Summary
Mediante la combinación de los métodos de montaje de ARN total
Abstract
Elasmobranquios marinos se valoran los modelos animales para estudios biomédicos y genómicos, ya que son los vertebrados más primitivos para tener inmunidad adaptativa y contar con mecanismos únicos para la osmorregulación 1-3. Como las más primitivas de vida jawed vertebrados con apéndices pares, los elasmobranquios son un modelo evolutivo importante, especialmente para los estudios de evolución y desarrollo. Elasmobranquios marinos también se han utilizado para estudiar toxicología acuática y la fisiología del estrés en relación a 4 sobre el cambio climático. Así, el desarrollo y la adaptación de las metodologías que se necesita para facilitar y ampliar el uso de estos vertebrados primitivos a múltiples disciplinas biológicas. Aquí os presento la exitosa adaptación de montaje ARN total hibridación in situ y técnicas histológicas para el estudio de la expresión génica y la histología de células en los elasmobranquios.
Seguimiento de la expresión de genes es una herramienta de sello de desarrollo biologists, y se utiliza ampliamente para investigar los procesos de desarrollo 5. Montaje ARN toda la hibridación in situ permite la visualización y localización de transcritos de genes específicos en tejidos del embrión en desarrollo. El patrón de expresión del mensaje de un gen puede dar una idea de lo que los procesos de desarrollo y las decisiones de destino celular de un gen puede controlar. Al comparar el patrón de expresión de un gen en diferentes etapas de desarrollo, la visión puede ser adquirida en cómo el papel de algunos cambios genéticos durante el desarrollo.
Mientras que todo el montaje in situ 's proporciona un medio para localizar la expresión de genes a los tejidos, las técnicas histológicas permiten la identificación de tipos de células diferenciadas y tejidos. Tinciones histológicas tienen diversas funciones. Manchas generales se usan para resaltar la morfología celular, por ejemplo hematoxilina y eosina para la tinción general de núcleos y el citoplasma, respectivamente. Otras manchas pueden destacar celda específicatipos. Por ejemplo, el azul Alcian mancha presentado en este artículo es una mancha muy utilizado para identificar mucosaccharides catiónico. La tinción del tracto digestivo con azul alcián puede identificar la distribución de las células caliciformes que producen mucosaccharides. Las variaciones en los componentes mucosaccharide en péptidos cortos distinguir las células caliciformes por su función en el tracto digestivo 6. Mediante el uso de montaje ARN entero en métodos in situ 's e histoquímicas simultáneamente, las decisiones de destino celular puede estar vinculado a genes específicos de expresión.
A pesar de ARN in situ 's e histoquímica son ampliamente utilizados por los investigadores, su adaptación y uso en los elasmobranquios marinos han tenido un éxito limitado y variados. Aquí presento protocolos desarrollados para los elasmobranquios y se utiliza de forma regular en mi laboratorio. Aunque la modificación de los ARN en el método de hibridación in situ 's puede ser necesario para adaptarse a las diferentes especies, los protocolos descritos aquí proveer un sólido punto de partida para los investigadores que deseen adaptar el uso de elasmobranquios marinos para sus investigaciones científicas.
Protocol
I. Total RNA montaje hibridación in situ en los elasmobranquios marinos
1. Fijación embrión y Preparación
- Skate embriones pueden organizarse de acuerdo a Ballard 7. Etapas óptimo para la detección de la expresión génica depende del tejido de interés. Para el seguimiento de la expresión génica en el tracto digestivo del patín, etapas 27-30 son óptimas 7.
- Diseccionar embriones en PBS, la separación de los embriones desde el saco vitelino.
- Fijar en 30 ml de paraformaldehído al 4% recién hecho (PFA) en un tubo cónico de 50 ml a 4 º C con agitación suave. Fijar durante 24 horas.
- Lavar los embriones en PBT, dos veces durante 15 min, rotando a temperatura ambiente. Todas las recetas de solución para montaje ARN total in situ 's se incluyen (Tabla 1).
- Deshidratar embriones por lavado en una serie de metanol de 25%, 50% y 75% de metanol: PBT balanceo a temperatura ambiente. La duración de los lavados depende de la etapa de los embriones. Para pre-neurulation etapas embriones, 5 min de cada lavado en la serie de metanol es suficiente. Para los embriones de más de 30 etapas, lavado puede durar hasta 30 minutos. Para determinar si los embriones son suficientemente penetrado y aclimatarse a cada lavado, mantenga el tubo en posición vertical en la mano. Si los embriones se hunden hasta el fondo del tubo, entonces está listo para el siguiente lavado. Si los embriones flotan en la parte superior de la solución, cambie la solución y repita que etapa de deshidratación particular.
- Lavar dos veces en 100% de metanol durante 10 min agitando suavemente.
- Una vez deshidratado a 100% de metanol, los embriones deben ser almacenados a -20 ° C durante al menos 24 horas antes de proceder con el protocolo. Los embriones han sido correctamente almacenados a -20 ° C y se utiliza para los montajes de ARN enteros de hasta 1 año.
2. Síntesis de ARN sonda
- Generar un fragmento lineal de los genes cuya expresión se quiere detectar. Esto se puede hacer ya sea mediante amplificación por PCR o linealizando un plásmido con el gende interés. Para amplificar por PCR, elegir cebadores cuyos sitios de unión flanquean el gen insertar y retener los sitios de unión de ARN polimerasa en la región amplificada. Para plásmidos comúnmente usados tales como PBS o pGEM, hacia adelante M15 y cebadores inversos son ideales. Alternativamente, linealizar un plásmido por digestión de 15 l de ADN de QIAGEN miniprep con una enzima que escinde en el extremo 5 'del gen. Gel extraer y purificar usando el kit QIAquick apropiado.
- Transcribir inversamente la sonda de ARN usando 8 ng l de plásmido lineal o 100 de producto de PCR como una plantilla mediante la ARN polimerasa apropiada (véase la Tabla 2 para la reacción de transcripción).
- Incubar reacción de transcripción inversa durante 2 horas a 37 ° C.
- Para confirmar reacción, ejecutar 1 l de la reacción de transcripción en un 1% de agarosa / TAE gel. Corra el gel a 100 mVolts hasta que el colorante acaba de correr en el gel. Una banda prominente solo debe ser visible. El fragmento de ADN plantilla lineal puede ser débilmente visible en un molecu mayorlar peso.
- Añadir 1 l de RNasa libre de DNasa I a la reacción de transcripción y se incuba a 37 ° C durante 15 min.
- Para precipitado, añadir 100 ml de TE pH 8, 10 l LiCl 4 M, 300 l 100% de EtOH y se incuba a -20 ° C durante al menos 60 minutos o durante la noche.
- Centrifugado durante 10 min en una microcentrífuga de 4 º C a 14.000 rpm.
- Lave pellet con EtOH 70% y secar al aire.
- Resuspender sonda de ARN en 20 l de H 2 O. Añadir 80 l de tampón de hibridación (tampón de hibridación debe ser pre-calentado a 70 ° C). La sonda puede ser almacenado en tampón de hibridación 80% durante varios meses a -20 ° C o más, a -80 ° C.
3. Embrión Pre-tratamiento y la hibridación
- Eliminar embriones almacenados en 100% de metanol a partir de -20 ° C. Para los más pequeños embriones continúe con el paso (3,2). Para más tarde en escena etapa embriones (29/30 <) puede ver una capa de la epidermis que ha 'levantado' fuera del cuerpo del embrión. Bajo el microscopio, cuidadosamente dissejar la capa epidérmica para maximizar la penetración de la sonda.
- Coloque los embriones en viales de centelleo de vidrio limpios. Rehidratar los embriones en la serie de metanol inversa descrito anteriormente: (75%, 50%, 25% de metanol: PBT) por meciéndose suavemente cada solución para cada 5-30 min a temperatura ambiente. Rehidratación completa con dos lavados de PBT durante 10 minutos cada uno, agitando suavemente.
- Para eliminar cualquier pigmento, embriones de blanqueo con peróxido de hidrógeno al 6% en PBT durante 1 hora a temperatura ambiente, balanceo.
- Eliminar el peróxido de hidrógeno por lavado tres veces en PBT, (agitación a temperatura ambiente, 10 min cada uno).
- Tratar embriones con proteinasa K para permitir la penetración de la sonda durante la hibridación. La cantidad de proteinasa K y la duración del tratamiento depende del tejido que desea examinar y la edad del embrión. Tejido más superficial y los embriones más jóvenes requieren más corto y proteinasa K menos, mientras que los tejidos más profundos y más embriones requieren una mayor concentración y un tratamiento más largo time para permeabilizar completamente el embrión para la hibridación de la sonda. Por ejemplo, para detectar Shh en el endodermo visceral de embriones en estado de patín 29, 30 ug / ml de proteinasa K / PBT se incuba durante 20 min a temperatura ambiente.
- Rápidamente enjuague embriones en PBT para lavar proteinasa K.
- Para desactivar la proteinasa K, embriones postfix con PFA al 4%, 0,2% de glutaraldehído en PBT durante 20 min, agitando suavemente.
- Lavar dos veces durante 10 minutos con PBT.
- Para pre-hibridación, añadir 2-3 ml de solución de hibridación precalentada a los embriones, solo lo suficiente para cubrir. Oscilar suavemente en un baño de agua caliente a 70 ° C durante 1 hr.
- Para preparar la solución de hibridación, precalentar sonda de ARN a 70 º C durante 10 min y enfriar en hielo. Diluir 15-20 l de sonda de ARN a 2 ml de solución de hibridación fresco precalentado, para obtener una concentración final de 0,5-1,0 g / ml. Retire pre-Hybe y añadir diluida sonda de ARN a los embriones. Los embriones se acaba de cubrir por solución, unadd hibridación solución más si es necesario. Tapa bien segura del vial de centelleo. Hibridan meciéndose suavemente en un baño de agua caliente a 70 ° C durante la noche.
4. Publica Lava hibridación y la hibridación de anticuerpos
- Elimine la solución de hibridación con la sonda de embriones y póngalas en un vial de centelleo fresco o un tubo Eppendorf. La sonda puede ser almacenado a -20 ° C y reutilizado en el futuro. Para lavados post-hibridación, los embriones lugar en un Netwell sentado en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos.
- Lavar 3 veces durante 30 minutos cada uno en pre-calentado Solución n º 1, agitación a 70 ° C.
- Lavar 3 veces durante 30 minutos cada uno en pre-calentado Solución # 2, mecedora a 70 ° C.
- Lavar 3 veces durante 5 min cada uno en TBST, balanceo a temperatura ambiente.
- Pre-bloque con suero de oveja 10% inactivado por calor en TBST durante 1 hora, meciéndose a temperatura ambiente.
- Transferencia de embriones Netwell a un vial de centelleo de vidrio fresco. Agregar anti-DIGFragmentos Fab (1:5.000) en suero de oveja 1% inactivado por calor / TBST a los embriones. Roca durante la noche a 4 ° C.
5. La hibridación del anuncio anticuerpos Lava
- Retire y deseche el anticuerpo. Vuelva a colocar los embriones en Netwell para lavados.
- Lavar 3 veces durante 5 minutos cada uno en TBST, meciendo a temperatura ambiente
- Lavar al menos 6 veces durante 1 hora cada uno, balanceo a temperatura ambiente.
- Lave toda la noche en TBST, meciendo a 4 ° C. A medida que los lavados posteriores de anticuerpos ayudar a reducir la tinción de fondo, maximizando el número y la duración de los lavados es preferible. Los embriones son rutinariamente lavó en TBST a 4 º C, durante el fin de semana.
6. La detección de la sonda
- Maquillaje solución NTMT fresco y esterilizar por filtración.
- Desechar la solución TBST lavado y embriones lugar en un vial de centelleo de vidrio limpio. Lavar 3 veces en embriones NTMT fresco durante 10 min cada uno a temperatura ambiente, balanceo.
- Retire NTMT lavar y agregar la mezcla de reacciónde 1 x NBT / BCIP en 1 x NTMT. Como estos reactivos son sensibles a la luz, cubrir vial de centelleo en papel de aluminio y roca a temperatura ambiente.
- Monitorear reacción de color cada 15 minutos hasta que la expresión del gen deseado es claramente visible. Sondas fuertes pueden tomar tan poco como 10 minutos para desarrollarse. Sondas débiles pueden tomar 1-2 horas. No permita que la reacción vaya por mucho tiempo o tinción de fondo comenzará a aparecer (todo el embrión comienza a tomar un color opaco púrpura o marrón).
- Lavar dos veces durante 10 minutos en cada una de PBT a temperatura ambiente, balanceo.
- Postfix embriones en paraformaldehído al 4%, 0,1% de glutaraldehído durante 1 hora a temperatura ambiente. Los embriones pueden ser almacenar indefinidamente en fijador a 4 º C.
- Visualice embriones con un microscopio binocular de disección. Para producir una luz de fondo azul para las fotos, embriones Coloque en un plato con pre-endurecido agarosa al 1% / PBS.
7. Resultados representativos para Mount I. Todo el ARN de hibridación in situ en los elasmobranquios marinos
Montaje ARN toda la expresión in situ 's que representa de Sonic hedgehog (Shh) y HOXA13 en embriones de patín se muestra en la figura 1. La expresión de Shh en los vertebrados superiores se encuentra en la notocorda y endodermo visceral y este patrón de expresión se conserva en el patín (Figura 1a) 8,9. Elasmobranquios marinos tienen un método único de osmorregulación que utiliza la glándula rectal a las sales secretan. HOXA13 expresión es alta en el desarrollo de la glándula rectal (Figura 1b) 10. HOXA13 producto génico papel en la morfogénesis de la glándula rectal sigue siendo desconocido.
II. Inclusión en parafina y seccionar los tejidos Elasmobranquios
1. Cosecha y Preparación de tejido
- Diseccionar el tejido deseado y se fijan en formalina al 10% durante 24-48 horas, meciéndose a temperatura ambiente. 4% de paraformaldehído (PFA) también puede ser utilizado como fijador(Ver Discusión).
- Lavar fijador por lavado en PBS, 3 veces durante 30 minutos cada uno. Dependiendo del tamaño del tejido, tiempos de lavado se puede reducir a 10 min o mayor a 1 hr.
- Deshidratar embriones por lavado en una serie de etanol de 25%, 50% y 75% de etanol: PBS balanceo a temperatura ambiente. Una vez más, el tiempo para cada lavado dependerá del tamaño del tejido. Para 0,5 cm 3 de tejido, incubar cada lavado durante 15 min. Aumentar el tiempo para grandes piezas. Si el almacenamiento a largo plazo del tejido que se desea, lavar un adicional de dos veces en etanol al 75% y almacenar a -20 ° C durante hasta un año. De lo contrario proceder al siguiente paso.
- Además deshidratar por lavado 3 veces en 100% de etanol durante 15 min cada uno, balanceo.
2. Inclusión en parafina y seccionamiento
- Aclarar el tejido mediante el lavado 2 veces en xileno durante 5 minutos cada una en viales de centelleo de vidrio con tapas a rosca. Xileno hará que el tejido frágil, así que no excedan de un total de 10 minutos para la erahes. El tejido translúcido debe buscar cuando se lo sostiene contra la luz. Si el tejido es todavía muy opaco después de los dos lavados, hacer un lavado adicional en xileno durante 5 min y luego proceder con el protocolo. Sólo manejar xileno dentro de una campana de humos con guantes.
- Retire xileno y llenar el vial de centelleo de 2/3 partes con parafina derretida. Incubar en un horno a 60 º C durante 30 min. Al poner parafina en el vial, te darás cuenta de que la parafina se solidifique a lo largo de los lados del vial. Colocar el vial en el horno y permitir que la parafina para volver a disolver durante unos minutos. Tome el vial fuera del horno y dar a la solución un remolino para mezclar rápida y sustituir en el horno durante el resto de la incubación.
- Parafina Repetir dos veces más las incubaciones durante 30 min.
- Incubar en parafina dos veces durante una hora cada uno. Cambiar parafina por última vez y se incuba durante la noche en la estufa a 60 º C.
- El día siguiente, colocar el tejido en una cámara de parafina baño caliente y se coloca bajo vacío durante 2-3 hr. Esto facilitará la infiltración de parafina en el tejido y eliminar las burbujas de aire. Para algunos tipos de tejido delgado, un paso de vacío puede no ser necesario, pero es necesario que los embriones enteros o del tracto digestivo y otros órganos con compartimentos luminal.
- Después de vacío facilita la infiltración de tejido tejido lugar, en un molde metálico con parafina derretida, y enfriar sobre una placa de hielo. Deja en hielo oa 4 ° C durante la noche antes de tratar de eliminar el tejido del molde. Los bloques de parafina de tejido pueden ser almacenadas indefinidamente a 4 ° C.
- Colocar un bloque de parafina en un micrótomo y cortar secciones 8 micras. Las secciones deben ser flotados en un baño de agua a 48 ° C y se montaron en portaobjetos de vidrio Superfrost Plus *.
- Diapositivas en seco durante la noche en un horno de 37 ° C.
- Secciones se almacena a 4 ° C hasta su utilización.
III. Alcian Blue / Red Fast tinción nuclear de tejido Elasmobranquios
1. Alcian Blue Stain para mucinas
- Lugar desliza hacia arriba con secciones en una diapositiva más cálido. Derretir durante 45 min.
- Lugar se desliza dentro de un soporte de diapositivas. Todas las soluciones resultantes están contenidas en las tinas dentro de una campana de humos. Las diapositivas se lavan mediante la transferencia de una bañera con una solución a otra. Asegúrese de que los niveles de solución en las tinas cubre las diapositivas, los tejidos de las diapositivas están completamente sumergidos. Disolver parafina por lavado diapositivas 2 veces en xileno durante 5 min cada uno.
- Lavar los portaobjetos dos veces con 100% de etanol durante 1 min cada uno.
- Rehidratar diapositivas en una serie de etanol (75%, 50%, 25% de etanol) de lavado en cada solución durante 1 min. Lave en dH 2 O durante 1 min.
- Teñir con solución de Azul de Alcian, pH 2,5 durante 15 min.
- Desarrollar mancha por el lavado en agua corriente durante 3 min. Sumerja una vez en dH 2 O.
- Contratinción nuclear en solución rápida Contratinción Red durante 10 min.
- Lavar con agua corriente durante 3 minutos y sumergir en dH 2 O la vez.
- Dehymonohidrato en una serie de etanol (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) para 20 inmersiones cada uno, o 1 min cada uno. Lavar 2 veces en xileno durante 5 min cada uno. Montar con DPX medio de montaje y cubreobjetos. Permitir medio de montaje para secar y endurecer durante 48 horas en la campana de humos antes de manipular las diapositivas.
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Representative Results
Ejemplos de tinción con azul Alcian en diferentes regiones de la L. tracto digestivo erinacea se muestra en la Figura 2. Mucina ácida que contiene células globlet son claramente visibles por el azul alcián mancha en todo el tracto digestivo. La distribución de las mucinas ácidas difiere en las diferentes regiones del tracto digestivo, lo que refleja las diferencias en la función. Mucinas ácidas están escasamente produce en el intestino espiral y cloaca, mientras que una alta concentración de mucinas ácidas se detectan en el intestino distal (compárese con la figura 2a y 2c con 2b).
| PBT | 1 x PBS |
| 0,1% de Tween-20 | |
| Filtrar a esterilizar en Nalgene unidades de tipo de cultivo de tejidos de filtro. | |
| 20 x SSC, pH 4,5 </ Td> | 3 M NaCl |
| 0,3 M citrato de Na | |
| Ajustar el pH con ácido cítrico. | |
| Solución de hibridación | 50% de formamida |
| 1,3 x SSC, pH 4,5 | |
| 5 mM EDTA, pH 8 | |
| 50 mg / ml tRNA | |
| 0,2% de Tween-20 | |
| Chaps 0,5% | |
| 100 mg / ml de heparina | |
| Dividir en partes alícuotas y se almacena a -20 ° C durante un máximo de un año. | |
| Proteinasa K | 10 mg / ml de solución madre |
| 20 alícuotas a 0,5 mu l Eppendorf-como los tubos y se almacena a -20 ° C. | |
| Solución # 1 | 50% de formamida |
| 1,3 x SSC, pH 4,5 | |
| 0,2% de Tween-20 | |
| Almacenar a -20 ° C | |
| Solución # 2 | 50% de formamida |
| 1 x SSC, pH 4,5 | |
| 0,2% de Tween-20 | |
| Almacenar a -20 ° C | |
| Suero de oveja | Inactivar por calor a 55 ° C durante 1 hora, y almacenar en alícuotas a -20 ° C. |
| 10 x TBS | 80 g de NaCl |
| 2 g de KCl | |
| 250 ml, 1 M Tris-HCl, pH 7,5 | |
| Añadir agua hasta 1 L | |
| 1 x TBST | 1 x TBS |
| 0,1% de Tween-20 | |
| NTMT | 100 mM NaCl |
| 100 mM Tris-HCl, pH 9,5 | |
| </ Td> | 50 mM MgCl 2 |
| 0,1% de Tween-20 | |
| Hacer aproximadamente 100 ml fresco antes de usar y el filtro. | |
| 200 x NBT acciones | 50 mg / ml de NBT en 70% de formamida de dimetilo |
| Almacenar en -20 ° C en alícuotas de 1 ml. | |
| 200 x BCIP acciones | 25 mg / ml en agua BCIP |
| Almacenar en -20 ° C en alícuotas de 1 ml. |
Tabla 1. ARN de todo el montaje soluciones in situ.
| Plásmido linealizado | 8 l |
| 10 x tampón de transcripción | 4 l |
| DIG-UTP mezcla de nucleótidos | 2 l |
| Inhibidor de RNasa | 0,5 l |
| ARNpolimerasa (SP6, T3 o T7) | 1 l |
| RNasa libre de H 2 0 estéril | 4,5 l |
| Volumen total | 20 l |
Tabla 2. La reacción de transcripción para generar ARN sonda.
Figura 1. Shh y HOXA13 expresión en embriones Leucoraja Erinacea son visualizados por la montura de ARN total de hibridación in situ. (A) la expresión de Shh se detecta en un embrión en etapa de patín 29. (A ') a mayor aumento de (a) revela la expresión de Shh en la endodermo notocorda (puntas de flecha) y el intestino (flechas). (b) HOXA13 exdepresión se localiza en la glándula rectal (flecha) de un embrión en la fase patín 29 (b ') tracto diseccionado digestivo del embrión en (b) demuestra la especificidad de la expresión del transcrito HOXA13 a la glándula rectal e, endodermo;.. n, notocorda ;. rg, glándula rectal Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 2. Distribución de ácidos células caliciformes productoras de mucina en el tracto digestivo números patín. (A, c) bajos de ácidos células caliciformes productoras de mucina son detectados por el azul alcián mancha en el intestino en espiral y de la cloaca, respectivamente (flechas). (B)El intestino distal contiene una mayor densidad de ácidos células caliciformes mucina (flechas). En todos los paneles, los núcleos son claramente visibles por el rojo nuclear rápido mancha. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Discussion
Los protocolos presentados son métodos clásicos para el seguimiento de la expresión génica y la identificación de tipos de células diferenciadas, y se han adaptado para su uso en los elasmobranquios marinos. Las modificaciones adicionales de estos protocolos puede ser necesaria para adaptarse a las diferentes especies de elasmobranquios.
La preocupación más común con respecto montaje ARN total in situ 's es el riesgo de contaminación de ARNasa y de ese modo la degradación de la sonda de ARN y mensajes endógenos. Dos aspectos deben ser considerados: la síntesis de la ribosonda y su hibridación a los mensajes embrionarias, y técnicas generales para el manejo de ARN. En general, la contaminación por ribonucleasas se puede evitar mediante el uso de material de plástico de los envases sin abrir, y cristalería previamente no utilizada. Si el nuevo material de vidrio no está disponible, el tratamiento de toda la cristalería con RNasa-AWAY (VWR # 17810-491). Los lavados se hacen vertiendo suavemente fuera de soluciones a través de una cuchara perforada y la adición de solución fresca al vial.Alternativamente, los embriones muy pequeños u órganos / tejidos se pueden colocar en un Netwell que encaja en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos. El tejido puede ser movido de una solución a la siguiente simplemente levantando el Netwell de un pozo a otro. Esto ayuda a evitar la pérdida de cualquier tejido mediante el vertido, y también conserva la arquitectura del tejido. Sugerencias adicionales para el manejo de ARN y la prevención de la contaminación RNasa se pueden encontrar en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, y en varios sitios web farmacéuticos, incluyendo Roche ( http://www.roche-applied-science.com/labfaqs/p2_1.htm ) 11 .
Generación de la sonda de ARN y de tratamiento previo y la hibridación de los embriones son los pasos más vulnerables a la contaminación por ribonucleasas. Sondas de ARN antisentido que complementan transcrito de ARNm nativo son sintetizados por transcripción inversa en vitro en el presencia de digoxigenina-UTP. Brevemente, los plásmidos de ADNc se linealiza con una enzima de restricción único cuyo sitio está situado en el extremo 5 'del gen. Esto permite que la ARN polimerasa a caer en el extremo del gen. Elija una polimerasa de ARN mediante la identificación del promotor de ARN polimerasa disponibles en el plásmido, justo 3 'al codón de parada. Mientras RNA polimerasas T3 y T7 se utilizan a menudo para pBluescript, SP6 es la elección de genes subclonados en los plásmidos pGEM direccionales. Además de inhibidor de RNasa, agua tratada con DEPC se utiliza en la reacción de transcripción y la purificación de la sonda. Solución de hibridación y pasos usando PBT en el pre-tratamiento de embriones de todo se debe hacer con agua DEPC. Para tratamiento de agua DEPC, añadir 1 ml de DEPC a 1 L de agua en un matraz grande y mezclar bien. Dejar toda la noche en una campana y autoclave el día siguiente. Soluciones tales como 10 x PBS y SSC también se puede hacer con agua tratada con DEPC. Después de la hibridación con la ribosonda, el uso de RNasa libre de por loluciones y precauciones similares ya no son necesarios.
Las variables adicionales a considerar son la concentración y la duración de tratamiento con proteinasa K, que pueden afectar a la penetración de la sonda. Un ajuste cuidadoso de la población de proteinasa K se recomienda para optimizar el tiempo de tratamiento para diferentes etapas embrionarias. El protocolo descrito aquí se ha utilizado con éxito y de forma rutinaria con embriones en etapas 20 a 31 de acuerdo con Ballard 7. Para los embriones que son muy jóvenes o tejido que es particularmente "pegajosos", el detergente Tween-20 puede ser reemplazado con Triton-X. Además, de genes específicos de modificaciones en el protocolo puede ser necesaria dependiendo de la abundancia de transcripción. Para reducir el fondo, 10% de dimetilformamida ha sido rutinariamente a la solución de desarrollo (NTMT) por varios grupos 12.
En contraste con la naturaleza sensible de ARN in situ 's, la alegría de la histología es quees rápido y bastante infalible! Cualquier variabilidad en la tinción es probable debido a la fijación insuficiente. Para asegurar que el tejido está totalmente fijado, se recomienda que los tejidos muy grandes (tales como el tracto digestivo de un animal adulto) ser diseccionado en trozos más pequeños y la solución de fijador fresco reemplazados cada 10 horas durante un período de 48 horas. Puede ser necesario optimizar las condiciones para la fijación, tanto de tejidos menores y mayores de fijo puede resultar en pobres seccionamiento o tinción desigual. Además, diferentes tinciones histoquímicas funcionar de forma óptima con diferentes fijadores. Por lo tanto, vale la pena modificar el fijador de acuerdo con la tinción histoquímica utilizado 13. Paraformaldehído al 4%, se recomienda la fijación de los órganos de tejidos blandos o embriones jóvenes. Para mayores embriones o animales enteros, 10% de formalina se prefiere. Una vez que el tejido es embebido en parafina y se seccionaron, se puede utilizar para múltiples propósitos, incluyendo ARN en s situ '. Esto permite la resolución de la expresión génica en el celular level. Alternativamente, las secciones pueden ser teñidas con diferentes tinciones histoquímicas para identificar los tipos celulares diferenciados.
El alcian azul y tinción con rojo nuclear rápido se ha realizado con éxito en el skate (Leucoraja erinacea), cazón (Squalas acanthias), lampreas (Myxine glutinosa) y la lamprea (Petromyzon marinus), (resultados no publicados) 10,14. Además del pH azul alcián 2,5 mancha se describe aquí, la modificación del pH de la solución de azul de Alcian puede distinguir mucosaccharides diferentes (es decir, sialo-versus sulfomucins) 13. Diferentes constituyentes mucosaccharide pueden distinguir las células caliciformes por función y localización en el tracto digestivo 15,16. Alcian mancha azul en el tracto digestivo se ha utilizado para diagnosticar condiciones tales como el esófago de Barrett y para mejorar la tinción de células pancreáticas beta-gránulos 17,18.
En sumamary, histoquímica y ARN de todo el montaje in situ 's cuando se usan juntos puede conducir a una mejor comprensión de la relación entre un gen que se expresa durante el desarrollo y el tipo de célula diferenciada resultante. Expresión de los genes Hox posterior se ha relacionado con la especificación de las células caliciformes de ácido mucina en el tracto digestivo el desarrollo 10,19. Aquí un ejemplo de la expresión de Shh y un gen Hox junto con la presencia de células caliciformes ácido productoras de mucina en la L. erinacea tracto digestivo. Estas técnicas pueden ser ampliamente aplicada a diferentes especies de elasmobranquios, diferentes genes del patrón de desarrollo y diferentes tinciones histológicas. La aplicación continua y la adaptación de técnicas para elasmobranquios marinos es importante para mantener el ritmo con el amplio uso de estos animales para los modelos de investigación biomédica en la fisiología, la endocrinología, la toxicología y la genómica.
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Disclosures
No tengo nada que revelar.
Acknowledgments
Me gustaría dar las gracias a los muchos estudiantes universitarios que han trabajado en mi laboratorio y ha contribuido a la evolución de estos protocolos. NAT ha recibido el apoyo de la Red de Skidmore-Union, un proyecto creado con un avance NSF PAGADO subvención.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. | |||
References
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