Summary
Grazie alla combinazione di metodi di montaggio RNA tutto
Abstract
Elasmobranchi Marine sono valutati modelli animali per studi biomedici e genomica in quanto sono i vertebrati più primitivi di avere l'immunità adattativa e hanno meccanismi unici per osmoregolazione 1-3. Come le più primitive di vita ganasce-vertebrati con appendici appaiate, elasmobranchi sono un modello evolutivamente importante, soprattutto per gli studi in evoluzione e sviluppo. Elasmobranchi marini sono stati utilizzati anche per studiare tossicologia acquatica e fisiologia dello stress in relazione a 4 dei cambiamenti climatici. Pertanto, lo sviluppo e l'adeguamento delle metodologie è necessario per agevolare ed estendere l'uso di questi vertebrati primitivi a più discipline biologiche. Qui presento l'adattamento di successo del monte RNA tutto ibridazione in situ e tecniche istologiche per lo studio dell'espressione genica e cellulare in istologia elasmobranchi.
Controllo dell'espressione genica è uno strumento di sviluppo segno distintivo di biologists, ed è ampiamente utilizzato per studiare i processi di sviluppo 5. Mount RNA tutto ibridazione in situ permette la visualizzazione e la localizzazione di trascritti del gene specifici nei tessuti dell'embrione in via di sviluppo. Il pattern di espressione del messaggio di un gene in grado di fornire indicazioni su ciò che i processi di sviluppo e le decisioni sul destino delle cellule un gene può controllare. Confrontando il pattern di espressione di un gene in differenti stadi di sviluppo, intuizione può essere ottenuto in quanto il ruolo di un gene cambia durante lo sviluppo.
Mentre mount intero in situ 's fornisce un mezzo per localizzare l'espressione genica di tessuti, tecniche istologiche consentire l'identificazione di tipi di cellule differenziate e tessuti. Macchie istologiche hanno funzioni diverse. Macchie generale sono utilizzati per evidenziare la morfologia cellulare, ad esempio ematossilina ed eosina generale per la colorazione dei nuclei e citoplasma, rispettivamente. Altre colorazioni può evidenziare cella specificatipi. Per esempio, il blu Alcian macchia riportati in questo documento è una macchia ampiamente utilizzato per identificare mucosaccharides cationico. Colorazione del tubo digerente con Alcian blue possibile identificare la distribuzione di cellule caliciformi che producono mucosaccharides. Le variazioni intervenute nel perimetro mucosaccharide su brevi peptidi distinguere le cellule caliciformi per funzione all'interno del tubo digerente 6. Utilizzando mount intero RNA in situ metodi 's istochimiche e contemporaneamente, decisioni destino cellulare può essere collegato al gene-specifico espressione.
Anche se RNA in situ 's e istochimica sono ampiamente utilizzati dai ricercatori, il loro adattamento e l'uso in elasmobranchi marini hanno incontrato un successo limitato e varia. Qui presento i protocolli sviluppati per elasmobranchi e utilizzato su base regolare nel mio laboratorio. Sebbene ulteriore modifica delle RNA ibridazione in situ metodo 's può essere necessaria per adattarsi a diverse specie, i protocolli descritti qui provide un punto di forza di partenza per i ricercatori che desiderano adattare l'uso di elasmobranchi marini alle loro domande scientifiche.
Protocol
I. RNA Mount tutto ibridazione in situ in Elasmobranchi Marine
1. Embrione Fissazione e preparazione
- Skate embrioni può essere messo in scena secondo Ballard 7. Stadi ottimali per il rilevamento di espressione genica dipende dal tessuto di interesse. Per tenere traccia di espressione genica nel tratto digestivo pattino, le fasi 27-30 sono ottimali 7.
- Dissect embrioni in PBS, separando gli embrioni dal sacco vitellino.
- Fissare in 30 ml di appena fatta paraformaldeide 4% (PFA) in una provetta da 50 ml a 4 ° C con gentile dondolio. Fix per 24 ore.
- Lavare embrioni in PBT, due volte per 15 min, rotazione a temperatura ambiente. Tutte le ricette di soluzioni per il montaggio in situ di RNA intero 's sono inclusi (Tabella 1).
- Disidratare embrioni mediante lavaggio in una serie di metanolo 25%, 50% e 75% metanolo: PBT dondolo a temperatura ambiente. La durata dei lavaggi dipende dallo stadio degli embrioni. Per la pre-neurulation scena embrioni, 5 min di ogni lavaggio nella serie metanolo è sufficiente. Per gli embrioni più vecchi di fase 30, lavaggi possono durare fino a 30 minuti. Per determinare se gli embrioni sono sufficientemente penetrato e acclimatati per ogni lavaggio, tenere il tubo in posizione verticale in mano. Se gli embrioni si depositano sul fondo del tubo, allora siete pronti per il lavaggio successivo. Se gli embrioni a galla della soluzione, cambiare la soluzione e ripetere questo passo particolare disidratazione.
- Lavare due volte in metanolo 100% per 10 minuti agitando lentamente.
- Una volta disidratati al 100% metanolo, embrioni devono essere conservati a -20 ° C per almeno 24 ore prima di procedere con il protocollo. Gli embrioni sono stati correttamente conservati a -20 ° C ed utilizzato per montature RNA intero fino a 1 anno.
2. Sintesi di RNA Probe
- Generare un frammento lineare del gene la cui espressione si desidera rilevare. Ciò può essere fatto mediante amplificazione PCR o linearizzare un plasmide con il genedi interesse. Per amplificare mediante PCR, primer scegliere il cui legame siti fiancheggiano il gene inserire e conservare i siti di legame di RNA polimerasi della regione amplificata. Per i plasmidi di uso comune come PBS o pGEM, M15 in avanti e reverse primer sono l'ideale. In alternativa, linearizzare un plasmide mediante digestione 15 microlitri di DNA QIAGEN miniprep con un enzima che scinde alla estremità 5 'del gene. Gel estrarre e purificare con l'apposito kit QIAquick.
- Invertire trascrivere RNA utilizzando la sonda 8 microlitri di plasmide lineare o 100 ng del prodotto di PCR come modello utilizzando la RNA polimerasi appropriata (vedi Tabella 2 per reazione di trascrizione).
- Incubare la reazione di trascrizione inversa per 2 ore a 37 ° C.
- Per confermare la reazione, eseguire 1 microlitri della reazione di trascrizione su un 1% di agarosio / TAE gel. Esegui gel a 100 mVolts fino a quando il colorante ha appena incontrato il gel. Una singola banda di primo piano dovrebbe essere visibile. Il modello lineare frammento di DNA può essere debolmente visibili a molecolare maggiorelar peso.
- Aggiungere 1 ml di RNasi-free DNasi I per la reazione di trascrizione e incubare a 37 ° C per 15 min.
- Per precipitato, aggiungere 100 microlitri TE pH 8, 10 pl 4 M LiCl, 300 ul 100% EtOH e incubare a -20 ° C per almeno 60 minuti o per una notte.
- Spin per 10 min a 4 ° C una microcentrifuga a 14.000 rpm.
- Lavare pellet con% EtOH 70 e aria secca.
- Risospendere RNA sonda in 20 ml di dH 2 O. Aggiungere 80 ml di tampone di ibridazione (tampone di ibridazione deve essere pre-riscaldato a 70 ° C). La sonda può essere memorizzato in tampone di ibridazione 80% per diversi mesi a -20 ° C o più a -80 ° C.
3. Embrioni pre-trattamento e ibridazione
- Rimuovere embrioni conservati in metanolo 100% da -20 ° C. Per i più piccoli embrioni procedere con il passo (3.2). Per la successiva fase di messa in scena embrioni (29/30 <) si può visualizzare un strato di epidermide che si e 'tolto' dal corpo dell'embrione. Sotto il microscopio, con attenzione dissect lo strato epidermico per massimizzare la penetrazione della sonda.
- Embrioni Luogo in fiale di vetro puliti scintillazione. Reidratare gli embrioni della serie metanolo inverso descritto sopra: (75%, 50%, 25% metanolo: PBT) agitando delicatamente ogni soluzione per ogni 5-30 min a temperatura ambiente. Reidratazione completa con due lavaggi di PBT per 10 minuti ciascuno, delicatamente a dondolo.
- Per rimuovere qualsiasi pigmento, embrioni candeggina con perossido di idrogeno al 6% in PBT per 1 ora a temperatura ambiente, dondolo.
- Rimuovere perossido di idrogeno mediante lavaggio tre volte in PBT, (dondolo a temperatura ambiente, 10 min ciascuna).
- Trattare embrioni con proteinasi K per consentire la penetrazione della sonda durante l'ibridazione. La quantità di proteinasi K e la durata del trattamento dipende dal tessuto che si desidera esaminare e l'età dell'embrione. Tessuti più superficiali e più giovani embrioni richiedono K più breve e meno proteinasi, mentre i tessuti più profondi e più embrioni richiedono una maggiore concentrazione e un trattamento più lungo time al permeabilize pienamente l'embrione per l'ibridazione della sonda. Per esempio, per rilevare Shh nella endoderma dell'intestino di fase 29 embrioni skate, 30 ug / ml di proteinasi K / PBT viene incubata per 20 min a temperatura ambiente.
- Rapidamente il risciacquo embrioni in PBT per lavare via proteinasi K.
- Per disattivare proteinasi K, embrioni postfix con 4% PFA, 0,2% glutaraldeide in PBT per 20 minuti, delicatamente a dondolo.
- Lavare due volte per 10 minuti con PBT.
- Per la pre-ibridazione, aggiungere 2-3 ml di pre-riscaldato soluzione di ibridazione per gli embrioni, quanto basta per coprirli. Oscillare delicatamente in un bagno d'acqua riscaldata a 70 ° C per 1 ora.
- Per preparare la soluzione di ibridazione, preriscaldare RNA sonda a 70 ° C per 10 minuti e raffreddare in ghiaccio. Diluire 15-20 microlitri di RNA sonda a 2 ml di soluzione di ibridazione fresco preriscaldato, per ottenere una concentrazione finale di 0,5-1,0 mg / ml. Rimuovere pre-hybe e aggiungere diluito sonda RNA agli embrioni. Gli embrioni devono essere appena coperto da una soluzione, undd soluzione di ibridazione più se necessario. Coperchio a tenuta sicura di fiala di scintillazione. Ibridano agitando delicatamente in un bagno d'acqua riscaldata a 70 ° C per una notte.
4. Posta lavaggi di ibridazione e di ibridazione Anticorpo
- Rimuovere soluzione di ibridazione con sonda da embrioni e posto in una fiala di scintillazione fresco o provetta Eppendorf. La sonda può essere conservato a -20 ° C e riutilizzati in futuro. Per la post-ibridazione lavaggi, gli embrioni in un posto Netwell seduto in una piastra da 6 pozzetti di coltura.
- Lavare 3 volte per 30 minuti in ciascuna delle pre-riscaldato Soluzione # 1, dondolo a 70 ° C.
- Lavare 3 volte per 30 minuti in ciascuna pre-riscaldato Solution # 2, dondolo a 70 ° C.
- Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno in TBST dondolo, a temperatura ambiente.
- Pre-blocco con 10% di siero siero ovino in TBST per 1 ora, a temperatura ambiente dondolo.
- Trasferimento embrioni da Netwell in una fiala di vetro fresco di scintillazione. Aggiungi anti-DIGFrammenti Fab (1:5.000) in 1% di siero siero ovino / TBST agli embrioni. Muovere la notte a 4 ° C.
5. Anticorpo ibridazione Messaggio lava
- Rimuovere l'anticorpo e scartare. Embrioni posto nuovamente dentro Netwell per lavaggi.
- Lavare 3 volte per 5 minuti in ciascuna delle TBST, dondolo a temperatura ambiente
- Lavare almeno 6 volte per 1 ora ciascuno, dondolo a temperatura ambiente.
- Lavare pernottamento in TBST, dondolo a 4 ° C. Mentre i lavaggi post-anticorpo aiuta a diminuire la colorazione di fondo, massimizzando il numero e la durata dei lavaggi è preferibile. Gli embrioni vengono regolarmente lavati in TBST a 4 ° C, durante il fine settimana.
6. Rilevamento di sonda
- Make up soluzione fresca NTMT e filtro sterilizzare.
- Scartare la soluzione di lavaggio e gli embrioni TBST posto in un flaconcino di vetro pulito scintillazione. Lavare 3 volte in embrioni NTMT fresco per 10 min a temperatura ambiente, a dondolo.
- Rimuovere NTMT lavare e aggiungere miscela di reazionedi 1 x NBT / 1 x BCIP in NTMT. Dal momento che questi reagenti sono sensibili luce, coprire fiala di scintillazione in un foglio e roccia a temperatura ambiente.
- Monitorare la reazione colore ogni 15 min fino genica desiderata è chiaramente visibile. Sonde forti può prendere un minimo di 10 minuti per lo sviluppo. Sonde deboli può richiedere 1-2 ore. Non lasciare che la reazione andare troppo a lungo o la colorazione di fondo cominceranno a comparire (l'embrione tutto inizia a girare un colore opaco viola o marrone).
- Lavare 2 volte per 10 min in PBT a temperatura ambiente, a dondolo.
- Embrioni postfix in paraformaldeide al 4%, 0,1% di glutaraldeide per 1 ora a temperatura ambiente. Gli embrioni possono essere a tempo indeterminato in negozio di fissativo a 4 ° C.
- Visualizza embrioni con uno stereomicroscopio dissezione. Per produrre uno sfondo blu chiaro per le immagini, gli embrioni posto in un piatto con pre-temprato di agarosio all'1% / PBS.
7. Rappresentante dei risultati per Mount I. RNA totale ibridazione in situ in elasmobranchi marine
Mount RNA tutto in espressione in situ 's raffigurante di Sonic hedgehog (Shh) e HOXA13 in embrioni da skate sono illustrati nella Figura 1. L'espressione di Shh nei vertebrati superiori si trova nel endoderma notocorda e intestino, e questo pattern di espressione è conservato nel pattino (Figura 1a) 8,9. Elasmobranchi marini hanno un metodo unico di osmoregulation che utilizza la ghiandola rettale di sali secernono. HOXA13 espressione è elevata nella ghiandola sviluppo rettale (Figura 1b) 10. HOXA13 ruolo prodotto genico in patterning ghiandola rettale rimane sconosciuta.
II. Paraffina Incorporamento e sezionamento del tessuto Elasmobranch
1. Raccolta e Preparazione del tessuto
- Dissect tessuto desiderato e fissare in formalina al 10% per 24-48 ore, dondolo a temperatura ambiente. 4% paraformaldeide (PFA) può anche essere utilizzato come fissativo(Vedi Discussione).
- Lavare fissativo mediante lavaggio in PBS, 3 volte per 30 minuti ciascuno. A seconda delle dimensioni del tessuto, tempi di lavaggio può essere ridotto a 10 min o aumentata a 1 h.
- Disidratare embrioni mediante lavaggio in una serie di etanolo 25%, 50% e 75% etanolo: rocking PBS a temperatura ambiente. Di nuovo, il tempo per ogni lavaggio dipende dalla dimensione del tessuto. Per 0,5 cm 3 tessuti, incubare ogni lavaggio per 15 min. Aumentare il tempo per i più grandi pezzi. Se la conservazione a lungo termine del tessuto è desiderato, lavare ulteriori due volte in 75% etanolo e conservare a -20 ° C fino ad un anno. In caso contrario, passare alla fase successiva.
- Ulteriori disidratare mediante lavaggio 3 volte in etanolo al 100% per 15 minuti ciascuno, a dondolo.
2. Paraffina Incorporamento e sezionamento
- Chiarire con il lavaggio dei tessuti 2 volte in xilene per 5 minuti in ciascuna delle fiale di vetro con coperchio a scintillazione con tappo a vite. Xilene renderà il tessuto fragile, in modo da non superare un totale di 10 min per erahes. Il tessuto dovrebbe essere trasparente quando lo si tiene fino a una luce. Se il tessuto è ancora molto opachi dopo due lavaggi, fare un ulteriore lavaggio in xilene per 5 min e quindi procedere con protocollo. Maneggiare xilene all'interno di una cappa di aspirazione con i guanti.
- Rimuovere xilene e riempire la fiala di scintillazione in 2/3 con paraffina fusa. Incubare in un forno a 60 ° C per 30 min. Per la messa paraffina nel flaconcino, si noterà la paraffina solidifica lungo i lati della fiala. Porre la fiala in forno e consentire la paraffina di ri-sciogliere per qualche minuto. Prendere il flacone dal forno e dare la soluzione di un swirl resoconto di mescolare e sostituire in forno per la restante incubazione.
- Paraffina Ripetere incubazioni altre due volte per 30 min.
- Incubare in paraffina due volte per un'ora ciascuno. Modifica paraffina per l'ultima volta e incubare durante la notte nel forno a 60 ° C.
- Il giorno seguente, posizionare il tessuto in una camera riscaldata bagno di paraffina e posto sotto vuoto per 2-3 ore. Questo faciliterà l'infiltrazione di paraffina nel tessuto ed eliminare eventuali bolle d'aria. Per alcuni tipi di tessuto sottile, una fase di vuoto potrebbe non essere necessaria, ma è necessario che gli embrioni interi o del tratto digerente e altri organi con compartimenti luminali.
- Dopo sottovuoto facilitato infiltrazione di tessuto, tessuto posto in uno stampo metallico con paraffina fusa, e raffreddare su una piastra di ghiaccio. Lasciare in ghiaccio oppure a 4 ° C per una notte prima di cercare di rimuovere il tessuto dallo stampo. Blocchi di paraffina di tessuto può essere conservata indefinitamente a 4 ° C.
- Collocare un blocco di paraffina su un microtomo e tagliare 8 sezioni micron. Sezioni deve essere collocato in un bagno d'acqua a 48 ° C, montato su vetro * vetrini Superfrost Plus.
- Vetrini secco per una notte in un forno a 37 ° C.
- Sezioni Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
III. Alcian Blu / Nuclear Fast Red Stain of Tissue Elasmobranch
1. Alcian Blu Colorare per mucine
- Luogo scorre con sezioni rivolti verso l'alto su un vetrino più caldo. Melt per 45 min.
- Luogo scivola in un portavetrini. Tutte le soluzioni conseguenti sono contenuti in vasche all'interno di una cappa aspirante. Vetrini vengono lavati trasferendoli da una vasca con una soluzione ad un altro. Assicurarsi che i livelli di soluzione delle vasche riguarda le diapositive, i tessuti sui vetrini siano completamente immersi. Sciogliere paraffina mediante lavaggio diapositive 2 volte in xilene per 5 minuti ciascuno.
- Lavare i vetrini due volte con etanolo al 100% per 1 min ciascuna.
- Reidratare vetrini in una serie di etanolo (75%, 50%, 25% etanolo) lavaggio in ciascuna soluzione per 1 min. Lavare in dH 2 O per 1 min.
- Colorare in soluzione Alcian blu, pH 2,5 per 15 min.
- Sviluppare macchia mediante lavaggio in acqua corrente per 3 min. Immergere una volta in dH 2 O.
- Di contrasto nucleare in soluzione rapida di contrasto rosso per 10 min.
- Lavare in acqua corrente per 3 minuti e immergere in dH 2 O una volta.
- Disidratatimonoidrato in una serie di etanolo (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) per 20 tuffi ciascuno, o 1 min ciascuno. Lavare 2 volte in xilene per 5 minuti ciascuno. Montare con il mezzo di montaggio e DPX coprioggetti. Lasciare mezzo di montaggio a secco e indurire per 48 ore nella cappa prima di manipolare diapositive.
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Representative Results
Esempi di Alcian colorazione blu in diverse regioni del L. tratto digestivo erinacea sono mostrati nella Figura 2. Mucina acido contenente cellule globlet sono chiaramente visibili dal blu Alcian macchia tutto il tratto digestivo. La distribuzione di mucine acide differisce in diverse regioni del tratto digerente, riflettendo differenze nella funzione. Mucine acide sono scarsamente prodotta nell'intestino spirale e cloaca, mentre una concentrazione di mucine acide vengono rilevati nell'intestino distale (confronta figura 2a e 2c con 2b).
| PBT | 1 x PBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| Filtro-sterilizzare in unità di tessuto di tipo Nalgene cultura filtro. | |
| 20 x SSC, 4,5 pH </ Td> | 3 M NaCl |
| 0.3 M NaCitrate | |
| Aggiustare il pH con acido citrico. | |
| Ibridazione soluzione | 50% formammide |
| 1,3 x SSC, pH 4,5 | |
| 5 mM EDTA, pH 8 | |
| 50 mg / ml tRNA | |
| 0,2% Tween-20 | |
| 0,5% Chaps | |
| 100 mg / ml di eparina | |
| Aliquotare e conservare a -20 ° C per un massimo di un anno. | |
| Proteinasi K | 10 mg / ml di soluzione concentrata |
| 20 aliquote pl in 0,5 ul-Eppendorf, come tubi e congelare a -20 ° C. | |
| Soluzione # 1 | 50% formammide |
| 1,3 x SSC, pH 4,5 | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Conservare a -20 ° C | |
| Soluzione # 2 | 50% formammide |
| 1 x SSC, pH 4,5 | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Conservare a -20 ° C | |
| Siero di pecora | Inattivare mediante riscaldamento a 55 ° C per 1 ora, e conservare in aliquote a -20 ° C. |
| 10 x TBS | 80 g NaCl |
| 2 g KCl | |
| 250 ml, 1 M Tris-HCl, pH 7,5 | |
| Aggiungere acqua fino a 1 L | |
| 1 x TBST | 1 x TBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| NTMT | 100 mM NaCl |
| 100 mM Tris-HCl, pH 9,5 | |
| </ Td> | 50 mM MgCl 2 |
| 0,1% Tween-20 | |
| Fai circa 100 ml fresco prima di utilizzare e filtro. | |
| 200 x NBT magazzino | 50 mg / ml in 70% NBT dimetilformammide |
| Conservare a -20 ° C in aliquote da 1 ml. | |
| 200 x BCIP magazzino | 25 mg / ml in acqua BCIP |
| Conservare a -20 ° C in aliquote da 1 ml. |
Tabella 1. RNA monte tutto in soluzioni situ.
| Plasmide linearizzato | 8 microlitri |
| 10 buffer di trascrizione x | 4 pl |
| DIG-UTP mix nucleotide | 2 microlitri |
| RNAse inibitore | 0,5 pl |
| RNApolimerasi (SP6, T3 o T7) | 1 ml |
| RNasi-free sterile H 2 0 | 4,5 pl |
| Volume totale | 20 pl |
Tabella 2. Trascrizione reazione per generare RNA sonda.
Figura 1. Shh e HOXA13 espressione in embrioni Leucoraja erinacea sono visualizzati per intero monte RNA ibridazione in situ. (A) Shh espressione viene rilevata in un embrione in fase pattino 29. (A ') ingrandimento maggiore di (a) rivela Shh espressione nella notocorda (punte di freccia) e intestinale endoderma (frecce). (b) HOXA13 expressione è localizzato alla ghiandola rettale (freccia) di un embrione stadio 29 pattino (b ') del tubo digerente Dissected dall'embrione in (b), dimostra la specificità di espressione HOXA13 trascritto alla ghiandola rettale e, endoderma,.. n, notocorda ,. rg, ghiandola rettale Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Distribuzione di acidi mucina cellule produttrici calice nel tratto digestivo pattino. (A, c) Basso numero di acidi mucina producono cellule caliciformi vengono rilevati dal blu Alcian macchia nell'intestino spirale e cloaca, rispettivamente (frecce). (B)L'intestino distale contiene una maggiore densità di cellule caliciformi acide mucina (frecce). In tutti i pannelli, i nuclei sono ben visibili dal rosso nucleare fast macchia. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
I protocolli presentati sono i metodi classici per monitorare l'espressione genica e di individuare i tipi di cellule differenziate, ed è stato adattato per l'uso in elasmobranchi marini. Ulteriori modifiche di questi protocolli possono essere necessarie per adattarsi alle diverse specie di elasmobranchi.
Il problema più comune relativa montatura intera RNA in situ 's è il rischio di contaminazione RNasi e quindi la degradazione della sonda RNA e messaggi endogeni. Due aspetti devono essere considerati: la sintesi del ribosonda e la sua ibridazione ai messaggi embrionali, e le tecniche generali di gestione RNA. In generale, la contaminazione da ribonucleasi può essere evitato utilizzando plasticware da contenitori chiusi, e bicchieri precedentemente non utilizzato. Se il nuovo vetro non è disponibile, il trattamento di tutta la vetreria con RNasi-AWAY (VWR # 17810-491). I lavaggi sono fatte con delicatezza travaso soluzioni attraverso un mestolo forato e l'aggiunta di soluzione fresca al flaconcino.In alternativa, gli embrioni molto piccole o organi / tessuti può essere collocato in un Netwell che si inserisce in un 6-ben piatto di coltura di tessuti. Il tessuto può essere spostato da una soluzione all'altra semplicemente sollevando il Netwell da un pozzetto all'altro. Questo aiuta a prevenire la perdita di qualsiasi tessuto versando, e conserva anche l'architettura del tessuto. Ulteriori suggerimenti per la movimentazione RNA e prevenire la contaminazione RNasi può essere trovato in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, e su diversi siti farmaceutici, compresi Roche ( http://www.roche-applied-science.com/labfaqs/p2_1.htm ) 11 .
Generazione della sonda RNA e pre-trattamento e ibridazione di embrioni sono i passi più vulnerabili alla contaminazione da ribonucleasi. Sonde di RNA antisenso che completano trascritto nativo mRNA sono sintetizzati mediante trascrizione inversa vitro nel presence di digossigenina-UTP. Brevemente, plasmidi cDNA linearizzato con un enzima di restrizione unico cui sito si trova alla estremità 5 'del gene. Ciò consente la RNA polimerasi a cadere alla fine del gene. Scegliere un RNA polimerasi identificando il promotore della RNA polimerasi disponibili nel plasmide, solo 3 'al codone di stop. Mentre T3 e T7 RNA polimerasi sono spesso utilizzati per pBluescript, SP6 è la scelta per geni subclonato nel plasmide pGEM direzionali. Oltre a RNasi inibitore, l'acqua trattata con DEPC viene utilizzato nella reazione di trascrizione e purificazione della sonda. Soluzione di ibridazione e passi mediante PBT nel pre-trattamento di embrioni dovrebbero essere fatto con acqua DEPC. Per il trattamento di acqua DEPC, aggiungere 1 ml di DEPC a 1 L di acqua in un pallone di grandi dimensioni e mescolare bene. Lasciar riposare in un cappuccio e sterilizzare in autoclave il giorno successivo. Soluzioni come PBS 10 x SSC e possono essere realizzati anche con acqua trattata con DEPC. Dopo ibridazione con la ribosonda, l'uso di RNase-free, quindiluzioni e precauzioni simili non sono più necessarie.
Ulteriori variabili da prendere in considerazione sono la concentrazione e la durata del trattamento con proteinasi K, che può influenzare la penetrazione della sonda. Una titolazione attenta del magazzino proteinasi K è consigliato per ottimizzare il tempo di trattamento per i diversi stadi embrionali. Il protocollo qui descritto è stato regolarmente e utilizzato con successo con embrioni in fasi 20-31 secondo Ballard 7. Per gli embrioni che sono molto giovani o per tessuti particolarmente "appiccicoso", il detergente Tween-20 può essere sostituito con Triton-X. Inoltre, gene-specifiche modifiche al protocollo può essere necessario a seconda della abbondanza di trascrizione. Per ridurre fondo, 10% dimetilformammide è stato regolarmente aggiunto alla soluzione di sviluppo (NTMT) da diversi gruppi 12.
In contrasto con la natura sensibile di RNA in situ 's, la gioia di istologia è cheè veloce e abbastanza infallibile! Qualsiasi variabilità nella colorazione è probabilmente dovuto alla fissazione inadeguata. Per garantire che il tessuto sia completamente fissato, si raccomanda di tessuti molto grandi (come il tratto digestivo di un animale adulto) essere sezionati in pezzi più piccoli e fresca soluzione fissativa sostituito ogni 10 ore per un periodo di 48 ore. Può essere necessario per ottimizzare le condizioni di fissaggio, sia tessuti sotto e sopra-fissa può causare sezionamento scarsa o colorazione irregolare. Inoltre, diverse macchie istochimiche lavorare in modo ottimale con i fissativi diversi. Pertanto, è opportuno modificare il fissativo secondo la macchia istochimica utilizzato 13. Paraformaldeide al 4% è consigliato in sede di fissazione dei tessuti molli organi o embrioni giovani. Per i più grandi embrioni o animali interi, formalina al 10% è preferito. Una volta che il tessuto è paraffina e sezionati, esso può essere utilizzato per diversi scopi, tra cui RNA in situ s '. In questo modo per la risoluzione dell'espressione genica sul cellulare level. In alternativa, le sezioni possono essere colorate con diverse macchie istochimiche per identificare i tipi di cellule differenziate.
Il Alcian blu e colorazione nucleare veloce rosso è stato eseguito con successo nel pattino (Leucoraja erinacea), gattuccio (acanthias Squalas), Myxinidae (Myxine glutinosa) e lampreda (Petromyzon marinus), (risultati non pubblicati) 10,14. Oltre al pH Alcian blue 2,5 macchia qui descritta, modificando il pH della soluzione Alcian blue possono distinguere mucosaccharides differenti (cioè sialo-contro sulfomucins) 13. Costituenti mucosaccharide diversi in grado di distinguere le cellule caliciformi per funzione e la localizzazione all'interno del tubo digerente 15,16. Alcian blue macchia nel tratto digestivo è stato usato per diagnosticare malattie come l'esofago di Barrett e per migliorare la colorazione delle cellule beta pancreatiche granuli 17,18.
In sommamary, istochimica e RNA montaggio intero in situ 's quando utilizzato insieme possono portare ad una migliore comprensione del legame tra cui un gene è espresso durante lo sviluppo e il tipo risultante cellula differenziata. Espressione dei geni Hox posteriori è stata collegata alla specifica delle cellule mucina acido calice nel tratto digestivo di sviluppo 10,19. Qui un esempio di espressione di Shh e un gene Hox insieme alla presenza di acido mucina producono cellule caliciformi nella L. erinacea tratto digestivo. Queste tecniche possono essere ampiamente applicato a diverse specie di Elasmobranchi, diversi geni patterning di sviluppo e delle diverse macchie istologiche. L'applicazione continua e l'adattamento di tecniche per elasmobranchi marini è importante per tenere il passo con l'ampio utilizzo di questi animali per i modelli di ricerca biomedica in fisiologia, endocrinologia, tossicologia e la genomica.
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Disclosures
Non ho nulla da rivelare.
Acknowledgments
Desidero ringraziare i molti studenti universitari che hanno lavorato nel mio laboratorio e ha contribuito all'evoluzione di questi protocolli. NAT ha ricevuto il sostegno del Skidmore-Union Network, un progetto stabilito con un ANTICIPO PAGATO NSF sovvenzione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. | |||
References
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