Kvantifisere mekaniske egenskaper endotel Glycocalyx med Atomic Force Microscopy

Summary

De mekaniske egenskapene til endotelial glycocalyx ble målt ved hjelp innrykk mikrometerstørrelse sfærer på AFM cantilevers. Endotelceller ble dyrket i en tilpasset kammer under fysiologiske strømningsforhold for å indusere glycocalyx uttrykk. Data ble analysert ved hjelp av en tynn film for å fastslå den glycocalyx tykkelse og modulus.

Abstract

Forståelsen av samspillet av leukocytter og karveggen under leukocytt fangst er begrenset av en ufullstendig forståelse av de mekaniske egenskapene til den endoteliske overflatelaget. Det er kjent at adhesjonsmolekyler på leukocytter distribueres ikke-jevnt i forhold til overflatetopografien ^3, begrenser at topografi klebende binding formasjon med andre overflater ^9, og at fysiologiske kontaktkrefter (≈ 5,0 til 10,0 per pN microvillus) kan komprimere microvilli til som lite som en tredjedel av deres hviler lengde, øker tilgjengeligheten av molekyler til den motsatte overflaten ^{3, 7.} Vi anser endotelet som en to-lags struktur, den relativt stive cellelegemét, pluss glycocalyx, en myk beskyttende sukker belegg på luminale flaten ^6. Det har blitt vist at glycocalyx kan virke som en barriere for å redusere adhesjon av leukocytter til endotel overflaten ^4.I denne rapporten begynner vi å ta opp deformasjon av endothelial overflater å forstå hvordan endothelial mekanisk stivhet kan påvirke bindingen formasjon. Endotelceller dyrket i statisk kultur ikke uttrykke en robust glycocalyx, men celler dyrket under fysiologiske strømningsforhold begynner å omtrentlige glycocalyx observert in vivo ^2. Modulus av endotelcelle kroppen har vært målt med atomic force mikroskopi (AFM) å være ca 5-20 kPa ^5. Tykkelsen og struktur glycocalyx har blitt studert ved hjelp av elektronmikroskopi ^8, og modulus av glycocalyx er omtrentlige ved bruk av indirekte metoder, men så vidt vi vet, har det ikke vært noen publiserte rapporter om en direkte måling av glycocalyx modulus i levende celler . I denne studien, presenterer vi innrykk eksperimenter gjort med en roman AFM sonde på celler som har blitt dyrket i forhold til å maksimere sin glycocalyx uttrykk til make direkte målinger av den modul og tykkelsen på endoteliale glycocalyx.

Protocol

1. Metoder

1.1 Cell Flow Chamber

En vannstrøms kammer, vist i figur 1, ble konstruert slik at celler kan dyrkes under en skjærkraft på 1,0 Pa (10 dyn / cm ^2), og deretter overføres direkte til et asyl MFP3D AFM (Santa Barbara, CA).

1. Flyten kammeret ble utarbeidet for forsøket ved først å rense glassplater i piranha løsning (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ i 15 minutter og deretter vaske dem med destillert vann. De ble deretter bakt til tørr og belagt med aminopropyltrietoksysilan (APTES) i et vakumdeponering kammer.
2. En silikonpakning ble kuttet med en Silhouette SD skjærende verktøy. Dette tillater oss å fint kontrollere strømningskammer dimensjoner for kontroll av strømningshastigheten og skjærspenning under cellevekst. Vanligvis ble en kanal kuttet 6,4 mm bredt og 19 mm lang fra et ark av 0,4 mm silikon. Strømningshastigheten nødvendig slekterte a skjærspenning på 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ blir beregnet ved å anta laminærstrømning i en rektangulær kanal med ligningen:

hvor Q er strømningshastigheten, er τ skjærspenningen er μ viskositeten av mediet, antas her å være 1,0 mPa (0,01 dyn * sek / cm ^2), h er høyden og w er bredden av strømningskammeret .

3. Den øverste del av strømningskammeret ble justert med pakningen i cellekultur parabolen og sikret med en magnetisk ring. Sammenstillingen var fylt med isopropylalkohol (IPA) for sterilisering.
4. Den fulle flow system ble montert. De strømningsåpninger i cellekultur parabolen var tilknyttet treveisventiler. Ventilene ble i forbindelse med åpne 30 ml sprøytes. IPA ble spylt gjennom systemet, som deretter ble vasket med 30 ml McCoys medium med 4% kalvefosterserum (FCS). Systemet ble deretter fylt med 20 ml av Vec Technologies cellevekst medium. Deksler ble plassert på toppen av sprøyter. Fangsten reservoaret sprøytehetten hadde en nål på plass for å flytte medium rygg til foret reservoaret. Sterile 0,2 mikrometer filter ble festet til luftinntakene i deksler for å hindre forurensning av systemet. Flyten kammeret var deretter klar for celle såing.

1.2 Cell Culture

1. Menneskelige umbilical vein endotelceller (HUVEC er) og vekstmedium ble kjøpt fra Vec Technologies (Rensselaer, NY) og vokst til samløpet i en T25 Flask.
2. Vekstmediet ble fjernet fra kolben og monolaget av celler utgitt med 2 ml 2,5% trypsin. Når cellene var i løsning, ble trypsinisering undertrykket med tilsetning av 10 ml cellekulturmedium til kolben.
3. The cellesuspensjon ble sentrifugert i 5 min, og supernatanten ble fjernet. Cellene ble resuspendert i 1 ml av cellekulturmedium (inneholdende serum) for injeksjon inn i strømningskammeret.
4. Cellesuspensjonen (0,5 ml, ~ 50.000 celler) ble lastet inn i en sprøyte og injisert i strømningskammeret gjennom en tre-veis ventil.
5. Cellene ble tillatt å sedimentere, og holder seg til glass substrat i 2 timer før strømning ble startet. Cellene ble dyrket under strømning i en inkubator ved 37 ° C i 1 til 5 dager inntil sammenflytende.

1,3 Cantilever Forberedelse og Cell Innrykk

1. Tipless AFM cantilevers (nanoworld, Sveits) ble renset i salpetersyre i 5 min og funksjonalisert med aminopropyltrietoksysilan (APTES) i en damp deponering kammer.
2. En oppløsning på 5 mg / ml ved vekt NHS-sulfo-LC-biotin i Hanks bufret Salt Solution (HBSS) ble fremstilt. De cantilevers ble nedsenket i løsningen i 15 minutter til konjugertegate silan med N-hydroksysuksinimid (NHS) kjemi.
3. En oppløsning av biotin fritt medium ble gjort ved å inkubere 20 ml Vec Technologies cellekulturmedium (inkludert serum) med 200 ul streptavadin perler i 12 timer. Perlene ble fjernet fra mediet med en magnet, og mediet ble filtrert gjennom et 0,22 um sterilt filter.
4. Flyten kammeret ble fjernet fra cellekultur parabolen og cellene ble vasket i 37 ° C biotin-fritt medium.
5. En stamløsning av 1 ul 2,4 mikrometer perler belagt med streptavidin i 1 ml biotin fritt medium ble fremstilt, og 100 ul av bestanden er overført til cellekultur parabolen.
6. Streptavidin perler ble plukket opp med cantilever ved landing spissen på glassflaten ved siden av en perle, trekke, posisjonering toppen av cantilever over perle, og deretter trykke på cantilever ned på perle og hvile i noen sekunder.
7. Følsomheten til cantilever var tiltaketd ved å rykke bort på en region av Bart glass og bruke skråningen av kurven for å angi spissen defleksjon som en funksjon av spenning.
8. Fjæren konstant av cantilever ble deretter beregnet fra en termisk kalibrering i MFP3D programvaren.
9. Den kalibrerte cantilever ble deretter brukt til å rykke prøvene, som vist i figur 2. Disse 2,4 mikrometer perler tilby en større kontaktflate med celleoverflaten slik at de mekaniske egenskapene til den myke glycocalyx lag kan bli oppdaget. Cantilever ble plassert over en celle i nærheten cellekjernen og en myk tilnærming av spissen på cellen ble brukt til å sette cantilever høyde ca 3 mikrometer over celleoverflaten. Programvaren ble satt for 20 gjentatte fordypninger med en hastighet på 1 um / sek til en maksimal kraft på 7 nN. Omtrent 6 sek gått mellom suksessive kontakter. Det er mulig å bruke forskjellige priser av innrykk å teste for tidsavhengige egenskaper glycocalyx, selv i disse innledende eksperimenter, bare et enkelt innsnitt sats (1 um / sek) ble brukt.

2. Innrykk Theory

Innrykk til en elastisk halvdel-plass med en kule med radius R kan beskrives ved hjelp av Hertz teori hvor kraft innrykk, F, er gitt ved ligningen:

Der δ er innrykk og E * er den reduserte modulus av materialet under testen (figur 3). I tilfelle av en uendelig stiv indenter anslagsvinkel en ensartet elastisk halv-plass, er E * gitt ved ligningen:

3/50163eq3.jpg "/>
hvor E er elastisitetsmodulen og ν er Poisson forholdet av materialet. Nyere arbeid med polymer filmer har inspirert utviklingen av en to lags modell for bestemmelse av modul og tykkelsen av tynnfilmer ^1. Vi søker denne modellen til cellebiologi ved å behandle glycocalyx som en ensartet tynn myk film på overflaten av cellen kroppen. Ved hjelp av denne modellen, blir den reduserte modulus av systemet:

Hvor E _GC er modulus av glycocalyx, er E _celle modulus av cellen kroppen, P, Q og n er konstanter som er stemt empirisk bestemt fra polymeren passer, og z er gitt ved ligningen:

Hvor t er tykkelsen av glycocalyx laget. En skjematisk av disse parameterne er vist i figur 3.. Modellen har vist seg å være en nøyaktig måte å bestemme modulus og tykkelsen av en tynn film på substratet stivere ^1. Denne ligningen kan brukes for å passe kurvene oppnådd fra innrykket i celler for å bestemme modulus og tykkelsen på endotelisk glycocalyx, som vist i figur 4.

Representative Results

I et typisk eksperiment ble 20 kraft-vs-avstand kurver oppnådd fra en gitt region av cellen, vanligvis i perinuclear regionen, nær, men ikke på, kjernen (innenfor ~ 2 mm). Kurvene ble justert for å registrere eventuell prøven hviler over varigheten av målingen og så gjennomsnittsberegnet for å fjerne cantilever støy, som vist i figur 4. Kurvene ble analysert og passer med to lags modell som ble utviklet for å bestemme modulus og tykkelse tynn polymer filmer ^1. Fra anfall av kurvene i 25 celler, har vi fastslått at modulus av luminal laget er 0,7 ± 0,5 kPa og tykkelsen er 380 ± 50 nm, som vist i Figur 5. Modulus av cellen kroppen er 16 ± 6 kPa. Disse verdier er i god overensstemmelse med tidligere målinger av modulus av cellen kroppen og tykkelse ^{5 glycocalyx, 8.}

Figur 1. Vår cellekultur enhet. Flow tvers kammeret ble drevet ved hjelp av tyngdekraften fra reservoar A til C. Celler ble platet i det lukkede kammeret B som ble holdt med magneter på overflaten av en lukket celle parabolen for en asyl AFM (asyl, Santa Barbara CA ). Treveisventiler på B aktivert oss til å stoppe flyten. En silikonpakning opprettet en strømningskanal 6,4 mm bredt og 19 mm lange med 0,4 mm høy. Det lukkede kammeret B ble lett fjernet og lukkede celler parabolen flyttes direkte inn AFM for eksperimentering. Høydeforskjellen D ble opprettholdt ved å pumpe fluid fra reservoaret C til A med en peristaltisk pumpe (ikke vist). Hele sammenstillingen ble plassert i en inkubator for varigheten av cellekultur.

Figur 2 Venstre:. Bilde av en cantilever med en 2,4mikrometer perle (pil) festet med en biotin-streptavidin linkage. Høyre: Monolayer av HUVECs dyrket under flyt.

Figur 3. Geometri av samspillet vulsten radius R innrykk en avstand δ inn i cellen. Den glycocalyx, vist i grønt, har en modul av E _GC og en tykkelse t. Cellen kroppen har en modulus E _celle. Den kraft som utøves av vulsten til cellen, F, blir målt og den kraft versus avstand kurve, vist i figur 4, er oppnådd.

Figur 4. Den middelverdisignal kraft versus avstand kurve for en fordypning i en celle er plottet i rødt. En individuell innrykk er vist i den lille. Uthevet i bildet er kontaktpunktet der cantilever første berører luminale overflaten, luminal laget, hvor helningen på kurven er dominert av stivhet av glycocalyx, og cellen kroppen, hvor skråningen er hovedsakelig en funksjon av celle kroppen modulus. Montert kurve fra den to-lags innrykket teori er vist i blå, og passer for enklere Hertz modell for en elastisk todeler plass er vist ved den stiplede svarte linjen. Det var fire frie parametre i de to-lags passer. Verdier for denne passform var: celle modulus = 15,9 kPa, luminal lag modulus = 0,33 kPa, og luminal lagtykkelse = 420 nm. Den fjerde montert parameteren er kontaktpunkt med glycocalyx. Posisjonering av x-aksen i forhold til opprinnelse celleoverflaten er vilkårlig. Klikk her for å vise større figur .

5 "fo: content-width =" 5.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5.jpg "/>
Figur 5. Histogrammer av egenskapene 25 celler fra kurven passer Venstre:. E _GC ble bestemt til å være 0,7 ± 0,5 kPa. Høyre: Tykkelsen på glycocalyx ble bestemt å være 380 ± 50 nm.

Discussion

Vi brukte verdier beregnet fra to-lags modell og Hertz teori å modellere samspill av en leukocytt sirkulerer i blodet med den endoteliale vegg. Vi har beregnet at en microvillus på leukocytt med en diameter på 50 nm under en 10 pN belastning ville rykke ca 150 nm i glycocalyx, bare en brøkdel av den totale tykkelse. Dette indikerer at glycocalyx, med egenskaper målt i dette forsøk, er en betydelig hindring for celle-celle interaksjon og kan være en stor sterisk hindring som cellene må overvinne under adhesjonen kaskade under leukocyttadhesjon.

I modellen som er brukt her, vi tilnærmet glycocalyx som en isotrop elastisk struktur. Mens vi er uvitende om eventuelle mekaniske målinger for å indikere dette ikke er tilfelle, hva som er kjent om den molekylære strukturen av glycocalyx tyder på at dette er sannsynligvis en over-forenkling. Faktisk er glycocalyx et komplekst og variertstrukturen på overflaten av cellene. Det består av orienterte molekylære strukturer, mangler en veldefinert ytre grense, og sannsynligvis blir tettere nær celleoverflaten. Således, mens de to lag elastisk modell brukt her gir innsikt i den relative stivhet av glycocalyx observert av sirkulerende celler, kunne fremtidige studier utforske alternative mekaniske beskrivelser som kan forklare dens mulig anisotropi og varierende tetthet i tykkelsen retning. Det er også mulig at glycocalyx er ikke ensartet på tvers av ulike regioner av celleoverflaten. Dette ville ikke ha vært tydelig fra de foreliggende datasettet fordi alle data presentert her ble tatt i den sentrale regionen av cellen rundt kjernen.

Den glycocalyx kan også fremvise viskoelastiske egenskaper som ble ikke undersøkt i denne studien. Det har blitt observert at, under statiske betingelser, kan røde blodlegemer i kapillærene helt komprimere glycocalyx, wheres sirkulerenderøde blodlegemer ikke ^10. Kreftene som genereres av statiske røde celler er sannsynlig å være svært liten (~ 3-10 Pa). Dette indikerer glycocalyx kan være svært myk respons på treg komprimering, men betydelig stivere under raskere komprimering. Våre målinger ble utført ved innrykk priser av en mikrometer / sek for å simulere stivhet en sirkulerende celle kan møte, men ytterligere arbeid for å undersøke tidsavhengige egenskaper pågår.

AFM innrykk har blitt brukt til å direkte måle modulus og tykkelsen på endotelisk glycocalyx i levende celler. Målingene indikerer at glycocalyx kan være en betydelig hindring for celle-celle-kontakt og adhesjon og sannsynligvis tjener som en viktig faktor i å regulere adhesjonen kaskade ved betennelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's Medium	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Endothelial Cell Growth Medium	Vec Technologies	MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid	JT Baker	9681-02
Hydrogen Peroxide	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Aldrich	440140-100ML
Isopropyl Alcohol	VWR	BDH8999-4
Trypsin	Cellgro	25-054-C1
Hank's Buffered Salt Solution	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
Streptavadin beads	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Tipless Cantilevers	Nanoworld	ARROW-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouette-SD
Silicone Rubber	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
30 ml Syringes	Benton Dickinson	309650
18 gauge needles	Benton Dickinson	305196
Extension Sets	Hospira	4429-48
4 way valves	Teleflex	W21372
Male/Female Port Caps	Smith’s Medical	MX491B
Peristaltic Pump	Watson-Marlow	401U/D
Peristaltic Tubing	Watson-Marlow	903.0016.016
sterile filters	Pall Life Science	4652