Kvantificering af mekaniske egenskaber af de Endothelial glycocalyx med Atomic Force Microscopy

Summary

De mekaniske egenskaber af endothelial glycocalyx blev målt ved indskæring ved hjælp mikronstørrelse kugler på AFM køreledningsophæng. Endotelceller blev dyrket i en brugerdefineret kammer under fysiologiske flow betingelser at inducere glycocalyx ekspression. Data analyseredes under anvendelse af en tynd film til bestemmelse af glycocalyx tykkelse og modulus.

Abstract

Vores forståelse af samspillet af leukocytter og karvæggen under leukocyt capture er begrænset af en ufuldstændig forståelse af de mekaniske egenskaber af den endotele overfladelag. Det er kendt, at adhæsionsmolekyler på leukocytter er fordelt uensartet i forhold til overfladetopografi ^3, at topografien begrænser klæbende bindingsdannelse med andre overflader ^9, og at fysiologiske kontaktkræfter (≈ 5,0 til 10,0 pN pr microvillus) komprimerer mikrovilli som lidt som en tredjedel af de hviler længde, øge tilgængeligheden af molekyler til den modstående overflade ^{3, 7.} Vi betragter endotel som en to-lags struktur, den relativt stive cellelegeme, plus glycocalyx, et blødt beskyttende sukkerovertræk på den luminale overflade ^6. Det er blevet vist, at glycocalyx kan virke som en barriere til at reducere adhæsion af leukocytter til endoteloverfladen ^4.I denne rapport har vi begynde at tage fat på deformerbarhed af endotheliale overflader for at forstå, hvordan den endotel mekaniske stivhed kan påvirke obligation formation. Endotelceller dyrket i statisk kultur ikke udtrykker en robust glycocalyx, men celler dyrket under fysiologiske flowbetingelser begynder at tilnærme glycocalyx observeret in vivo ^2. Modulus for den endotelcelle organ er blevet målt under anvendelse atomic force mikroskopi (AFM) til ca 5 til 20 kPa ^5. Tykkelsen og struktur glycocalyx er blevet undersøgt ved hjælp af elektronmikroskopi ⁸ og modulus for den glycocalyx er tilnærmet ved hjælp af indirekte metoder, men så vidt vides, har der ikke været offentliggjorte rapporter om en direkte måling af glycocalyx modul i levende celler . I denne undersøgelse præsenteres indrykning eksperimenter foretaget med en hidtil ukendt AFM probe på celler, der er dyrket under betingelser for at maksimere deres glycocalyx udtryk til make direkte målinger af modulet og tykkelsen af ​​endotel glycocalyx.

Protocol

1. Metoder

1,1 Cell strømningskammeret

En strømningskammeret, vist i figur 1, blev konstrueret således, at celler kan dyrkes under en forskydningshastighed på 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ og derefter overført direkte til en Asyl MFP3D AFM (Santa Barbara, CA).

1. Strømningskammeret blev forberedt til forsøget ved først at rense objektglas i Piranha-opløsning (3:01 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ i 15 minutter og derefter vaske dem med destilleret vand. De blev derefter bagt i tør og overtrukket med aminopropyltriethoxysilan (APTES) i et vakuum aflejringskammeret.
2. En silikonepakning blev skåret under anvendelse af en Silhouette SD skærende værktøj. Dette tillod os at fint styre strømmen kammerdimensioner til styring af strømningshastigheden og forskydningsspændinger under cellevækst. Typisk blev en kanal skåret 6,4 mm bredt og 19 mm langt fra en plade på 0,4 mm silikone. Strømningshastigheden nødvendig for at slægterte en forskydningsspænding på 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ beregnes under forudsætning laminar strømning i en rektangulær kanal med ligningen:

hvor Q er strømningshastigheden, τ er forskydningsspændingen, μ er viskositeten af mediet, antages her at være 1,0 mPa (0,01 dyn * sek / cm ^2), h er højden, og w er bredden af strømningskammeret .

3. Den øverste stykke af strømningskammeret blev tilpasset den pakning i cellekultur skålen og sikret med en magnetisk ring. Samlingen blev fyldt med isopropylalkohol (IPA) til sterilisering.
4. Den fulde flow-system blev samlet. Flowet porte i cellekultur skål blev forbundet til trevejsventiler. Ventilerne blev forbundet til at åbne 30 ml sprøjtens. IPA blev skyllet gennem systemet, som derefter blev vasket med 30 ml McCoys medium med 4% føtalt kalveserum (FCS). Systemet blev derefter fyldt med 20 ml af Vec Technologies cellevækstmedium. Covers blev anbragt på toppen af ​​sprøjterne. Fangsten reservoir sprøjtehætten havde en nål i stedet for at flytte medium tilbage til foderet reservoir. Sterile 0,2 um filtre blev fastgjort til lufttilførsel dækslerne at undgå kontaminering af systemet. Strømningskammeret var derefter klar til cellepodning.

1,2 Cellekultur

1. Humane navlestrengsvene-endotelceller (HUVEC s) og vækstmediet blev indkøbt fra Vec Technologies (Rensselaer, NY) og dyrket til konfluens i en T25 kolbe.
2. Vækstmediet blev fjernet fra kolben, og monolaget af celler frigivet med 2 ml 2,5% trypsin. Når cellerne var i opløsning, blev trypsinisering standset ved tilsætning af 10 ml celledyrkningsmedium til kolben.
3. The Cellesuspensionen blev centrifugeret i 5 minutter og supernatanten blev fjernet. Cellerne blev resuspenderet i 1 ml celledyrkningsmedium (indeholdende serum) til injektion i strømningskammeret.
4. Cellesuspensionen (0,5 ml, ~ 50.000 celler) blev fyldt i en sprøjte og injiceres i strømningskammeret gennem en trevejsventil.
5. Cellerne fik lov til at bundfælde og adhærere til glassubstratet i 2 timer før strømning startede. Cellerne blev dyrket under strømning i en inkubator ved 37 ° C i 1-5 dage indtil sammenflydende.

1,3 Cantilever Forberedelse og Cell indrykning

1. Tipless AFM køreledningsophæng (NanoWorld, Schweiz) blev renset i salpetersyre i 5 minutter og funktionaliseret med aminopropyltriethoxysilan (APTES) i et dampaflejringskammeret.
2. En opløsning af 5 mg / ml efter vægt NHS-sulfo-LC-biotin i Hanks pufrede saltopløsning (HBSS) blev fremstillet. Køreledningsophæng blev neddykket i opløsningen i 15 minutter til conjugate silanen med N-hydroxysuccinimid (NHS) kemi.
3. En opløsning af biotin frit medium blev fremstillet ved inkubering af 20 ml Vec Technologies celledyrkningsmedium (herunder serum) med 200 gi streptavadin perler i 12 timer. Perlerne blev fjernet fra mediet med en magnet, og mediet filtreredes gennem et 0,22 um sterilfilter.
4. Strømningskammeret blev fjernet fra cellekulturen skålen, og cellerne blev vasket i 37 ° C biotin-frit medium.
5. En stamopløsning af 1 ml af 2,4 um perler overtrukket med streptavidin i 1 ml biotin medium blev fremstillet, og 100 pi af bestanden blev tilsat til cellekulturen skålen.
6. Streptavidin perler blev samlet op med cantilever ved landing spidsen på glasoverfladen ved siden af ​​en perle, udkørsel, placerer spidsen af ​​cantilever over vulsten, og derefter trykke på cantilever ned på perle og hvile i flere sekunder.
7. Følsomheden af ​​cantilever var foranstaltningd ved at rykke på en region af bart glas og ved hjælp af hældningen af ​​kurven for at indstille spidsen deformation som en funktion af spænding.
8. Fjederkonstanten af ​​cantilever blev derefter beregnet fra en termisk kalibrering i MFP3D software.
9. Den kalibrerede cantilever blev derefter anvendt til led prøverne, som vist i figur 2. Disse 2,4 um perler giver et større kontaktområde med celleoverfladen således, at de mekaniske egenskaber af det bløde glycocalyx lag kan detekteres. Cantilever blev anbragt over en celle i nærheden af ​​cellekernen og en blød tilgang af spidsen på cellen blev anvendt til at indstille den udkragede højden cirka 3 um over celleoverfladen. Softwaren blev sat til 20 gentagne fordybninger med en hastighed på 1 pm / sek til en maksimal kraft på 7 nN. Ca 6 sek forløbet mellem successive kontakter. Det er muligt at anvende forskellige hastigheder af indrykning at teste for tidsafhængige egenskaber glycocalyx, skønt disse oprindelige forsøg, kun en enkelt indskæring rate (1 um / sek) blev anvendt.

2. Indrykning Theory

Fordybning i en elastisk halvrum med en kugle med radius R kan beskrives med Hertz teori hvor styrken af fordybningen, F, er givet ved ligningen:

Hvor δ er indrykningsdybden og E * er det reducerede modulus af det afprøvede materiale (figur 3). I tilfælde af en uendelig stiv indenter rammer et ensartet elastisk halvrum, er E * givet ved ligningen:

3/50163eq3.jpg "/>
hvor E er elasticitetsmodulet, og ν er Poisson-forholdet af materialet. Nyligt arbejde med polymer film har inspireret til udviklingen af en tolags model til bestemmelse af modulet og tykkelsen af tynde film ^1. Vi anvender denne model for cellebiologi ved behandling af glycocalyx som en ensartet tynd blød film på overfladen af ​​cellelegemet. Under anvendelse af denne model, den reducerede modul af systemet bliver:

Hvor E _GC er modulus af glycocalyx, E _celle er modulus af cellelegemet, P, Q og n er konstanter, der er empirisk bestemte fra polymeren passer, og z er givet ved ligningen:

Hvor t er tykkelsen af glycocalyx lag. En skematisk gengivelse af disse parametre er illustreret i figur 3.. Modellen er blevet vist at være en nøjagtig måde at bestemme elasticitetsmodulet og tykkelsen af en tynd film på stivere substrat ^1. Denne ligning kan anvendes til at passe til kurverne opnået fra fordybningen ind i celler for at bestemme modulus og tykkelsen af endothel glycocalyx, som vist i figur 4.

Representative Results

I et typisk eksperiment blev 20 kraft-vs-afstand kurver opnået fra en bestemt region af cellen, typisk i perinukleære region nær, men ikke på, kernen (inden for ~ 2 um). Kurverne blev tilpasset, så eventuel prøve drift under varigheden af målingen og derefter beregnet til fjernelse af cantilever støj, som vist i figur 4. Kurverne blev analyseret og passer med tolags model, der er udviklet til at bestemme modulus og tykkelsen af tynd polymer film ^1. Fra anfald af kurverne i 25-celler, har vi fastslået, at modulus for den luminale lag er 0,7 ± 0,5 kPa, og tykkelsen er 380 ± 50 nm, som vist i figur 5. Modulus for den cellelegemet er 16 ± 6 kPa. Disse værdier er i god overensstemmelse med tidligere målinger af modulus for den cellelegemet og tykkelsen af glycocalyx ^{5, 8.}

Figur 1. Vores cellekultur enhed. Flow tværs af kammeret blev drevet af tyngdekraften fra beholderen A til C. Celler blev udpladet i det lukkede kammer B, som blev holdt med magneter til overfladen af en lukket celle skål for en Asyl AFM (Asyl, Santa Barbara CA ). Trevejsventilerne om B muligt for os at stoppe strømmen. En silikonepakning skabt en strømningskanal 6,4 mm bred og 19 mm lang og 0,4 mm høj. Det lukkede kammer B blev let fjernet, og den lukkede celler skålen bevæges direkte i AFM til forsøg. Højdeforskellen D blev opretholdt ved at pumpe fluid fra reservoiret C til A med en peristaltisk pumpe (ikke vist). Hele konstruktionen blev anbragt i en inkubator under hele cellekulturen.

Figur 2 Venstre:. Billede af en cantilever med en 2,4um vulst (pil) forbundet med et biotin-streptavidin-binding. Højre: monolag af HUVEC'er dyrket under flow.

Figur 3. Geometrien af interaktionen af perlen med radius R indrykning en afstand δ i cellen. The glycocalyx, vist med grønt, har en modulus af E _GC og en tykkelse t.. Cellelegemet har et elasticitetsmodul E _celle. Kraften påført med vulsten til cellen, F, måles, og kraft i forhold til afstand-kurven, vist i figur 4, opnås.

Fig. 4. Den gennemsnitlige kraft versus afstand-kurven for en fordybning i en celle er afbildet i rødt. En individuel fordybning er vist i det indsatte diagram. Fremhævet i billedet er kontaktpunktet, når cantilever 1. rører den luminale overflade, den luminale lag, hvor kurvens hældning er domineret af stivheden af ​​glycocalyx, og cellelegemet, hvor hældningen er primært en funktion af cellen body modul. Den tilpassede kurve fra tolags fordybning teori er vist i blå, og egnet til den enklere Hertz model for en elastisk halvrum er vist ved den stiplede sorte linje. Der var fire gratis parametre i de to-lags passer. Værdier fastlagt for denne særlige pasform var: celle modul = 15,9 kPa, luminal lag modulus = 0,33 kPa, og luminal lagtykkelse = 420 nm. Den fjerde monteret parameter er kontaktpunktet med glycocalyx. Placering af x-aksen oprindelse i forhold til celleoverfladen er vilkårlig. Klik her for at se større figur .

5 "fo: indhold-bredde =" 5.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5.jpg "/>
Figur 5. Histogrammer af egenskaberne af 25 celler fra kurvetilpasning Venstre:. E _GC blev bestemt til at være 0,7 ± 0,5 kPa. Højre: Tykkelsen af ​​glycocalyx blev bestemt til at være 380 ± 50 nm.

Discussion

Vi anvendte værdier beregnet ud fra de to-lags modellen og Hertz teori for at modellere interaktionen mellem en leukocyt cirkulerer i blodet med endotel væg. Vi har beregnet, at en microvillus på leukocyt med en diameter på 50 nm efter en 10 pN belastning ville led omkring 150 nm i glycocalyx, kun en brøkdel af den totale tykkelse. Dette indikerer, at glycocalyx, med egenskaber som målt ved dette forsøg, er en væsentlig hindring for celle-celle interaktion og kan være en stor sterisk hindring, som cellerne skal overvindes under adhæsion kaskade under leukocytadhæsion.

I modellen anvendes her, vi tilnærme glycocalyx som et isotropisk elastisk struktur. Mens vi er uvidende om nogen mekaniske målinger for at angive dette ikke er tilfældet, hvad der vides om den molekylære struktur af glycocalyx antyder, at dette sandsynligvis en overforenkling. Faktisk er glycocalyx en kompleks og varieretstruktur på overfladen af ​​celler. Den består af orienterede molekylære strukturer, mangler en veldefineret ydre afgrænsning, og sandsynligvis bliver tættere tæt på celleoverfladen. Således, mens de to-lags elastisk model, der anvendes her, giver et indblik i den relative stivhed af glycocalyx observeret ved cirkulerende celler, kan fremtidige studier udforske alternative mekaniske beskrivelser, der kan tegne sig for en eventuel anisotropi og varierende tæthed i tykkelsen retning. Det er også muligt at glycocalyx ikke er ensartet på tværs af forskellige regioner i celleoverfladen. Dette ville ikke have været tydeligt af de foreliggende datasæt, fordi alle data præsenteret her taget i det centrale område af cellen rundt om kernen.

The glycocalyx kan også udvise viskoelastiske egenskaber, som ikke blev undersøgt i denne undersøgelse. Det er blevet observeret, at, under statiske betingelser, kan røde blodlegemer i kapillærer fuldstændigt komprimere glycocalyx, wheres cirkulerenderøde blodlegemer ikke ^10. Kræfter, som frembringes af statiske røde celler vil sandsynligvis være ekstremt lille (~ 3-10 Pa). Dette indikerer glycocalyx kan være meget blød som følge af langsom komprimering, men betydeligt stivere i hurtigere komprimering. Vores målinger blev udført ved indrykning satser 1 um / sek for at simulere stivheden en cirkulerende celle kan støde, men fortsat arbejde med at undersøge de tidsafhængige egenskaber er i gang.

AFM fordybning er blevet anvendt til direkte at måle elasticitetsmodulet og tykkelsen af ​​den endotheliale glycocalyx i levende celler. Målingerne viser, at glycocalyx kan være en betydelig hindring for celle-celle kontakt og vedhæftning og sandsynligvis tjener som en nøglefaktor i reguleringen af ​​adhæsion kaskade under inflammation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's Medium	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Endothelial Cell Growth Medium	Vec Technologies	MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid	JT Baker	9681-02
Hydrogen Peroxide	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Aldrich	440140-100ML
Isopropyl Alcohol	VWR	BDH8999-4
Trypsin	Cellgro	25-054-C1
Hank's Buffered Salt Solution	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
Streptavadin beads	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Tipless Cantilevers	Nanoworld	ARROW-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouette-SD
Silicone Rubber	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
30 ml Syringes	Benton Dickinson	309650
18 gauge needles	Benton Dickinson	305196
Extension Sets	Hospira	4429-48
4 way valves	Teleflex	W21372
Male/Female Port Caps	Smith’s Medical	MX491B
Peristaltic Pump	Watson-Marlow	401U/D
Peristaltic Tubing	Watson-Marlow	903.0016.016
sterile filters	Pall Life Science	4652