من خلال الجمع بين أساليب جبل RNA كله<em> في الموقع</em> التهجين وعلم الأنسجة، يمكن ربط التعبير الجيني لقرارات مصير الخلية في الجنين النامية. وقد تم تكييف هذه الأساليب لelasmobranchs البحرية وتسهيل استخدام هذه الحيوانات والكائنات الحية نموذجا للدراسات الطبية الحيوية، وعلم السموم والمقارنة.
وتقدر قيمة elasmobranchs النماذج الحيوانية البحرية للدراسات الطب الحيوي والجينومية لأنها هي الفقاريات الأكثر بدائية لديهم مناعة التكيفية ولها آليات فريدة من نوعها لتنظيم التناضح 1-3. كما الفقاريات الفكية-المعيشة الأكثر بدائية مع الزوائد مقترن، elasmobranchs هي نموذجا هاما تطويريا، وخاصة بالنسبة للدراسات في التطور والتنمية. كما تم elasmobranchs البحرية تستخدم لدراسة علم السموم المائية وعلم وظائف الأعضاء التوتر في العلاقة إلى 4 تغير المناخ. وبالتالي، هناك حاجة إلى تطوير وتكييف المنهجيات لتسهيل وتوسيع نطاق استخدام هذه الفقاريات البدائية إلى التخصصات البيولوجية متعددة. هنا أقدم على التكيف الناجح لجبل RNA كله في الموقع التهجين والتقنيات النسيجية لدراسة التعبير الجيني وعلم الأنسجة الخلية في elasmobranchs.
رصد التعبير الجيني هو أداة مميزة لبيول التنمويةogists، ويستخدم على نطاق واسع للتحقيق في العمليات التنموية 5. RNA جبل بأكمله في الموقع التهجين يسمح التصور وتوطين النصوص جين معين في أنسجة الجنين النامية. يمكن للنمط التعبير الجيني في الرسالة توفير نظرة ثاقبة ما هي العمليات التنموية والقرارات مصير الخلية الجين قد السيطرة عليها. من خلال مقارنة نمط التعبير عن الجينات في مراحل نمو مختلفة، يمكن اكتسبت نظرة ثاقبة دور كيف لتغييرات الجين خلال التنمية.
بينما جبل كامل في ليالي 'الموقع يوفر وسيلة لتوطين التعبير الجيني للأنسجة، وتقنيات النسيجية تسمح لتحديد أنواع الخلايا والأنسجة المتمايزة. البقع النسيجية لها وظائف متنوعة. وتستخدم لتسليط الضوء على بقع العام شكل الخلية، على سبيل المثال hematoxylin و eosin لتلطيخ العام للنوى والسيتوبلازم، على التوالي. يمكن تسليط الضوء على بقع معينة من الخلايا الأخرىأنواع. على سبيل المثال، وصمة عار ذكرت والأزرق alcian في هذه الورقة هو وصمة عار على نطاق واسع لتحديد mucosaccharides الموجبة. يمكن تلطيخ من الجهاز الهضمي مع الأزرق alcian تحديد توزيع الخلايا الكأسية التي تنتج mucosaccharides. الاختلافات في مكونات mucosaccharide على الببتيدات قصيرة تمييز الخلايا الكأسية حسب الوظيفة في الجهاز الهضمي 6. باستخدام RNA جبل كامل في أساليب الموقع لوالنسيجية بشكل متزامن، يمكن ربط مصير قرارات الخلية إلى الجينات المحددة التعبير.
على الرغم من أن RNA في ليالي الموقع 'والكيمياء النسيجية وتستخدم على نطاق واسع من قبل الباحثين، والتقى تكييفها واستخدامها في elasmobranchs البحرية نجاحا محدودا ومتنوعة. هنا أقدم البروتوكولات التي وضعت لelasmobranchs واستخدامها على أساس منتظم في مختبري. على الرغم من أن قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التعديل من الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين طريقة لللتكيف مع أنواع مختلفة، وصفت البروتوكولات هنا عrovide نقطة قوية للباحثين الراغبين بدءا من التكيف على استخدام elasmobranchs البحرية على استفساراتهم العلمية.
البروتوكولات المقدمة من الطرق الكلاسيكية لرصد وتحديد التعبير الجيني أنواع الخلايا المتمايزة، والتي تم تكييفها للاستخدام في elasmobranchs البحرية. قد تكون هناك حاجة لإجراء المزيد من التعديلات هذه البروتوكولات على التكيف مع أنواع مختلفة صفيحية الخياشيم.
<p class="jove_content" styl…The authors have nothing to disclose.
وأود أن أشكر العديد من الطلاب الجامعية الذين عملوا في مختبري وساهم في تطور هذه البروتوكولات. وقد تلقت الدعم من NAT شبكة سكيدمور، الاتحاد، وهو مشروع إنشاء ADVANCE مع NSF المدفوعة المنحة.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
formamide | Fisher | BP227500 | |
Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
NBT | 11585029001 | ||
BCIP | Roche | 11585002001 | |
Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |