米，在细胞表面的悬臂高度和柔软的方法。该软件被设置为20个重复的凹槽7 nN的一个最大的力为1μm/秒的速率。约6秒之间经过连续接触。这是可能使用不同速率的压痕测试的糖复合物的时间依赖特性，虽然在这些初始实验中，只有一个单一的压痕率（1微米/秒）被使用。
2。压痕理论
到的弹性半空间与半径为R的球中的压痕可以描述采用Hertz理论缩进的力，F由下式给出：
其中δ是压痕深度和 E *是根据测试（ 图3）的材料的弹性模量降低。以一个无限刚性的压头撞击均匀的弹性半空间的情况下，E *是由下式给出：
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其中 E是弹性模量，ν是材料的泊松比。与聚合物薄膜的最近的工作已激发用于确定的模量和厚度的薄膜1的两个层模型的发展。我们应用此模型细胞生物学处理作为电池主体的表面上的均匀的薄的软膜糖萼。使用此模型中，该系统的模量的减少变为：
其中 ，E GC是的蛋白质复合物的弹性模量，E 细胞的细胞体的模量，P，Q和n是已经凭经验确定从聚合物中配合， 而 z是由下式给出的常数：
其中 t是的蛋白质复合物层的厚度。这些参数的示意图如图3所示。该模型已被证明是更严厉的基板1上的薄膜的弹性模量和厚度的确定一个准确的方法。这个方程可以使用，以适应从缩进到细胞得到的曲线，以确定的模量和厚度的内皮糖萼，如在图4中示出。
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Representative Results
在一个典型的实验中，从一个给定区域的细胞得到的20的力与距离曲线，通常在核周区域，靠近，但不包括在核（〜2μm的范围内）。曲线，考虑到对准测量的持续时间的任何样品漂移，然后取平均值，以除去悬臂噪音，如在图4中示出。曲线进行了分析和合适的被开发用于确定的弹性模量和厚度的薄的聚合物膜1的两个层模型。从拟合的曲线的25个细胞中，我们已经确定，管腔层的弹性模量是0.7±0.5千帕，厚度为380±50nm的，如在图5中示出。细胞体的弹性模量为16±6千帕。这些值是在良好的协议与以前的测量的细胞体的模量和厚度的糖萼5星，8。
图1。我们的细胞培养装置，整个腔室流动靠重力从贮存器驱动的A至C。细胞铺板在封闭的腔室B，用磁铁的一个封闭的细胞培养皿的表面为庇护原子力显微镜（庇护，圣巴巴拉CA举行）。三通阀B上使我们停止流通。有机硅垫片创建了一个流道6.4毫米宽，19毫米长，0.4毫米高。封闭的腔室B容易地除去和闭孔菜直接移动到AFM用于实验。通过泵送流体从储存器C通过A用蠕动泵（未示出）保持的高度差D。整个组件被放置在温箱的细胞培养持续时间。
图2：图片的悬臂了2.4微米珠（箭头）通过生物素 - 链霉亲和连杆连接。右：流量下生长的血管内皮细胞单层。
图3。几何形状的胎圈半径 R缩进的距离δ进入细胞的相互作用。糖复合物，显示在绿色，具有的 E GC模量和厚度 t。细胞体的模数E 细胞 。由胎圈到细胞，F，所施加的力的测量的力相对于距离的曲线，如图4中所示，得到的。
图4。入细胞的压痕与距离的关系曲线的平均力被绘制为红色。一个单独的压痕中的插图所示。高亮在图像中的接触点，其中悬臂第一腔表面接触，腔的层，其中的曲线的斜率是占主导地位的糖萼由刚度，和细胞体，斜率是主要的功能的细胞体模量。从两个层压痕理论的拟合曲线中示出蓝色，黑色虚线所示的简单的赫兹弹性半空间模型的拟合。有四个自由参数中的两个层的配合。这特别适合确定的值分别为：细胞模量= 15.9千帕，管腔层模量= 0.33千帕，管腔层厚度= 420 nm处。第四嵌合参数是与糖复合物的接触点。到细胞表面的x轴的原点相对定位是任意的。 点击这里查看大图 。
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图5。的属性从曲线拟合的25个细胞。左：E GC的 直方图被确定为0.7±0.5千帕。右：的糖复合物的厚度被确定为380±50nm的。
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Discussion
我们使用从两层模型和Hertz理论建模的循环血液中的白细胞与血管内皮壁的相互作用的计算出的值。我们计算一个微绒毛上与10 PN负载下的直径为50nm的白细胞会缩进约150nm到糖萼，只有一小部分的总厚度。这表明，糖复合物，与如在本实验中测得的性能，是一种显着的细胞 - 细胞相互作用的障碍，并可以是一个大的空间位阻的细胞期间必须克服的白细胞粘附的粘附级联期间。
在这里所使用的模型，我们近似糖萼为各向同性的弹性结构。虽然我们不知道任何机械测量以指示这是没有的情况下，有关的糖复合物的分子结构的什么是已知的建议，这是有可能过于简化。事实上，糖萼是一个复杂和多样结构的表面上的细胞。它由导向的分子结构，缺乏明确定义的外边界，和可能变浓接近细胞表面。因此，虽然这里使用的弹性模型两层提供循环的细胞观察到的糖复合物的相对刚度洞察，今后的研究可以探讨替代机械描述信息，其可能的各向异性和在厚度方向上的变化的密度，可能占。它也有可能是糖萼是不统一的细胞表面的不同区域之间。这将不会是显而易见的，从本数据集，因为所有的数据在这里被在细胞核周围的小区的中央区域。
糖复合物也可以呈现在这项研究中，没有被调查的粘弹性能。已经观察到，在静态条件下，在毛细管中的红血细胞可以完全压缩的糖萼，Droid发现者循环红血细胞不10。由静态红细胞产生的力可能是非常小的（〜3-10帕）。这表明糖复合物可能是很软的反应慢压缩在压缩速度较快，但明显更严厉的。我们的测量结果进行缩进1微米/秒的速率在模拟的刚度可能会遇到一个循环细胞，但需要进一步开展调查过程中随时间变化的特性。
AFM压痕已用来直接测量在活细胞中的内皮糖萼的模量和厚度。测量结果表明，糖复合物可以是一个重大障碍，细胞与细胞间的接触和粘附，并可能作为调节粘附级联在炎症过程中的一个关键因素。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
笔者想感谢埃琳娜Lomakina，理查德·Bauserman，玛格丽特杨曼，吉Vaknin，杰西卡·斯奈德，克里斯Striemer，纳库尔Nataraj，红栗橱嗯的，TEJAS Khire，和Eric林对他们的援助，这个项目的。该项目是由美国国立卫生研究院PO1 HL 018208。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy's Medium | Gibco | 16600-082 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | SH30070 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Vec Technologies | MCDB-131 | |
| Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Vec Technologies | PHUVEC/T-25 | |
| Sulfuric Acid | JT Baker | 9681-02 | |
| Hydrogen Peroxide | VWR | BDH3742-1 | |
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Aldrich | 440140-100ML | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | BDH8999-4 | |
| Trypsin | Cellgro | 25-054-C1 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
| Streptavadin beads | Dynabeads | 112.06D | |
| MFP-3D AFM | Asylum Research | ||
| Tipless Cantilevers | Nanoworld | ARROW-TL1-50 | |
| Silhouette SD | Quickutz | Silhouette-SD | |
| Silicone Rubber | Stockwell Elastomerics | SE50-RS | |
| 30 ml Syringes | Benton Dickinson | 309650 | |
| 18 gauge needles | Benton Dickinson | 305196 | |
| Extension Sets | Hospira | 4429-48 | |
| 4 way valves | Teleflex | W21372 | |
| Male/Female Port Caps | Smith’s Medical | MX491B | |
| Peristaltic Pump | Watson-Marlow | 401U/D | |
| Peristaltic Tubing | Watson-Marlow | 903.0016.016 | |
| sterile filters | Pall Life Science | 4652 |
References
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