Quantificar as propriedades mecânicas do Glicocálix endotelial com Microscopia de Força Atômica

Summary

As características mecânicas do glicocálice endotelial foi medida através da indentação utilizando esferas micronizadas em cantilevers de AFM. As células endoteliais foram cultivadas numa câmara de costume em condições de fluxo fisiológicas para induzir a expressão de glicocálice. Os dados foram analisados ​​utilizando um modelo de película fina, para determinar a espessura e módulo de glicocálice.

Abstract

Nossa compreensão da interacção de leucócitos e da parede do vaso durante a captura de leucócitos é limitada por uma compreensão incompleta das propriedades mecânicas da camada de superfície endotelial. Sabe-se que as moléculas de adesão nos leucócitos estão distribuídos de maneira não uniforme em relação à superfície topografia ^3, que a topografia limita a formação da ligação adesiva com superfícies de outros ^9, e que as forças de contacto fisiológicas (≈ 5,0-10,0 pN por microvilosidades) pode comprimir os microvilos como menos de um terço do seu comprimento de repouso, o aumento da acessibilidade das moléculas para a superfície oposta ^{3, 7.} Consideramos que o endotélio como uma estrutura de duas camadas, o corpo da célula, relativamente rígida, mais o glicocálice, um revestimento de açúcar mole protectora na superfície luminal ^6. Tem sido demonstrado que o glicocálice pode actuar como uma barreira para reduzir a adesão de leucócitos ao endotélio de superfície ^4.Neste relatório, nós começamos a abordar a deformabilidade de superfícies endoteliais para entender como a rigidez mecânica endotelial pode afetar a formação de vínculo. As células endoteliais em cultura estática não expressam uma glicocálice robusto, mas as células cultivadas em condições de fluxo fisiológicas começam a aproximar o glicocálice observada in vivo ^2. O módulo de elasticidade do corpo de célula endotelial foi medida através de microscopia de força atómica (AFM) ser aproximadamente de 5 a 20 kPa ^5. A espessura e estrutura do glicocálice foram estudadas utilizando microscopia electrónica de ^8, e o módulo de elasticidade do glicocálice foi aproximada usando métodos indirectos, mas o nosso conhecimento, não existem relatos na literatura de uma medição directa do módulo glicocálice em células vivas . No presente estudo, nós apresentamos experiências feitas com um recuo AFM novel sonda em células que foram cultivadas em condições de maximizar a sua expressão glicocálice de maas medições directas ke do módulo e da espessura do glicocálice endotelial.

Protocol

1. Métodos

Câmara de caudal 1,1 Célula

A câmara de fluxo, mostrado na Figura 1, foi construído de modo a que as células podem ser cultivadas sob um corte de 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ e, em seguida, transferido directamente para uma Asylum MFP3D AFM (Santa Barbara, CA).

1. A câmara de fluxo foi preparado para o ensaio, em primeiro lugar a limpeza das lâminas de vidro, em solução piranha (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ durante 15 min e, em seguida, lavando-as com água destilada. Eles foram então cozidos a seco e revestidos com aminopropil-trietoxi-silano (APTES), numa câmara de deposição de vácuo.
2. A junta de silicone foi cortada utilizando uma ferramenta de corte Silhouette SD. Isto permitiu-nos controlar com precisão as dimensões de fluxo da câmara de controlo da taxa de fluxo e tensão de cisalhamento durante o crescimento celular. Tipicamente, um canal foi cortado 6,4 milímetros de largura por 19 mm de comprimento a partir de uma folha de silicone de 0,4 mm. A vazão necessária para gêneroste uma tensão de corte de 1,0 Pa (10 dines / cm ²⁾ é calculada assumindo um fluxo laminar de um canal rectangular com a equação:

onde Q é a taxa de fluxo, τ é a tensão de cisalhamento, μ é a viscosidade do meio, aqui assumido como sendo 1,0 mPa (0,01 dines * s / cm ^2), h é a altura e w é a largura da câmara de fluxo .

3. A parte superior da câmara de fluxo alinhado com o vedante na placa de cultura de células e fixado com um anel magnético. O conjunto foi cheio com álcool isopropílico (IPA) para a esterilização.
4. O sistema de escoamento total foi montado. As portas de fluxo na placa de cultura de células foram conectados a válvulas de três vias. As válvulas foram conectados a abrir 30 ml seringas. IPA foi borbulhada através do sistema, o qual foi então lavado com 30 ml de meio de McCoy com 4% de soro fetal bovino (FCS). O sistema foi então cheio com 20 ml do meio de crescimento de células Vec Technologies. As tampas foram colocadas sobre as partes superiores das seringas. A captura do reservatório tampão tinha uma seringa de agulha no lugar para mover meio de volta para o reservatório de alimentação. Estéreis filtros de 0,2 mM foram ligados às entradas de ar nas tampas para evitar a contaminação do sistema. A câmara de fluxo foi então pronto para a sementeira de células.

1,2 Cultura de Células

1. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) quer do meio de cultura foram adquiridos a partir de Vec Technologies (Rensselaer, NY) e crescidas até à confluência num balão T25.
2. O meio de crescimento foi removido do balão e a monocamada de células libertadas com 2 ml de tripsina 2,5%. Uma vez que as células estavam em solução, a tripsinização foi interrompida com a adição de 10 ml de meio de cultura de células para o balão.
3. Thsuspensão de células e centrifugou-se durante 5 min e o sobrenadante foi removido. As células foram ressuspensas em 1 ml de meio de cultura celular (contendo soro) para injecção no interior da câmara de fluxo.
4. A suspensão de células (0,5 ml, ~ 50.000 células) foi carregada para uma seringa e injectado na câmara de fluxo através de uma válvula de três vias.
5. As células foram deixadas assentar e aderir ao substrato de vidro por 2 horas antes de o fluxo foi iniciado. As células foram cultivadas sob fluxo dentro de uma incubadora a 37 ° C durante 1 a 5 dias até à confluência.

1,3 Preparação Cantilever e recuo celular

1. Cantilever sem cantilevers de AFM (NanoWorld, Suíça) foram limpas em ácido nítrico durante 5 min e funcionalizado com aminopropil-trietoxi-silano (APTES), numa câmara de deposição de vapor.
2. Uma solução de 5 mg / ml, em peso, NHS-sulfo-LC-biotina, em solução salina tamponada de Hank (HBSS) foi preparado. As vigas foram submergidos na solução durante 15 min a conjuportão do silano com N-hidroxi-succinimida química (NHS).
3. Uma solução de meio livre de biotina foi feita por incubação de 20 ml de meio de cultura Vec Technologies celular (incluindo soro) com 200 ul de contas de streptavadin de 12 hr. As esferas foram removidas do meio de um íman e o meio foi filtrado através de um filtro de 0,22 ^ M estéril.
4. A câmara de fluxo foi removido da placa de cultura de células e as células foram lavadas em meio de 37 ° C a biotina livre.
5. Uma solução de reserva de 1 ul de 2,4 uM esferas revestidas com estreptavidina, em 1 ml de meio isento de biotina foi preparada, e 100 uL do stock foi adicionada à placa de cultura de células.
6. Contas de estreptavidina foram colhidos com o cantilever, enviando a ponta sobre a superfície do vidro ao lado de uma retracção, grânulo, o posicionamento da ponta do cantilever sobre o talão, e, em seguida, premir o cantilever para baixo sobre os segundos e talão de descanso para vários.
7. A sensibilidade do cantilever foi medidad, recuando para a região de vidro nu e usando o declive da curva para definir a deflexão da ponta como uma função da tensão.
8. A constante de mola do cantilever foi então calculada a partir de uma calibração térmica no software MFP3D.
9. O cantilever calibrado foi então utilizado para recuar as amostras, tal como mostrado na Figura 2. Estes grânulos de 2,4 uM oferecer uma maior área de contacto com a superfície da célula de modo a que as propriedades mecânicas da camada de glicocálice macio pode ser detectado. O cantilever foi colocada sobre uma célula de perto do núcleo celular e uma abordagem suave da ponta para a terceira célula foi usada para ajustar a altura do braço de suporte cerca de 3 um acima da superfície da célula. O software foi ajustado para 20 indentações repetidas a uma taxa de 1 um / seg a uma força máxima de 7 nN. Aproximadamente 6 segundos decorrido entre contactos sucessivos. É possível a utilização de diferentes taxas de recuo para testar as propriedades dependentes do tempo do glicocálice, embora nestes inicial experiências, apenas uma taxa única indentação (1 um / seg) foi usada.

2. Teoria recuo

Indentação em um meio-espaço elástico com uma esfera de raio R pode ser descrito utilizando teoria de Hertz, onde a força de recuo, F, é dada pela equação:

Onde δ é a profundidade de indentação e E * é o módulo de redução do material a ensaiar (Figura 3). No caso de um penetrador infinitamente rígida que colide um uniforme elástica semi-espaço, E * é dado pela equação:

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onde E é o módulo elástico e ν é o coeficiente de Poisson do material. Trabalhos recentes com películas de polímeros tem inspirado o desenvolvimento de um modelo de duas camadas para a determinação do módulo de elasticidade e espessura de filmes finos ^1. Estamos a aplicar este modelo para a biologia celular, tratando o glicocálice como uma película fina e uniforme macia na superfície do corpo da célula. Usando este modelo, o módulo de elasticidade reduzido do sistema torna-se:

Onde E é o módulo de _GC do glicocálice, _células E é o módulo de elasticidade do corpo da célula, P, Q e n são constantes que foram determinadas empiricamente a partir do polímero se encaixa, e z é dado pela equação:

Onde t é a espessura da camada de glicocálice. Um esquema destes parâmetros é mostrado na Figura 3. O modelo tem sido demonstrado ser um modo adequado para determinar o módulo de elasticidade e espessura de uma película fina no substrato mais rígido ^1. Esta equação pode ser usada para ajustar as curvas obtidas a partir de indentação em células para determinar o módulo de elasticidade e espessura da glicocálice endotelial, como mostrado na Figura 4.

Representative Results

Numa experiência típica, 20 força-vs-distância curvas foram obtidas a partir de uma dada região de célula, tipicamente na região perinuclear, próximo, mas não sobre, o núcleo (dentro de ~ ^ M 2). As curvas foram alinhados para levar em conta qualquer variação de amostra ao longo da duração da medição e, em seguida, em média, para remover o ruído cantilever, como mostrado na Figura 4. As curvas foram analisadas e se encaixam com o modelo de duas camadas que foi desenvolvido para determinar o módulo de elasticidade e espessura da fina de polímero filmes ^1. A partir das curvas de ataques de 25 células, foi determinado que o módulo de elasticidade da camada luminal é de 0,7 ± 0,5 kPa e a espessura é de 380 ± 50 nm, conforme mostrado na Figura 5. O módulo de elasticidade do corpo da célula é de 16 ± 6 kPa. Estes valores estão de acordo com as medições anteriores de o módulo do corpo celular e espessura do glicocálice ^{5, 8.}

Figura 1. O nosso dispositivo de cultura de células. Fluxo através da câmara foi impulsionada pela força da gravidade a partir de um reservatório de C. As células foram plaqueadas na câmara fechada B que foi realizado com ímans para a superfície de um prato de célula fechada por uma Asylum AFM (Asilo, Santa Barbara CA ). Válvulas de três vias em B nos permitiu parar o fluxo. Uma junta de vedação criado um fluxo de 6,4 milímetros de largura de canal de 19 mm de comprimento por 0,4 mm de altura. A câmara fechada B foi facilmente removido eo prato de célula fechada movido diretamente no AFM para a experimentação. A diferença de altura D foi mantida através de bombeamento de fluido do reservatório de C para A, com uma bomba peristáltica (não mostrada). O conjunto inteiro foi colocado em uma incubadora durante o período de cultura de células.

Figura 2 esquerda:. Imagem de um cantilever com um 2.4grânulo uM (seta) ligado por uma ligação biotina-estreptavidina. Direita: monocamada HUVECs cultivadas sob fluxo.

Figura 3. Geometria da interacção do grânulo de raio R, precedendo um δ distância para dentro da célula. O glicocálice, mostrados em verde, tem um módulo de E _GC e uma espessura t. O corpo celular tem uma _célula E módulo. A força aplicada pelo rebordo da célula, F, e é medido a curva de força em função da distância, mostrado na Figura 4, é obtida.

Figura 4. A força média de distância versus curva de uma reentrância em uma célula é representada a vermelho. Uma reentrância indivíduo é mostrada na inserção. Destaque na imagem é o ponto de contacto, em que o cantilever toca primeiro a superfície luminal, a camada de luminal, em que a inclinação da curva é dominada pela rigidez do glicocálice, e o corpo da célula, onde a inclinação é principalmente uma função da célula módulo do corpo. A curva ajustada da teoria de indentação de duas camadas é mostrado em azul, e o ajustamento para o modelo mais simples Hertz para um espaço de meia elástica é mostrado pela linha preta pontilhada. Havia quatro parâmetros livres nos ataques de duas camadas. Valores determinados por este ajuste especial foram: módulo de célula = 15,9 kPa, a camada luminal módulo = espessura da camada de 0,33 kPa e luminal = 420 nm. O quarto parâmetro é ajustado o ponto de contacto com o glicocálice. Posicionamento da origem relativa eixo-x para a superfície celular é arbitrária. Clique aqui para ver maior figura .

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Figura 5. Os histogramas das propriedades dos 25 células dos ataques de curva esquerda:. E _GC foi determinado como sendo 0,7 ± 0,5 kPa. Direita: A espessura do glicocálice foi determinada como sendo de 380 ± 50 nm.

Discussion

Foram utilizados os valores calculados a partir do modelo de duas camadas e teoria de Hertz para modelar a interacção de um dos leucócitos em circulação no sangue com a parede endotelial. Calculamos que um microvilosidades na leucócitos com um diâmetro de 50 nm sob uma carga de 10 iria pN travessão aproximadamente 150 nm para o glicocálice, apenas uma fracção da espessura total. Isto indica que o glicocálice, com propriedades como medidos nesta experiência, é uma barreira significativa para a interacção célula-célula e pode ser um impedimento estérico grande que as células têm de vencer durante a cascata de adesão durante a adesão de leucócitos.

No modelo utilizado aqui, o glycocalyx aproximada como uma estrutura isotrópico elástico. Enquanto não temos conhecimento de quaisquer medições mecânicas para indicar que este não é o caso, o que se sabe sobre a estrutura molecular do glicocálice sugere que isto é provavelmente uma simplificação excessiva. Na verdade, o glycocalyx é uma complexa e variadaestrutura sobre a superfície das células. É constituída por estruturas moleculares orientadas, carece de um limite bem definido exterior, e que provavelmente se torna mais denso perto da superfície da célula. Assim, enquanto que o modelo de duas camadas elástico usado aqui oferece uma visão sobre a rigidez relativa do glicocálice observado por células circulantes, estudos futuros podem explorar alternativas descrições mecânicas que podem ser responsáveis ​​pela sua anisotropia e possível variar a densidade na direcção da espessura. Também é possível que o glicocálice não é uniforme entre as diferentes regiões da superfície da célula. Isto não teria sido evidente a partir dos dados presentes definidos porque todos os dados apresentados aqui foram tomadas na região central da célula em torno do núcleo.

O glycocalyx podem também exibir propriedades viscoelásticas que não foram incluídos no estudo. Tem sido observado que, em condições estáticas, as células vermelhas do sangue nos capilares pode comprimir completamente o glicocálice, wheres circulanteAs células vermelhas do sangue não ^10. Forças geradas pela estáticas, as células vermelhas são susceptíveis de ser extremamente pequena (~ 3-10 Pa). Isto indica que o glicocálice pode ser muito macio, em resposta à compressão lento, mas significativamente mais rígido durante a compressão mais rápida. As medidas foram realizadas a taxas de recuo de 1 um / seg para simular a rigidez de uma célula de circulação pode encontrar, mas continuar a trabalhar para investigar as propriedades dependentes do tempo está em andamento.

Indentação AFM foi utilizado para medir directamente a espessura do módulo e do glicocálice endotelial em células vivas. As medições indicam que a glicocálice pode ser uma barreira significativa para o contacto célula-célula e adesão e, provavelmente, serve como um factor-chave na regulação da cascata de adesão durante a inflamação.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's Medium	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Endothelial Cell Growth Medium	Vec Technologies	MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid	JT Baker	9681-02
Hydrogen Peroxide	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Aldrich	440140-100ML
Isopropyl Alcohol	VWR	BDH8999-4
Trypsin	Cellgro	25-054-C1
Hank's Buffered Salt Solution	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
Streptavadin beads	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Tipless Cantilevers	Nanoworld	ARROW-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouette-SD
Silicone Rubber	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
30 ml Syringes	Benton Dickinson	309650
18 gauge needles	Benton Dickinson	305196
Extension Sets	Hospira	4429-48
4 way valves	Teleflex	W21372
Male/Female Port Caps	Smith’s Medical	MX491B
Peristaltic Pump	Watson-Marlow	401U/D
Peristaltic Tubing	Watson-Marlow	903.0016.016
sterile filters	Pall Life Science	4652