Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

Summary

Les caractéristiques mécaniques du glycocalyx endothéliale ont été mesurées par indentation à l'aide des sphères micrométriques sur des cantilevers AFM. Les cellules endothéliales ont été cultivées dans une chambre de mesure dans des conditions physiologiques de flux pour induire l'expression glycocalyx. Les données ont été analysées en utilisant un modèle de film mince pour déterminer l'épaisseur et le module glycocalyx.

Abstract

Notre compréhension de l'interaction des leucocytes et la paroi de la cuve lors de la capture des leucocytes est limitée par une compréhension incomplète des propriétés mécaniques de la couche de surface endothéliale. Il est connu que les molécules d'adhésion sur les leucocytes sont répartis non uniformément par rapport à la topographie de surface ^3, que la topographie limite la formation de liaison adhésive avec d'autres surfaces ^9, et que les forces de contact physiologiques (≈ 5,0 à 10,0 pN par microvillosités) permet de compresser les microvillosités comme moins un tiers de leur longueur au repos, ce qui augmente l'accessibilité des molécules à la surface opposée ^{3, 7.} On considère que l'endothélium d'une structure à deux couches, le corps de cellule relativement rigide, plus la glycocalyx, un enrobage de sucre souple de protection sur la surface luminale ^6. Il a été démontré que le glycocalyx peut agir comme une barrière pour réduire l'adhérence des leucocytes à l'endothélium ⁴ Surface.Dans ce rapport, nous commençons à aborder la déformabilité des surfaces endothéliales de comprendre comment la rigidité mécanique endothéliale pourrait affecter la formation de liaisons. Les cellules endothéliales en culture statique n'expriment pas un glycocalyx robuste, mais les cellules cultivées dans des conditions d'écoulement physiologiques commencent à approcher le glycocalyx observée in vivo ^2. Le module de l'organisme des cellules endothéliales a été mesurée par microscopie à force atomique (AFM) à environ 5 à 20 kPa ^5. L'épaisseur et la structure du glycocalyx ont été étudiés en microscopie électronique à ^8, et le module du glycocalyx a été estimés à l'aide des méthodes indirectes, mais à notre connaissance, il n'y a pas eu de rapports publiés par une mesure directe du module glycocalyx des cellules vivantes . Dans cette étude, nous présentons des expériences faites avec indentation une nouvelle sonde AFM sur des cellules qui ont été cultivées dans des conditions de maximiser leur expression glycocalyx à mamesures directes de la ke module et de l'épaisseur de la glycocalyx endothéliale.

Protocol

1. Méthodes

1.1 Chambre débit cellulaire

Une chambre d'écoulement, illustré à la figure 1, a été construit de telle sorte que les cellules peuvent être cultivées sous un cisaillement de 1,0 Pa (10 dynes / cm ^2), puis transféré directement à un asile MFP3D AFM (Santa Barbara, CA).

1. La chambre de circulation a été préparé pour l'expérience d'abord nettoyer les lames de verre dans une solution piranha (3:1 H ₂ SO ₄ H ₂ O ₂₎ pendant 15 min, puis les laver avec de l'eau distillée. Ils ont ensuite été cuit à sec et revêtue d'aminopropyltriéthoxysilane (APTES) dans une chambre de dépôt sous vide.
2. Un joint en silicone a été coupé à l'aide d'un outil de coupe Silhouette SD. Cela nous a permis de contrôler finement les dimensions de la chambre de débit pour le contrôle du débit et de la contrainte de cisaillement au cours de la croissance cellulaire. Typiquement, un chenal a été creusé de 6,4 mm de large par 19 mm de longueur à partir d'une feuille de 0,4 mm de silicone. Le débit nécessaire à des genreste une contrainte de cisaillement de 1,0 Pa (10 dynes / cm ²⁾ est calculé en supposant un écoulement laminaire dans un canal rectangulaire à l'équation:

où Q est le débit, τ est la contrainte de cisaillement, μ est la viscosité du milieu, supposé ici être 1,0 mPa (0,01 dynes * s / cm ^2), h est la hauteur et w est la largeur de la chambre d'écoulement .

3. La pièce supérieure de la chambre d'écoulement est alignée avec le joint d'étanchéité dans la boîte de culture de cellules et fixé avec un anneau magnétique. L'ensemble a été rempli avec de l'alcool isopropylique (IPA) pour la stérilisation.
4. Le système en circuit principal a été assemblé. Les orifices d'écoulement dans la boîte de culture cellulaire sont connectés à trois voies. Les vannes ont été raccordés à ouvrir seringue de 30 mls. IPA est passée dans le système, qui a été ensuite lavée avec 30 ml de milieu McCoy avec 4% de sérum de veau foetal (FCS). Le système a ensuite été rempli avec 20 ml du milieu Vec Technologies croissance cellulaire. Couvertures ont été placés sur les sommets des seringues. Le capuchon de la seringue capture réservoir avait une aiguille en place pour aller moyennes vers le réservoir d'alimentation. Stériles filtres de 0,2 pm ont été attachés à des entrées d'air dans les couvertures pour éviter la contamination du système. La chambre d'écoulement est alors prêt pour l'ensemencement des cellules.

1.2 Culture Cellulaire

1. Les cellules endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) et le milieu de croissance ont été achetés auprès Technologies Vec (Rensselaer, État de New York) et cultivées jusqu'à confluence dans un flacon T25.
2. Le milieu de croissance a été retiré de la fiole et la monocouche de cellules du modèle avec 2 ml de trypsine 2,5%. Une fois que les cellules sont en solution, le traitement à la trypsine a été stoppée par l'ajout de 10 ml de milieu de culture cellulaire dans le ballon.
3. Thsuspension cellulaire est centrifugée e pendant 5 min et le surnageant a été éliminé. Les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de milieu de culture cellulaire (contenant du sérum) pour l'injection dans la chambre d'écoulement.
4. La suspension de cellules (0,5 ml, ~ 50.000 cellules) a été chargée dans une seringue et injecté dans la chambre d'écoulement à travers une vanne à trois voies.
5. Les cellules ont été autorisés à s'installer et à adhérer au substrat de verre pendant 2 heures avant que le débit a été lancé. Les cellules ont été cultivées dans des flux dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 à 5 jours jusqu'à confluence.

1.3 Préparation Cantilever et par pénétration cellulaire

1. Sans pointe cantilevers AFM (NanoWorld, Suisse) ont été nettoyés dans de l'acide nitrique pendant 5 min et fonctionnalisés avec aminopropyltriéthoxysilane (APTES) dans une chambre de dépôt en phase vapeur.
2. Une solution de 5 mg / ml en poids NHS-sulfo-LC-biotine dans une solution saline tamponnée de Hank (HBSS) a été préparé. Les consoles ont été immergés dans la solution pendant 15 min à conjuguésporte le silane avec du N-hydroxysuccinimide (NHS) chimie.
3. Une solution de biotine milieu exempt a été faite par incubation de 20 ml de Vec Technologies milieu de culture cellulaire (y compris le sérum) avec 200 ul de billes streptavadin pour 12 h. Les billes sont séparées du milieu d'un aimant et le milieu a été filtré à travers un filtre stérile 0,22 um.
4. La chambre d'écoulement a été retiré de la boîte de culture cellulaire et les cellules ont été lavées à 37 ° C sans biotine milieu.
5. Une solution mère de 1 ul de 2,4 um perles recouvertes de streptavidine dans 1 ml de biotine libre milieu a été préparé, et 100 ul du stock a été ajouté à la boîte de culture cellulaire.
6. Billes de streptavidine ont été ramassés en porte à faux avec l'atterrissage par la pointe sur la surface du verre à côté d'une perle, se rétractant, en positionnant le sommet de la console sur le talon, puis en appuyant vers le bas sur le cantilever les secondes de perles et de repos pour plusieurs.
7. La sensibilité de la mesure était en porte à fauxd par indentation sur une région de verre nu et en utilisant la pente de la courbe pour définir la déviation pointe en fonction de la tension.
8. La constante de rappel du levier a ensuite été calculé à partir d'un calibrage thermique dans le logiciel MFP3D.
9. Le cantilever calibré a ensuite été utilisé pour indenter les échantillons, comme le montre la figure 2. Ces billes 2,4 um offrir une plus grande surface de contact avec la surface de la cellule de telle sorte que les propriétés mécaniques de la couche douce glycocalyx peut être détectée. Le cantilever a été placé sur une cellule près du noyau cellulaire et une approche douce de la pointe sur la cellule a été utilisée pour régler la hauteur cantilever environ 3 um-dessus de la surface de la cellule. Le logiciel a été créé pour 20 empreintes répétées à un taux de 1 um / s à une force maximale de 7 nN. Environ 6 secondes écoulé entre les contacts successifs. Il est possible d'utiliser différents taux de retrait pour tester les propriétés dépendant du temps du glycocalyx, bien que dans ces premiers expériences, seul un taux unique indentation (1 um / s) a été utilisé.

2. Théorie indentation

Indentation dans un demi-espace élastique avec une sphère de rayon R peut être décrite en utilisant la théorie de Hertz, où la force d'indentation, F, est donnée par l'équation:

Où δ est la profondeur de pénétration et * E est le module de réduction de la matière en cours de test (figure 3). Dans le cas d'un pénétrateur infiniment rigides projeter un uniforme élastique demi-espace, E * est donné par l'équation:

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où E est le module d'élasticité et ν est le coefficient de Poisson du matériau. Les travaux récents de films polymères a inspiré le développement d'un modèle à deux couches pour déterminer le module et l'épaisseur des couches minces ^1. Nous appliquons ce modèle pour la biologie cellulaire en traitant le glycocalyx comme un film uniforme mince souple sur la surface du corps de cellule. En utilisant ce modèle, le module réduit du système devient:

Où E est le module _CA du glycocalyx, _cellule E est le module d'élasticité du corps de cellule, P, Q et n sont des constantes qui ont été déterminées empiriquement, à partir du polymère s'insère, et z est donnée par l'équation:

Où t est l'épaisseur de la couche de glycocalyx. Un schéma de ces paramètres est illustré à la figure 3. Le modèle a été montré pour être un moyen précis de déterminer le module et l'épaisseur d'un film mince sur substrat rigide ^1. Cette équation peut être utilisée pour ajuster les courbes obtenues à partir de l'indentation dans les cellules pour déterminer le module et l'épaisseur du glycocalyx endothéliale, comme le montre la figure 4.

Representative Results

Dans une expérience typique, 20 force vs distance courbes ont été obtenues à partir d'une région donnée de la cellule, généralement dans la région périnucléaire, à proximité, mais pas sur le noyau (dans ~ 2 um). Les courbes ont été alignés pour tenir compte de toute dérive échantillon au cours de la durée de la mesure, puis la moyenne pour éliminer le bruit en porte à faux, comme le montre la figure 4. Les courbes ont été analysés et qui cadrent avec le modèle à deux couches qui a été développé pour déterminer le module et l'épaisseur des films minces de polymère ^1. De universelle des courbes de 25 cellules, nous avons déterminé que le module de la couche luminale est de 0,7 ± 0,5 kPa et l'épaisseur est de 380 ± 50 nm, comme le montre la figure 5. Le module du corps cellulaire est de 16 ± 6 kPa. Ces valeurs sont en bon accord avec les mesures précédentes du module du corps cellulaire et l'épaisseur du glycocalyx ^{5, 8.}

Figure 1. Notre dispositif de culture cellulaire. Débit à travers la chambre a été entraîné par gravité à partir d'un réservoir d'C. Les cellules ont été étalées dans la chambre fermée B qui a eu lieu avec des aimants à la surface d'une boîte à cellules fermées pour un AFM asile (Asylum, Santa Barbara ). Vannes à trois voies sur B nous a permis d'arrêter l'écoulement. Un joint en silicone créé un canal d'écoulement de 6,4 mm de large par 19 mm de long et 0,4 mm de haut. La chambre fermée B a été facilement retiré et le plat à cellules fermées déplacé directement dans l'AFM pour l'expérimentation. La différence de hauteur D a été mis à jour par le pompage de fluide à partir du réservoir de C à A avec une pompe péristaltique (non représentée). L'ensemble est placé dans un incubateur pendant toute la durée de la culture cellulaire.

Figure 2. A gauche: l'image d'une console avec un 2.4um bourrelet (flèche) fixé par une liaison biotine-streptavidine. A droite: monocouche HUVEC cultivées dans des flux.

Figure 3. Géométrie de l'interaction de la bille de rayon R en retrait d'une distance de δ dans la cellule. L'glycocalyx, représentée en vert, présente un module d'E _GC et une épaisseur t. Le corps de la cellule a un module E _{de cellules.} La force appliquée par le bourrelet de la cellule, F, est mesurée et la courbe de la force par rapport à la distance, à la figure 4, est obtenu.

Figure 4. La force moyenne par rapport à la courbe de distance pour une indentation dans une cellule est tracée en rouge. Une indentation individu est montré dans l'encart. Mis en évidence dans l'image sont le point de contact, où le premier cantilever touche la surface luminale, la couche luminale, où la pente de la courbe est dominée par la rigidité du glycocalyx, et le corps de la cellule, où la pente est essentiellement fonction de la cellule module du corps. La courbe ajustée à partir de la théorie de l'indentation à deux couches est représentée en bleu, et l'ajustement pour le modèle simple Hertz pour un demi-espace élastique est représentée par la ligne pointillée noire. Il y avait quatre paramètres libres dans les crises à deux couches. Les valeurs déterminées lors de cet ajustement particulier sont les suivants: module de cellule = 15,9 kPa, la couche luminale module = épaisseur de la couche 0,33 kPa, et luminale = 420 nm. Le quatrième paramètre est équipée du point de contact avec le glycocalyx. Positionnement du rapport d'origine axe des x à la surface cellulaire est arbitraire. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 5. Histogrammes des propriétés de 25 cellules à partir des ajustements de courbe à gauche:. E _GC a été fixé à 0,7 ± 0,5 kPa. A droite: L'épaisseur de la glycocalyx a été établie à 380 ± 50 nm.

Discussion

Nous avons utilisé les valeurs calculées à partir du modèle à deux couches et la théorie de Hertz pour modéliser l'interaction d'un leucocyte circulant dans le sang avec la paroi endothéliale. Nous avons calculé qu'une microvillosités sur les leucocytes d'un diamètre de 50 nm sous une charge de 10 pN aurait tiret environ 150 nm dans le glycocalyx, seule une fraction de l'épaisseur totale. Ceci indique que le glycocalyx, avec des propriétés telles que mesurées dans cette expérience, est un obstacle important à l'interaction cellule-cellule et peut être un obstacle stérique grande que les cellules doivent surmonter au cours de la cascade de l'adhérence lors de l'adhésion des leucocytes.

Dans le modèle utilisé ici, nous rapprocher de la glycocalyx comme une structure élastique isotrope. Alors que nous sommes au courant d'aucune des mesures mécaniques pour indiquer que ce n'est pas le cas, ce qui est connu au sujet de la structure moléculaire du glycocalyx suggère qu'il s'agit probablement d'une simplification excessive. En fait, le glycocalyx est un complexe et variéla structure sur la surface des cellules. Il est constitué d'orientation des structures moléculaires, n'a pas de limite extérieure bien définie, et devient plus dense susceptible de fermer la surface de la cellule. Ainsi, tandis que le modèle à deux couches élastique utilisé ici donne un aperçu de la rigidité relative du glycocalyx observé par des cellules circulantes, les études futures pourraient explorer d'autres descriptions mécaniques qui peuvent rendre compte de son éventuelle anisotropie et la densité varie dans le sens de l'épaisseur. Il est également possible que le glycocalyx n'est pas uniforme dans les différentes régions de la surface cellulaire. Ce n'aurait pas été évident d'après les données actuelles, établies parce que toutes les données présentées ici ont été prises dans la région centrale de la cellule autour du noyau.

Le glycocalyx peut également présenter des propriétés viscoélastiques qui n'ont pas été étudiés dans cette étude. Il a été observé que, dans des conditions statiques, les globules rouges dans les capillaires peut complètement comprimer le glycocalyx, wheres circulationles globules rouges ne sont pas ^10. Forces statiques générés par les globules rouges sont probablement très faible (~ 3-10 Pa). Ceci indique que le glycocalyx peut être très doux en réponse à la compression lente, mais nettement plus rigide lors de compression rapide. Nos mesures ont été effectuées à des taux d'indentation de 1 um / s pour simuler la rigidité d'une cellule de circulation peuvent rencontrer, mais il reste encore à étudier les propriétés dépendant du temps est en cours.

Indentation AFM a été utilisé pour mesurer directement le module et l'épaisseur du glycocalyx endothéliale dans les cellules vivantes. Les mesures indiquent que le glycocalyx peut être un obstacle important à contact cellule-cellule et l'adhérence et sert probablement comme un facteur clé dans la régulation de la cascade d'adhésion au cours de l'inflammation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's Medium	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Endothelial Cell Growth Medium	Vec Technologies	MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid	JT Baker	9681-02
Hydrogen Peroxide	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Aldrich	440140-100ML
Isopropyl Alcohol	VWR	BDH8999-4
Trypsin	Cellgro	25-054-C1
Hank's Buffered Salt Solution	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
Streptavadin beads	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Tipless Cantilevers	Nanoworld	ARROW-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouette-SD
Silicone Rubber	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
30 ml Syringes	Benton Dickinson	309650
18 gauge needles	Benton Dickinson	305196
Extension Sets	Hospira	4429-48
4 way valves	Teleflex	W21372
Male/Female Port Caps	Smith’s Medical	MX491B
Peristaltic Pump	Watson-Marlow	401U/D
Peristaltic Tubing	Watson-Marlow	903.0016.016
sterile filters	Pall Life Science	4652