Quantificare le proprietà meccaniche del glicocalice endoteliale con microscopia a forza atomica

Summary

Le caratteristiche meccaniche del glicocalice endoteliale sono state misurate utilizzando sfere indentazione micron di dimensioni su cantilever AFM. Le cellule endoteliali sono state coltivate in una camera personalizzata in condizioni fisiologiche di flusso per indurre l'espressione glicocalice. I dati sono stati analizzati utilizzando un modello di pellicola sottile per determinare lo spessore glicocalice e modulo.

Abstract

Nostra comprensione dell'interazione dei leucociti e la parete del serbatoio durante la cattura dei leucociti è limitata da una non completa comprensione delle proprietà meccaniche dello strato di superficie endoteliale. È noto che molecole di adesione sui leucociti sono distribuite in modo non uniforme rispetto alla superficie topografia ^3, che limita la formazione topografia adesivo legame con altre superfici ^9, e che le forze di contatto fisiologici (≈ 5,0-10,0 pN per microvillus) può comprimere i microvilli come meno un terzo della loro lunghezza a riposo, aumentando l'accessibilità di molecole alla superficie opposta ^{3, 7.} Consideriamo l'endotelio come struttura a due strati, il corpo cellulare relativamente rigido, più il glicocalice, un rivestimento morbido zucchero protettivo sulla superficie luminale ^6. E 'stato dimostrato che il glicocalice può agire come una barriera per ridurre l'adesione dei leucociti al ⁴ superficie endoteliale.In questa relazione si comincia ad affrontare la deformabilità delle superfici endoteliali per capire come la rigidità meccanica endoteliale potrebbe influenzare la formazione del legame. Le cellule endoteliali in coltura statica non esprimono un glicocalice robusta, ma le cellule cresciute in condizioni di flusso fisiologiche cominciano ad approssimare il glicocalice osservate in vivo ^2. Il modulo del corpo cellulare endoteliale è stata misurata utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM) da circa 5 a 20 kPa ^5. Lo spessore e la struttura del glicocalice sono stati studiati mediante microscopia elettronica ^8, e il modulo del glicocalice è stato calcolato utilizzando metodi indiretti, ma a nostra conoscenza, non ci sono stati rapporti pubblicati di una misura diretta del modulo glicocalice in cellule viventi . In questo studio, presentiamo indentazione esperimenti effettuati con una nuova sonda AFM sulle cellule che sono state coltivate in condizioni di massimizzare la loro espressione di glicocalice make misurazioni dirette del modulo e lo spessore del glicocalice endoteliale.

Protocol

1. Metodi

1,1 Cella camera di flusso

Una camera di flusso, illustrato in figura 1, è stato costruito in modo che le cellule possono essere coltivate in un taglio di 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ e poi trasferita direttamente a un AFM Asylum MFP3D (Santa Barbara, CA).

1. La camera di flusso è stato preparato per l'esperimento prima pulizia dei vetrini in soluzione Piranha (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ per 15 min e poi lavando con acqua distillata. Essi sono stati poi cotto a secco e rivestita con trietossi amminopropil silano (APTES) in una camera di deposizione sotto vuoto.
2. Una guarnizione in silicone è stato tagliato con un utensile da taglio Silhouette SD. Questo ha permesso di controllare con precisione le dimensioni della camera di flusso per il controllo della portata e sollecitazione di taglio durante la crescita cellulare. Tipicamente, un canale è stato tagliato 6,4 millimetri di larghezza per 19 mm di lunghezza da un foglio di silicone 0,4 mm. La portata necessaria per generite una sollecitazione di taglio di 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ è calcolato assumendo flusso laminare in un canale rettangolare con l'equazione:

dove Q è la portata, τ è la tensione tangenziale, μ è la viscosità del mezzo, assume qui per essere 1,0 mPa (0,01 sec * dyn / cm ^2), h è l'altezza e w è la larghezza della camera di flusso .

3. La parte superiore della camera di flusso è stata allineata con la guarnizione nella piastra di coltura cellulare e fissato con un anello magnetico. Il gruppo è stato riempito con alcol isopropilico (IPA) per la sterilizzazione.
4. Il sistema a flusso totale è stato assemblato. Le porte di flusso nella piastra di coltura cellulare sono stati collegati a tre vie. Le valvole sono state collegate ad aprire siringa da 30 mls. IPA è stato lavato attraverso il sistema, che è stato poi lavato con 30 ml di mezzo di McCoy con 4% di siero fetale bovino (FCS). Il sistema è stato riempito con 20 ml di mezzo di crescita cellulare Vec Technologies. Copertine sono stati collocati sulle cime delle siringhe. Il tappo del serbatoio cattura siringa aveva un ago in atto per spostare il supporto al serbatoio di alimentazione. 0,2 micron filtri sterili erano attaccati alle prese d'aria dei coperchi per evitare la contaminazione del sistema. La camera di flusso è quindi pronto per semina cellulare.

1,2 Colture Cellulari

1. Cellule endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) e terreno di coltura sono stati acquistati da Technologies Vec (Rensselaer, NY) e coltivate a confluenza in una beuta T25.
2. Il mezzo di crescita è stato rimosso dal pallone e il monostrato di cellule rilasciate con 2 ml di 2,5% tripsina. Una volta che le cellule erano in soluzione, la tripsinizzazione è stata bloccata con l'aggiunta di 10 ml di mezzo di coltura cellulare al pallone.
3. Thsospensione cellulare è stata centrifugata e per 5 minuti ed il surnatante è stato rimosso. Le cellule sono state risospese in 1 ml di mezzo di coltura cellulare (contenente siero) per l'iniezione nella camera di flusso.
4. La sospensione cellulare (0,5 ml, ~ 50.000 cellule) è stato caricato in una siringa e iniettato nella camera di flusso attraverso una valvola a tre vie.
5. Le cellule sono state lasciate sedimentare e aderire al substrato di vetro per 2 h prima di flusso è stato avviato. Le cellule sono state cresciute in condizioni di flusso in un incubatore a 37 ° C per 1 a 5 giorni fino confluenti.

1.3 Preparazione a sbalzo e rientro cellulare

1. Tipless cantilever AFM (nanomondo, Svizzera) sono stati puliti in acido nitrico per 5 min e funzionalizzato con amminopropil trietossi silano (APTES) in una camera di deposizione vapore.
2. Una soluzione di 5 mg / ml in peso NHS-solfo-LC-biotina in soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) è stato preparato. I cantilever sono stati immersi nella soluzione per 15 minuti per coniugatocancello il silano con N-Hydroxysuccinimide (NHS) chimica.
3. Una soluzione di mezzo di biotina libera è stata effettuata incubando 20 ml di mezzo di coltura cellulare Vec Technologies (compreso il siero) con 200 microlitri di perline streptavadin per 12 hr. Le perle sono state rimosse dal mezzo di magnete e il mezzo è stato filtrato attraverso un filtro di 0,22 micron sterile.
4. La camera di flusso è stato rimosso dalla piastra di coltura cellulare e le cellule sono state lavate in 37 ° C biotina medie.
5. Una soluzione stock di 1 ml di 2,4 micron perle rivestite con streptavidina in 1 ml di mezzo di biotina libera è stato preparato, e 100 pl di magazzino sono stati aggiunti alla piastra di coltura cellulare.
6. Perline streptavidina stati prelevati con il cantilever di atterraggio della punta sulla superficie del vetro accanto ad un tallone, ritrarre, posizionando l'apice del cantilever sul tallone, e quindi premendo il cantilever giù sulle secondo tallone e di riposo per diversi.
7. La sensibilità della misura era cantileverd indentando su una regione di vetro nuda e utilizzando la pendenza della curva di impostare la deflessione punta in funzione della tensione.
8. La costante elastica del cantilever stato quindi calcolato da una calibrazione termica nel software MFP3D.
9. Il cantilever calibrato è stato poi utilizzato per rientro dei campioni, come mostrato in Figura 2. Queste perle 2,4 micron offrono una maggiore superficie di contatto con la superficie cellulare in modo che le proprietà meccaniche dello strato morbido glicocalice può essere rilevato. Il cantilever è stato posizionato sopra una cella vicino al nucleo cellulare e un approccio morbido del puntale nella cella è stato usato per impostare l'altezza a sbalzo circa 3 micron sopra la superficie cellulare. Il software è stato impostato per 20 rientranze ripetute ad una velocità di 1 um / sec ad una forza massima di 7 nN. Circa 6 secondi trascorsi tra i contatti successivi. È possibile utilizzare diversi tassi di rientro per verificare dipendenti dal tempo proprietà del glicocalice, anche se in questi primi esperimenti, solo un tasso rientranza singola (1 um / sec) è stato usato.

2. Teoria indentazione

Rientro in un semispazio elastico con una sfera di raggio R possono essere descritti usando teoria di Hertz in cui viene data la forza di rientro, F, mediante l'equazione:

Dove δ è la profondità di penetrazione e * E è il modulo ridotto del materiale in prova (Figura 3). Nel caso di un penetratore infinitamente rigida interferire uniforme elastica semispazio, E * è data dall'equazione:

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dove E è il modulo elastico e ν è il rapporto di Poisson del materiale. Recente lavoro con polimero film ha ispirato lo sviluppo di un modello a due strati per la determinazione del modulo e lo spessore di film sottili ^1. Stiamo applicando questo modello alla biologia cellulare trattando il glicocalice come una pellicola sottile uniforme morbido sulla superficie del corpo cellulare. Utilizzando questo modello, il modulo ridotta del sistema diventa:

Dove E è il modulo _GC del glicocalice, _cella E è il modulo del corpo cellulare, P, Q ed n sono costanti che sono stati determinati empiricamente dal polimero adatto, e Z è data dall'equazione:

Dove t è lo spessore dello strato di glicocalice. Uno schema di questi parametri è mostrato in Figura 3. Il modello è stato dimostrato di essere un modo accurato per determinare il modulo e lo spessore di una pellicola sottile su substrato rigido ^1. Questa equazione può essere utilizzata per adattare le curve ottenute dal rientro in cellule per determinare il modulo e lo spessore del glicocalice endoteliale, come mostrato in Figura 4.

Representative Results

In un esperimento tipico, 20 forza-vs-distanza curve sono state ottenute da una data regione della cellula, tipicamente nella regione perinucleare, vicino, ma non, il nucleo (entro ~ 2 micron). Le curve sono state allineate per tenere conto di qualsiasi deriva campione per tutta la durata della misurazione e poi mediati per rimuovere il rumore cantilever, come mostrato in Figura 4. Le curve sono state analizzate e forma con il modello a due strati che è stato sviluppato per la determinazione del modulo e lo spessore del film sottile di polimero ^1. Di attacchi di curve di 25 celle, abbiamo determinato che il modulo dello strato luminale è di 0,7 ± 0,5 kPa e lo spessore è di 380 ± 50 nm, come mostrato in Figura 5. Il modulo del corpo cellulare è 16 ± 6 kPa. Questi valori sono in buon accordo con le misurazioni precedenti del modulo del corpo cellulare e lo spessore del glicocalice ^{5, 8.}

Figura 1. Nostro dispositivo di coltura cellulare. Flusso attraverso la camera è stata guidata per gravità dal serbatoio A a C. Le cellule sono state piastrate in B camera chiusa che si è svolta con magneti sulla superficie di un recipiente a celle chiuse per un Asylum AFM (Asylum, Santa Barbara CA ). Valvole a tre vie su B ci ha permesso di fermare il flusso. Una guarnizione in silicone ha creato un canale di flusso 6,4 millimetri di larghezza per 19 mm di lunghezza di 0,4 mm di altezza. La camera chiusa B era facilmente rimosso e il piatto a cellule chiuse spostato direttamente nella AFM per la sperimentazione. L'altezza differenza D è stata mantenuta mediante pompaggio del liquido dal serbatoio C ad A con una pompa peristaltica (non mostrato). L'intero gruppo è stato posto in un incubatore per la durata della coltura cellulare.

Figura 2 A sinistra:. Immagine di un cantilever con un 2,4micron cordone (freccia) attaccato da un legame biotina-streptavidina. A destra: monostrato di HUVEC coltivate in condizioni di flusso.

Figura 3. Geometria della interazione del tallone di raggio R indentazione una distanza δ nella cella. Il glicocalice, mostrata in verde, ha modulo E _GC e spessore t. Il corpo cella ha una _cella modulo E. La forza applicata dal tallone alla cella, F, viene misurata e la curva della forza in funzione della distanza, mostrato in figura 4, si ottiene.

Figura 4. La forza mediata contro curva di distanza per una rientranza in una cella è tracciato in rosso. Una rientranza individuo viene mostrato nel riquadro. Evidenziato nell'immagine sono il punto di contatto, in cui il primo sbalzo tocca la superficie luminale, lo strato luminale, dove è dominato la pendenza della curva dalla rigidezza del glicocalice, e il corpo cellulare, dove la pendenza è principalmente una funzione della cellula corpo modulo. La curva stimata della due strati teoria indentazione è mostrata in blu, e l'adattamento per il modello Hertz semplice per un semispazio elastico è indicato dalla linea tratteggiata nera. C'erano quattro parametri liberi nei due strati si adatta. I valori determinati per questa forma particolare sono stati: modulo cellulari = 15,9 kPa, strato luminale modulo = strato di 0,33 kPa, e luminale spessore = 420 nm. Il quarto parametro è adattato sia il punto di contatto con il glicocalice. Posizionamento del x-relativo asse origine alla superficie cellulare è arbitrario. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 5. Istogrammi delle proprietà di 25 cellule di le crisi curva a sinistra.: E _GC è stato determinato in 0,7 ± 0,5 kPa. Destra: Lo spessore del glicocalice è stata determinata essere 380 ± 50 nm.

Discussion

Abbiamo usato valori calcolati dal modello a due strati e teoria Hertz per modellare l'interazione di un leucociti circolanti nel sangue con la parete endoteliale. Abbiamo calcolato che un microvillus sulla leucociti con un diametro di 50 nm sotto un carico di 10 pN sarebbe trattino circa 150 nm nel glicocalice, solo una frazione dello spessore totale. Ciò indica che il glicocalice, con proprietà misurate in questo esperimento, è una barriera significativa interazione cellula-cellula e può essere un grande ostacolo sterico cui le cellule devono superare durante la cascata adesione durante adesione leucocitaria.

Nel modello qui utilizzato, si approssima il glicocalice come struttura isotropa elastica. Mentre siamo a conoscenza di alcun misurazioni meccaniche per indicare questo non è il caso, ciò che è noto circa la struttura molecolare del glicocalice suggerisce che questa è probabilmente una semplificazione. Infatti, il glicocalice è una complessa e variastruttura sulla superficie delle cellule. È costituita da strutture molecolari orientate, manca di un ben definito confine esterno, e diventa probabilmente più densa vicino alla superficie cellulare. Così, mentre i due strati modello elastico usato qui fornisce un'indicazione della rigidità relativa del glicocalice osservato da cellule circolanti, studi futuri potrebbero esplorare alternative descrizioni meccaniche che possono spiegare sua anisotropia possibile e densità variabile nella direzione dello spessore. È anche possibile che il glicocalice non è uniforme nelle diverse regioni della superficie cellulare. Ciò non sarebbe stato evidente dai dati attuali impostati perché tutti i dati presentati qui sono stati prelevati nella regione centrale della cella attorno al nucleo.

Il glicocalice possono anche esibire proprietà viscoelastiche che non sono stati esaminati in questo studio. È stato osservato che, in condizioni statiche, globuli rossi nei capillari può completamente comprimere il glicocalice, wheres circolantiglobuli rossi non lo fanno ^10. Forze generate da statici globuli rossi possono essere estremamente piccola (~ 3-10 Pa). Questo indica il glicocalice può essere molto morbido in risposta alla compressione lenta, ma significativamente più rigido più veloce durante la compressione. Le nostre misure sono state eseguite a tassi di rientro di 1 micron / sec per simulare la rigidità di una cella di circolazione può incontrare, ma continuare ad operare per indagare le proprietà dipendenti dal tempo è in corso.

Indentazione AFM è stato usato per misurare direttamente il modulo e lo spessore del glicocalice endoteliale in cellule viventi. Le misurazioni indicano che il glicocalice può essere un ostacolo significativo per contatto cellula-cellula e adesione e probabilmente serve come un fattore chiave nella regolazione della cascata adesione durante l'infiammazione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's Medium	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Endothelial Cell Growth Medium	Vec Technologies	MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid	JT Baker	9681-02
Hydrogen Peroxide	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Aldrich	440140-100ML
Isopropyl Alcohol	VWR	BDH8999-4
Trypsin	Cellgro	25-054-C1
Hank's Buffered Salt Solution	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
Streptavadin beads	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Tipless Cantilevers	Nanoworld	ARROW-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouette-SD
Silicone Rubber	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
30 ml Syringes	Benton Dickinson	309650
18 gauge needles	Benton Dickinson	305196
Extension Sets	Hospira	4429-48
4 way valves	Teleflex	W21372
Male/Female Port Caps	Smith’s Medical	MX491B
Peristaltic Pump	Watson-Marlow	401U/D
Peristaltic Tubing	Watson-Marlow	903.0016.016
sterile filters	Pall Life Science	4652