Summary
내피 glycocalyx의 기계적 특성은 AFM의 cantilevers에 마이크론 크기의 영역을 사용하여 들여 쓰기에 의해 측정되었다. 내피 세포는 glycocalyx 식을 유도하기 위해 생리 흐름 조건에서 사용자 정의 챔버에 배양 하였다. 데이터는 glycocalyx 두께와 탄성 계수를 결정하기 위해 박막 모델을 사용 분석 하였다.
Abstract
백혈구 및 백혈구 캡처하는 동안 혈관 벽의 상호 작용에 대한 우리의 이해는 내피 표면 층의 기계적 성질의 불완전한 이해에 의해 제한됩니다. 이것은 백혈구의 접착 분자가 표면 지형 3 상대적으로 비 균일하게 분포되어 알려져 있습니다, 그 지형이 다른 표면 9 접착제 결합 형성을 제한, 그 생리 접촉 힘 (≈ 5.0 - microvillus 당 10.0 PN)는 등으로 microvilli을 압축 할 수 있습니다 반대 표면 3, 7 분자의 접근성을 증가 자신의 휴식 길이의 세 번째로 조금. 우리는 두 계층 구조, 상대적으로 강성 전지 본체뿐만 아니라 glycocalyx, luminal 표면 6 부드러운 보호 설탕 코팅으로 내피를 고려합니다. 그것은 glycocalyx는 내피 표면 4 백혈구의 접착을 줄이기 위해 장벽의 역할을 할 수 것으로 나타되었습니다.이 보고서에서 우리는 내피 기계 강성이 결합 형성에 영향을 미칠 수 방법을 이해하기 위해 내피 표면의 deformability를 해결하기 시작합니다. 정적 문화에 성장 내피 세포는 강력한 glycocalyx을 표현할 수 없지만, 생리 흐름 조건에서 성장 세포가 생체 2 관찰 대략 glycocalyx에 시작한다. 내피 세포 본체의 계수는 약 5-20 kPa 5로 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 측정되었습니다. glycocalyx의 두께와 구조는 전자 현미경 8을 사용 연구되었으며, glycocalyx의 계수는 간접적 인 방법을 사용하여 추정되었지만, 우리의 지식으로, 살아있는 세포에 glycocalyx 계수의 직접 측정 대한 출판 보고서가 없었습니다 . 본 연구에서는, 우리는 mA 자신의 glycocalyx 표현을 극대화 할 조건에서 배양 된 세포에 새로운 AFM 프로브로 만든 들여 쓰기 실험을 제시내피 glycocalyx의 계수와 두께 KE 직접 측정.
Protocol
1. 방법
1.1 셀 흐름 상공 회의소
세포가 1.0 파 (10 dyn / cm 2)의 전단에 따라 성장 후 정신 병원 MFP3D AFM (산타 바바라, CA)에 직접 전달 될 수 있도록 그림 1에 표시된 흐름 챔버는, 건설되었습니다.
- 15 분에 한 후 증류수로를 세척 : 흐름 챔버 먼저 피라냐 솔루션 (H 2 O 2 3시 1분 H 2 SO 4) 유리 슬라이드를 청소하여 실험을 준비했습니다. 그들은 그 다음에 구운 된 건조하고 진공 증착 챔버에서 실란 aminopropyl의 triethoxy (APTES)을 코팅.
- 실리콘 가스켓은 실루엣 SD 절단 도구를 사용하여 절단되었습니다. 이것은 우리가 잘게 세포의 성장 동안 유량 및 전단 응력의 제어를위한 흐름 챔버 크기를 제어 할 수있었습니다. 일반적으로 채널은 0.4 mm의 실리콘의 시트에서 긴 19mm에 폭 6.4 mm를 잘라되었습니다. 장군에 필요한 유량테 1.0 파 (10 dyn / cm 2)의 전단 응력은 방정식과 사각형 채널에 판상 흐름을 가정 계산됩니다 :
Q는 유량이고, τ는 전단 응력이며, μ는 매체의 점도이다 1.0 MPA (0.01 dyn * 초 / cm 2)로 여기 가정, H는 높이이며, w는 유동 챔버의 폭입니다 .
- 흐름 챔버의 상단 부분은 세포 배양 접시에있는 가스켓과 정렬과 자기 링으로 고정되었습니다. 조립체는 살균을 위해 이소 프로필 알코올 (IPA)로 가득했다.
- 전체 흐름 시스템은 조립했습니다. 세포 배양 접시의 흐름 포트는 세 방향 밸브에 연결되었습니다. 밸브는 30 ML의 주사기를 엽니 다 연결되었습니다s입니다. IPA 그 다음 4퍼센트 태아 송아지 혈청 (FCS)와 맥코이의 중간의 30 ML에 세척 된 시스템을 통해 플러시되었습니다. 이 시스템은 다음 VEC 기술 세포의 성장 매체 20 ML로 가득했다. 표지는 주사기의 정상에 위치했다. 캐치 저장소의 주사기 캡 피드 저수지로 매체를 이동하는 장소에서 바늘했다. 멸균 0.2 μm 필터는 시스템의 오염을 방지하기 위해 덮개의 공기 유입구에 부착되었다. 흐름 챔버는 세포 심는 준비했습니다.
1.2 세포 배양
- 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC의) 성장 매체는 VEC 기술에서 구입 (Rensselaer, NY)과 T25 플라스크에 합류로 성장했다.
- 성장 매체는 술병과 2.5 %의 트립신 2 ML을 발표 세포 monolayer에서 제거되었습니다. 세포가 솔루션에 있던되면 trypsinization은 플라스크에 세포 배양 매체의 10 ML를 추가로 침묵했다.
- 일전자 세포 현탁액은 5 분 동안 centrifuged되었고 표면에 뜨는이 삭제되었습니다. 세포는 유동 챔버 내로 분사에 대한 세포 배양 매체 (혈청을 포함) 1 ML에 resuspended되었습니다.
- 세포 현탁액은 (0.5 ML ~ 50,000 세포) 주사기에로드하고 세 방향 밸브를 통해 흐름 챔버에 주입했다.
- 세포는 흐름이 시작되기 전에 2 시간에 정착하고 유리 기판을 준수 할 수 있었다. 세포는 37 보육의 흐름에 따라 성장했습니다 ° 1-5일에 대한 C 합류 때까지.
1.3 캔틸레버 준비 및 셀 들여 쓰기
- Tipless AFM의 cantilevers (NanoWorld, 스위스)은 5 분에 질산에 세척하고 기상 증착 챔버에서 실란 aminopropyl의 triethoxy (APTES)와 기능화되었습니다.
- 5 행크의 버퍼 소금 솔루션에 (HBSS) 준비되었습니다 무게 NHS-sulfo-LC-비오틴의 MG / ML의 솔루션입니다. cantilevers는 conju 15 분 동안 솔루션에 잠겨 있었다게이트 N-Hydroxysuccinimide (NHS) 화학으로 실란.
- 비오틴 무료 매체의 솔루션은 12 시간에 streptavadin 구슬 200 μl와 VEC 기술 세포 배양 매체 (혈청 포함)의 20 ML을 잠복기에 의해 만들어졌습니다. 구슬은 자석 매체에서 제거되었고 매체가 0.22 μm 살균 필터를 통해 필터링되었습니다.
- 흐름 챔버는 세포 배양 접시에서 제거되었고 셀은 37 ° C 비오틴 - 무료 매체에 세척했다.
- 비오틴 무료 매체 1 ML에 streptavidin으로 코팅 2.4 μm 구슬 1 μl의 주식 솔루션을 준비했고, 주식의 100 μl은 세포 배양 접시에 추가되었습니다.
- Streptavidin 비즈는 구슬, retracting 옆에있는 유리 표면에 팁을 착륙 비드 위에 캔틸레버의 꼭대기를 위치 한 다음 구슬과에 휴식 몇 초에 캔틸레버를 눌러 캔틸레버를 포착했다.
- 캔틸레버의 감도 측정했습니다맨 유리의 지역에 압입 및 전압의 함수로 팁 편향을 설정하는 곡선의 기울기를 사용하여 D.
- 캔틸레버의 봄 상수 다음 MFP3D 소프트웨어의 열 보정으로부터 계산되었다.
- 그림 2와 같이 보정 된 캔틸레버는 다음 샘플을 들여 쓰기하는 데 사용되었다. 이 2.4 μm의 구슬은 부드러운 glycocalyx 층의 기계적 성질이 감지 할 수 있도록 세포 표면에 큰 접촉 면적을 제공합니다. 캔틸레버는 세포 핵 및 세포로 끝이 약 3 μm 세포 표면 위의 캔틸레버 높이를 설정하는 데 사용되었다 부드러운 접근 방식 근처에있는 셀 위에 위치했다. 소프트웨어는 7 NN의 최대 힘 1 μm / 초의 속도로 20 반복 들여 쓰기로 설정되었습니다. 약 6 초는 연속 연락처 사이에 경과. 그것은 glycocalyx의 시간에 따라 달라 속성 테스트 들여 쓰기의 다양한 속도를 사용할 수 있지만이 초기에 실험은 단일 들여 쓰기 속도는 (1 μm / 초)가 사용되었습니다.
2. 들여 쓰기 이론
반경 R의 영역과 반 공간 탄성에 들여 쓰기는 들여 쓰기의 힘, F가 방정식에 의해 주어집니다 헤르츠 이론을 사용하여 설명 될 수있다 :
δ는 어디 들여 쓰기 깊이와 E *는 테스트중인 자료 (그림 3)의 감소 계수입니다. 균일 한 탄성 반 공간을 impinging 끝도없이 치열한 indenter의 경우, E의 *는 방정식에 의해 주어집니다 :
3/50163eq3.jpg "/>
E가 어디 탄성 계수와 ν는 재료의 푸 아송 비율입니다. 폴리머 필름과 최근의 작업은 박막 1의 계수와 두께를 결정하기위한 두 레이어 모델의 개발에 영감을하고 있습니다. 우리는 전지 본체의 표면에 균일 한 박막 부드러운 필름 glycocalyx 치료하여 세포 생물학에이 모델을 적용하고 있습니다. 이 모델을 사용하여 시스템의 감소 계수가된다 :
E GC는 glycocalyx의 계수이고, E 셀의 전지 본체의 계수이며, P, Q와 N은 경험적으로 폴리머에 맞는에서 결정되었으며, 및 z는 방정식에 의해 주어집니다 상수 :
t는 glycocalyx 층의 두께입니다. 이러한 매개 변수의 개략적 인은 그림 3에 표시됩니다. 모델은 강성 기판 (1)에 박막의 계수와 두께를 결정하는 정확한 방법 표시되었습니다. 그림 4와 같이이 방정식은, 내피 glycocalyx의 계수와 두께를 결정하는 셀에 들여 쓰기에서 얻은 곡선에 맞게 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
전형적인 실험에서, 20 힘 - 대 - 거리 곡선은 근처 있지만 핵 (~ 2 μm 이내)에, 일반적으로 perinuclear 지역에서, 세포의 특정 지역에서 얻었다. 곡선은 측정 기간 동안 모든 샘플 드리프트에 대한 계정에 정렬 한 후 그림 4에 도시 된 바와 같이, 캔틸레버 노이즈를 제거하는 평균했습니다. 곡선 분석하고 얇은 폴리머 필름 (1)의 계수와 두께를 결정하기 위해 개발되었습니다 두 개의 레이어 모델에 맞게되었습니다. 25 세포의 곡선 맞게에서, 우리는 luminal 층의 계수가 0.7 ± 0.5 kPa이며, 그림 5와 같이 두께가, 380 ± 50 nm의 것으로 판정되었습니다. 전지 본체의 계수는 16 ± 6 kPa입니다. 이 값은 전지 본체와 glycocalyx 5, 8의 두께의 계수의 이전 측정과 좋은 계약입니다.
1 그림. 우리의 세포 배양 장치. 챔버에서 흐름은은 C. 셀에 정신 병원 AFM을위한 폐쇄 셀 요리의 표면 (정신 병원, 산타 바바라 CA에 자석으로 개최 폐쇄 챔버 B에 도금 된 저수지가 중력에 의해 구동되었다 ). B의 세 방향 밸브는 우리가 흐름을 중지 할 수있었습니다. 실리콘 가스켓은 높은 0.4 mm로 길이 19mm에 의해 다양한 유동 채널 6.4 mm를 만들었습니다. 폐쇄 챔버 B는 쉽게 제거 폐쇄 셀 요리 실험에 대한 AFM에 직접 옮겼습니다. 높이 차이 D는 연동 운동의 펌프 (미도시)과 저수지 C에서 A까지 유체를 펌핑에 의해 유지되었다. 전체 조립체는 세포 배양 기간 동안 인큐베이터에 배치되었습니다.
그림 2 왼쪽 :. 2.4과 캔틸레버의 이미지μm 비드 (화살표)는 비오틴 - streptavidin의 연동에 의해 부착. 오른쪽 : 흐름에 따라 성장 HUVECs의 Monolayer.
그림 3. 셀에 거리 δ 들여 쓰기 반경 R의 구슬의 상호 작용의 기하학이. 녹색으로 표시된 glycocalyx는 E GC의 계수와 두께 t가 있습니다. 전지 본체는 계수 E 셀이 있습니다. 셀, F,에 구슬이 적용 힘이 측정되며, 그림 4에 표시된 힘 대 거리 곡선은, 얻어진다.
그림 4. 셀에 들여 쓰기를위한 거리 곡선 대 평균 힘이 빨간색으로 도시된다. 개인 들여 쓰기는 삽입에 표시됩니다. 강조 슬로프는 주로 세포의 기능입니다 이미지에 캔틸레버 먼저 luminal 표면을 만질 접점, luminal 층, 곡선의 기울기가 glycocalyx의 강성에 의해 지배되고, 전지 본체는입니다 몸 계수. 두 레이어 들여 쓰기 이론에서 완비 된 곡선은 파란색으로 표시되며, 탄성 반 공간에 대한 간단한 헤르츠 모델에 대한 적합은 점선 검은 선으로 표시됩니다. 두 레이어 맞게 네 개의 무료 매개 변수가 발생했습니다. 특정 맞춤에 대한 결정 값은 있었다 : 세포 계수 = 15.9 kPa, luminal 층 계수 = 0.33 kPa, 그리고 luminal 층의 두께 = 420 nm의. 네 번째 완비 된 매개 변수는 glycocalyx와 상담 업무를 담당하고 있습니다. 세포 표면에 X-축 원산지 상대의 위치는 임의입니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 5. . 곡선 맞게 25 세포의 속성 왼쪽의 Histograms : E GC는 0.7 ± 0.5 kPa로 결정했다. 오른쪽 : glycocalyx의 두께가 380 ± 50 nm의 것으로 확인되었다.
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Discussion
우리는 두 레이어 모델과 내피 벽에 혈액에 순환 백혈구의 상호 작용을 모델링 할 수 헤르츠 이론에서 계산 값을 사용했습니다. 우리는 10 PN 부하에 따라 50 nm의 직경이 백혈구에 microvillus가 glycocalyx에 약 150 nm의 들여 쓰기 것이라는 총 두께의 일부만 계산했습니다. 이이 실험에서 측정 된 특성을 가진 glycocalyx은, 세포 세포의 상호 작용에 중요한 장벽이며 세포가 백혈구 유착 동안 부착 캐스케이드 동안 극복해야 큰 steric 방해가 될 수 있음을 나타냅니다.
모델에서 등방성 탄성 구조와 glycocalyx을 우리가 대략 여기 사용됩니다. 우리가 표시 할 수있는 기계 측정 모르고 있지만이 경우하지 않습니다, 무슨 glycocalyx의 분자 구조에 대해 알려진 것은이 가능성이 과잉 단순화하는 것이 좋습니다. 사실, glycocalyx은 복잡하고 다양세포의 표면에 구조. 그것은 지향 분자 구조로 구성되어, 잘 정의 된 외부 경계를 부족하고, 가능성이 세포 표면에 가까운 밀도가됩니다. 여기에 사용 된 두 층 탄성 모델은 순환 세포에 의해 관찰 glycocalyx의 상대 강성에 대한 통찰력을 제공하는 동안 따라서, 미래의 연구는 가능한 이방성 및 두께 방향으로 변화 밀도를 차지 사용할 수있는 기계 설명을 탐험 수 있습니다. 이 glycocalyx는 세포 표면의 여러 지역에 걸쳐 균일하지 수도 있습니다. 여기에 제시된 모든 데이터가 핵 주위의 세포의 중심 지역에서 촬영했기 때문에이 설정 한 현재의 데이터에서 분명 없었을 것입니다.
glycocalyx 또한이 연구에서 조사되지 않은 점탄성 특성을 나타낼 수 있습니다. 그것은 정적 조건 하에서, 모세 혈관에서 적혈구가 완전히 어딨는지 순환 glycocalyx를 압축 할 수있는 관찰되었습니다적혈구는 10하지 않습니다. 정적 붉은 세포에 의해 생성 된 힘은 (~ 3-10 PA) 매우 작은 될 가능성이 있습니다. 이 glycocalyx이 느린 압축에 대한 응답으로 매우 부드러운 있지만, 빠른 압축시 상당히 엄격한 할 수 있습니다 나타냅니다. 우리 측정은 순환 셀 발생할 수 있습니다 강성을 시뮬레이션 한 μm / 초의 들여 쓰기 속도로 수행하지만, 더 진행 시간에 따라 달라 속성을 조사하기 위해 노력했다.
AFM의 들여 쓰기 직접 생활 세포에서 내피 glycocalyx의 계수와 두께를 측정하는 데 사용되었습니다. 측정 glycocalyx 셀 세포 연락처 및 접착에 상당한 장벽과 가능성이 염증 동안 접착 층계를 조절하는 주요 요소 역할을 할 수 있음을 나타냅니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는이 프로젝트와의 도움을 엘레나 Lomakina, 리처드 Bauserman, 마가렛 젊은, 셰이 Vaknin, 제시카 스나이더, 크리스 Striemer, Nakul Nataraj, 숙취 리 정, Tejas Khire, 그리고 에릭 램을 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIH # PO1 HL 018,208로 운영되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy's Medium | Gibco | 16600-082 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | SH30070 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Vec Technologies | MCDB-131 | |
| Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Vec Technologies | PHUVEC/T-25 | |
| Sulfuric Acid | JT Baker | 9681-02 | |
| Hydrogen Peroxide | VWR | BDH3742-1 | |
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Aldrich | 440140-100ML | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | BDH8999-4 | |
| Trypsin | Cellgro | 25-054-C1 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
| Streptavadin beads | Dynabeads | 112.06D | |
| MFP-3D AFM | Asylum Research | ||
| Tipless Cantilevers | Nanoworld | ARROW-TL1-50 | |
| Silhouette SD | Quickutz | Silhouette-SD | |
| Silicone Rubber | Stockwell Elastomerics | SE50-RS | |
| 30 ml Syringes | Benton Dickinson | 309650 | |
| 18 gauge needles | Benton Dickinson | 305196 | |
| Extension Sets | Hospira | 4429-48 | |
| 4 way valves | Teleflex | W21372 | |
| Male/Female Port Caps | Smith’s Medical | MX491B | |
| Peristaltic Pump | Watson-Marlow | 401U/D | |
| Peristaltic Tubing | Watson-Marlow | 903.0016.016 | |
| sterile filters | Pall Life Science | 4652 |
References
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