Summary
من خلال الجمع بين أساليب جبل RNA كله
Abstract
وتقدر قيمة elasmobranchs النماذج الحيوانية البحرية للدراسات الطب الحيوي والجينومية لأنها هي الفقاريات الأكثر بدائية لديهم مناعة التكيفية ولها آليات فريدة من نوعها لتنظيم التناضح 1-3. كما الفقاريات الفكية-المعيشة الأكثر بدائية مع الزوائد مقترن، elasmobranchs هي نموذجا هاما تطويريا، وخاصة بالنسبة للدراسات في التطور والتنمية. كما تم elasmobranchs البحرية تستخدم لدراسة علم السموم المائية وعلم وظائف الأعضاء التوتر في العلاقة إلى 4 تغير المناخ. وبالتالي، هناك حاجة إلى تطوير وتكييف المنهجيات لتسهيل وتوسيع نطاق استخدام هذه الفقاريات البدائية إلى التخصصات البيولوجية متعددة. هنا أقدم على التكيف الناجح لجبل RNA كله في الموقع التهجين والتقنيات النسيجية لدراسة التعبير الجيني وعلم الأنسجة الخلية في elasmobranchs.
رصد التعبير الجيني هو أداة مميزة لبيول التنمويةogists، ويستخدم على نطاق واسع للتحقيق في العمليات التنموية 5. RNA جبل بأكمله في الموقع التهجين يسمح التصور وتوطين النصوص جين معين في أنسجة الجنين النامية. يمكن للنمط التعبير الجيني في الرسالة توفير نظرة ثاقبة ما هي العمليات التنموية والقرارات مصير الخلية الجين قد السيطرة عليها. من خلال مقارنة نمط التعبير عن الجينات في مراحل نمو مختلفة، يمكن اكتسبت نظرة ثاقبة دور كيف لتغييرات الجين خلال التنمية.
بينما جبل كامل في ليالي 'الموقع يوفر وسيلة لتوطين التعبير الجيني للأنسجة، وتقنيات النسيجية تسمح لتحديد أنواع الخلايا والأنسجة المتمايزة. البقع النسيجية لها وظائف متنوعة. وتستخدم لتسليط الضوء على بقع العام شكل الخلية، على سبيل المثال hematoxylin و eosin لتلطيخ العام للنوى والسيتوبلازم، على التوالي. يمكن تسليط الضوء على بقع معينة من الخلايا الأخرىأنواع. على سبيل المثال، وصمة عار ذكرت والأزرق alcian في هذه الورقة هو وصمة عار على نطاق واسع لتحديد mucosaccharides الموجبة. يمكن تلطيخ من الجهاز الهضمي مع الأزرق alcian تحديد توزيع الخلايا الكأسية التي تنتج mucosaccharides. الاختلافات في مكونات mucosaccharide على الببتيدات قصيرة تمييز الخلايا الكأسية حسب الوظيفة في الجهاز الهضمي 6. باستخدام RNA جبل كامل في أساليب الموقع لوالنسيجية بشكل متزامن، يمكن ربط مصير قرارات الخلية إلى الجينات المحددة التعبير.
على الرغم من أن RNA في ليالي الموقع 'والكيمياء النسيجية وتستخدم على نطاق واسع من قبل الباحثين، والتقى تكييفها واستخدامها في elasmobranchs البحرية نجاحا محدودا ومتنوعة. هنا أقدم البروتوكولات التي وضعت لelasmobranchs واستخدامها على أساس منتظم في مختبري. على الرغم من أن قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التعديل من الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين طريقة لللتكيف مع أنواع مختلفة، وصفت البروتوكولات هنا عrovide نقطة قوية للباحثين الراغبين بدءا من التكيف على استخدام elasmobranchs البحرية على استفساراتهم العلمية.
Protocol
I. RNA جبل الجامع في الموقع التهجين في Elasmobranchs البحرية
1. التثبيت والإعداد الجنين
- يمكن الأجنة تزلج نظمت وفقا لبالارد 7. مراحل الأمثل للكشف عن التعبير الجيني يعتمد على الأنسجة من الاهتمام. لتتبع التعبير الجيني في الجهاز الهضمي تزلج، مراحل هي 27-30 الأمثل 7.
- تشريح الأجنة في برنامج تلفزيوني، فصل الأجنة من الكيس المحي.
- إصلاح في 30 مل من الطازجة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في أنبوب مخروطي 50 مل في 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف. إصلاح لمدة 24 ساعة.
- غسل الأجنة في PBT، لمدة 15 دقيقة مرتين، بالتناوب في درجة حرارة الغرفة. يتم تضمين كافة الوصفات حل لجبل RNA كله في ليالي 'الموقع (الجدول 1).
- يذوى الأجنة عن طريق الغسيل في سلسلة الميثانول بنسبة 25٪، 50٪ و 75٪ الميثانول: PBT هزاز في درجة حرارة الغرفة. مدة يغسل يعتمد على مرحلة من الأجنة. لمرحلة ما قبل نeurulation نظم الأجنة، 5 دقائق من كل غسل في سلسلة الميثانول كافية. لأجنة أقدم من المرحلة 30، يمكن أن تستغرق ما يصل الى يغسل 30 دقيقة. لتحديد إذا ما اخترقت بما فيه الكفاية الأجنة وتأقلم كل ليغسل، عقد أنبوب تستقيم في يدك. إذا كانت الأجنة تنزل الى قاع الأنبوب، ثم كنت على استعداد لغسل المقبل. إذا كانت الأجنة تطفو الى الاعلى من الحل، حل تغيير وتكرار هذه الخطوة خاصة الجفاف.
- يغسل مرتين في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقيقة هزاز بلطف.
- المجففة مرة واحدة لالميثانول بنسبة 100٪، يجب تخزين الأجنة في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة قبل الشروع في البروتوكول. وقد تم تخزين الأجنة بنجاح في -20 ° C، وتستخدم ليتصاعد RNA كله لمدة تصل إلى 1 سنة.
2. توليف دقق RNA
- توليد جزء خطية من الجين الذي التعبير الذي ترغب في الكشف عنها. ويمكن أن يتم هذا إما عن طريق التضخيم PCR أو linearizing البلازميد مع الجين الخاصمن الفائدة. لتضخيم PCR بواسطة، اختر الاشعال الذي ملزمة المواقع الجناح الجين إدراج المواقع والاحتفاظ بوليميراز RNA ملزم في المنطقة تضخيم. ليشيع استخدام البلازميدات مثل برنامج تلفزيوني أو pGEM، M15 إلى الأمام وعكس الاشعال مثالية. بدلا من ذلك، خطي البلازميد من هضم 15 ميكرولتر من الحمض النووي miniprep QIAGEN مع الانزيم الذي يشق في نهاية 5 'من الجين. استخراج وتنقية جل استخدام عدة QIAquick المناسبة.
- عكس تدوين التحقيق RNA باستخدام 8 ميكرولتر من خطي البلازميد أو 100 نانوغرام من الناتج PCR كقالب باستخدام البلمرة RNA المناسب (انظر الجدول رقم 2 للتفاعل النسخ).
- احتضان رد فعل عكسي لمدة 2 ساعة النسخ في 37 ° C.
- لتأكيد رد فعل، تشغيل 1 ميكرولتر من رد فعل النسخ على هلام الاغاروز / TAE 1٪. تشغيل هلام في 100 mVolts حتى الصبغة وتشغيل فقط في هلام. وينبغي أن يكون واحد الفرقة البارزين تكون مرئية. قد القالب الحمض النووي الخطية تكون مرئية بصوت ضعيف جزء في أعلى الجزيئيلار الوزن.
- إضافة 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية الدناز الأول للتفاعل واحتضان النسخ في C ° 37 لمدة 15 دقيقة.
- ليعجل، إضافة 100 ميكرولتر TE الرقم الهيدروجيني 8 و 10 ميكرولتر 4 LiCl M، 300 ميكرولتر 100٪ EtOH واحتضان في -20 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
- تدور لمدة 10 دقيقة في 4 C ° microfuge في 14،000 دورة في الدقيقة.
- غسل بيليه مع EtOH 70٪ والهواء الجاف.
- إعادة تعليق RNA التحقيق في 20 ميكرولتر من DH 2 O. إضافة 80 ميكرولتر من العازلة التهجين (ينبغي العازلة التهجين قبل تحسنت إلى C ° 70). ويمكن تخزين في المخزن المؤقت التحقيق التهجين 80٪ لعدة أشهر في -20 ° C أو أكثر في -80 ° C.
3. الجنين ما قبل المعالجة والتهجين
- إزالة الأجنة المخزنة في الميثانول بنسبة 100٪ من -20 ° C. لصغار الأجنة المضي قدما في الخطوة (3.2). لاحقا قام الأجنة (المرحلة 29/30 <) قد ترى طبقة البشرة التي 'رفع' قبالة جسد الجنين. تحت المجهر، مجرد الإساءة بعنايةالعلاج بالصدمات الكهربائية من طبقة البشرة لزيادة تغلغل التحقيق.
- الأجنة في مكان نظيف قارورة التلألؤ الزجاج. ترطيب الأجنة في سلسلة الميثانول عكس وصف أعلاه: هزاز بلطف بواسطة كل حل ل5-30 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة: (PBT 75٪ و 50٪ و 25٪ الميثانول). الإماهة كاملة مع اثنين من يغسل PBT لمدة 10 دقيقة لكل منهما، هزاز بلطف.
- لإزالة أي صبغة والأجنة التبييض مع بيروكسيد الهيدروجين 6٪ في PBT لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، هزاز.
- إزالة بيروكسيد الهيدروجين عن طريق الغسيل ثلاث مرات في PBT، (هزاز في درجة حرارة الغرفة، 10 دقيقة لكل منهما).
- علاج الأجنة مع K بروتين للسماح لاختراق من خلال التهجين التحقيق. كمية بروتين K ومدة العلاج يعتمد على النسيج ترغب في فحص وعمر الجنين. الأنسجة أكثر سطحية وأقل الأجنة تتطلب K أقصر وأقل بروتين، بينما الأنسجة العميقة والقديمة الأجنة تحتاج إلى تركيز أعلى وأطول تيم العلاجه لpermeabilize بالكامل الجنين لتهجين التحقيق. على سبيل المثال، للكشف عن SHH في الأديم الباطن أمعاء أجنة المرحلة تزلج 29، وحضنت 30 ميكروغرام / مل من K بروتين / PBT لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف بسرعة الأجنة في PBT ليغسل بروتين K.
- لإلغاء تنشيط بروتين K، POSTFIX الأجنة مع PFA 4٪، 0.2٪ في غلوتارالدهيد PBT لمدة 20 دقيقة، هزاز بلطف.
- يغسل مرتين لمدة 10 دقيقة مع PBT.
- لالتهجين المسبق، إضافة 2-3 مل من محلول التهجين ما قبل ساخنة لأجنة، فقط ما يكفي لتغطيتها. صخرة بلطف في حمام مائي ساخن في C ° 70 ل1 ساعة.
- لإعداد حل التهجين، سخن RNA التحقيق إلى 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وباردة على الجليد. تمييع التحقيق ميكرولتر 15-20 من RNA إلى 2 مل من محلول التهجين محمى جديدة، للحصول على تركيز النهائي من 0،5-1،0 ميكروغرام / مل. إزالة ما قبل hybe وإضافة إلى التحقيق المخفف RNA الأجنة. وينبغي أن تغطي الأجنة فقط عن طريق حل، وهوي ي حل أكثر التهجين إذا لزم الأمر. آمنة بإحكام غطاء قارورة التلألؤ. هجن بواسطة هزاز بلطف في حمام مائي ساخن 70 درجة مئوية في الليل.
4. أضف الغسلات التهجين والتهجين جسم
- إزالة الحل التهجين مع التحقيق من أجنة ومكان في قارورة التلألؤ جديدة أو أنبوب إيبندورف. ويمكن تخزين التحقيق في -20 ° C وإعادة استخدامها في المستقبل. لمرحلة ما بعد التهجين يغسل والأجنة في مكان Netwell يجلس في لوحة زراعة الأنسجة 6 أيضا.
- يغسل 3 مرات لمدة 30 دقيقة في كل من قبل تحسنت الحل رقم 1، هزاز في 70 ° C.
- يغسل 3 مرات لمدة 30 دقيقة في كل من قبل تحسنت الحل رقم 2، هزاز في 70 ° C.
- يغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل من TBST، هزاز في درجة حرارة الغرفة.
- قبل كتلة مع 10٪ مصل الأغنام للحرارة المعطل في TBST ل1 ساعة، هزاز في درجة حرارة الغرفة.
- نقل الأجنة من Netwell إلى قارورة التلألؤ الزجاج النقي. إضافة لمكافحة DIGشظايا القوات المسلحة البوروندية (1:5،000) في مصل الأغنام 1٪ للحرارة المعطل / TBST إلى الأجنة. بين عشية وضحاها في صخرة C. ° 4
5. آخر التهجين جسم يغسل
- إزالة الأجسام المضادة والتخلص منها. الأجنة مرة أخرى إلى مكان لغسيل Netwell.
- يغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل من TBST، هزاز في درجة حرارة الغرفة
- غسل ما لا يقل عن 6 مرات عن 1 ساعة لكل منهما، هزاز في درجة حرارة الغرفة.
- بين عشية وضحاها في غسل TBST، هزاز في C. ° 4 كما تساعد خفض يغسل الجسم المضاد آخر لأسفل على تلطيخ الخلفية، وتعظيم عدد ومدة يغسل هو الأفضل. تغسل بشكل روتيني الأجنة في TBST في C ° 4، خلال عطلة نهاية الأسبوع.
6. كشف التحقيق
- تشكل الحل الطازجة وNTMT تصفية تعقيم.
- تجاهل حل TBST غسل الأجنة والمكان في قارورة زجاجية نظيفة التلألؤ. غسل الأجنة 3 مرات في NTMT الطازجة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة كل، هزاز.
- إزالة NTMT غسل وإضافة مزيج التفاعلمن NBT س 1/1 × BCIP في NTMT. حيث أن هذه المواد المتفاعلة هي الحساسة للضوء، تغطية قارورة التلألؤ في احباط والصخور في درجة حرارة الغرفة.
- رصد رد فعل كل لون 15 دقيقة حتى المطلوب هو التعبير الجيني واضحة للعيان. قد تحقيقات قوية يستغرق اقل من 10 دقيقة لتطوير. قد تحقيقات ضعيفة تأخذ 1-2 ساعة. لا تدع رد فعل تذهب لفترة طويلة جدا أو تلطيخ الخلفية سوف تبدأ في الظهور (الجنين كله يبدأ لتحويل اللون الأرجواني أو البني مملة).
- غسل 2 مرات لمدة 10 دقيقة في كل من PBT في درجة حرارة الغرفة، هزاز.
- POSTFIX الأجنة في بارافورمالدهيد 4٪، 0.1٪ لغلوتارالدهيد 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يمكن أن يكون مخزن الأجنة إلى أجل غير مسمى في تثبيتي في C. ° 4
- تصور الأجنة مع stereomicroscope تشريح. لإنتاج الضوء الأزرق خلفية للصور والأجنة مكان في صحن مع الاغاروز 1٪ قبل تصلب / PBS.
7. ممثل عن نتائج جبل RNA I. الجامع في الموقع التهجين في elasmobranchs البحرية
وتظهر RNA جبل بأكمله في التعبير الموقع لتصور من القنفذ الصوتي (SHH) وHoxa13 في الأجنة تزلج في الشكل 1. تم العثور على التعبير عن SHH في الفقاريات العليا في الأديم الباطن القردود والأمعاء ويتم حفظها هذا النمط في التعبير تزلج (الشكل 1A) 8،9. elasmobranchs البحرية لديها طريقة فريدة من تنظيم التناضح يستخدم الغدة تفرز الأملاح إلى المستقيم. Hoxa13 التعبير عالية في الغدة المستقيم النامية (1B الشكل) 10. Hoxa13 دور الجين المنتج في الزخرفة الغدة المستقيم لا تزال غير معروفة.
II. البارافين التضمين وباجتزاء الأنسجة صفيحية الخياشيم
1. الحصاد وإعداد الأنسجة
- تشريح الأنسجة المطلوب وإصلاح في 10٪ فورمالين لمدة 24-48 ساعة، هزاز في درجة حرارة الغرفة. ويمكن أيضا بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) أن تستخدم مثبت(انظر المناقشة).
- تغسل مثبت عن طريق الغسيل في برنامج تلفزيوني، و 3 مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما. اعتمادا على حجم الأنسجة، يمكن انخفض مرات الغسيل لمدة 10 دقيقة أو إلى زيادة 1 ساعة.
- يذوى الأجنة عن طريق الغسيل في سلسلة من الايثانول 25٪، 50٪ و 75٪ من الإيثانول: PBS هزاز في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى، فإن الوقت لكل غسل تعتمد على حجم الأنسجة. ل 0.5 الأنسجة 3 سم، احتضان كل غسيل لمدة 15 دقيقة. زيادة الوقت للحصول على أكبر قطعة. إذا هو المطلوب التخزين على المدى الطويل من الأنسجة، وغسل إضافية مرتين في الإيثانول 75٪ وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة. إلا المضي قدما إلى الخطوة التالية.
- يذوى المزيد من الغسيل 3 مرات في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 15 دقيقة لكل منهما، هزاز.
2. التضمين وباجتزاء البارافين
- توضيح الأنسجة عن طريق الغسيل 2 مرات في الزيلين لمدة 5 دقائق كل قارورة التلألؤ في الزجاج مع الأغطية غطاء المسمار. الزيلين سوف تجعل الأنسجة هشة، لذلك لا يتجاوز ما مجموعه 10 دقيقة لكان[هس]. يجب أن ننظر الأنسجة شفافة عند عقد ليصل إلى ضوء. إذا كان النسيج لا يزال مبهمة للغاية بعد يغسل اثنين، قيام غسيل إضافية في الزيلين لمدة 5 دقائق ثم المضي قدما في البروتوكول. فقط التعامل مع الزيلين داخل غطاء الدخان مع القفازات.
- إزالة الزيلين وملء قارورة التلألؤ 2/3 كامل مع البارافين ذاب. احتضان في فرن 60 C ° لمدة 30 دقيقة. عندما وضع في القارورة البارافين، ستلاحظ البارافين يصلب على طول جانبي القارورة. ضع قارورة في الفرن والسماح للالبارافين للبضع دقائق إعادة حل. اتخاذ القارورة من الفرن ويقدم الحل السريع دوامة لخلط واستبدال في الفرن لمدة المتبقية من الحضانة.
- البارافين تكرار حضانات مرتين أخريين لمدة 30 دقيقة.
- احتضان في البارافين لمدة ساعة مرتين لكل منهما. تغيير وقت البارافين واحتضان بين عشية وضحاها النهائي في الفرن 60 C °.
- في اليوم التالي، ضع الأنسجة في غرفة حمام البارافين الساخن ومكان تحت التفريغ لمدة 2-3 ساعة. وسوف يسهل هذا تسلل البارافين في الأنسجة وإزالة أي فقاعات الهواء. لبعض أنواع الأنسجة رقيقة، قد لا تكون خطوة الفراغ المطلوب، ولكن من الضروري للأجنة كاملة أو الجهاز الهضمي وغيرها من الأجهزة مع مقصورات لمعي.
- بعد الفراغ سهلت تسلل الأنسجة الأنسجة مكان، في قالب معدني مع البارافين ذاب، وبارد على صفيحة الجليد. ترك على الجليد أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية قبل محاولة إزالة الأنسجة من العفن. ويمكن تخزين كتل من الأنسجة البارافين إلى أجل غير مسمى في C. ° 4
- مكان كتلة البارافين في الصعود إلى مشراح وقطع 8 أقسام ميكرومتر. ينبغي طرح المقاطع على حمام الماء الساخن إلى 48 ° C والتي شنت على الشرائح الزجاجية Superfrost زائد *.
- الشرائح الجافة بين عشية وضحاها في فرن درجة 37 درجة.
- أقسام المحل في 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها.
III. زرقة الألسيان / الأحمر سريعة النووية صمة صفيحية الخياشيم الأنسجة
1. زرقة الألسيان وصمة عار لMucins
- المكان الشرائح مع أقسام تواجه تصاعدية على أكثر دفئا الشريحة. تذوب لمدة 45 دقيقة.
- المكان الشرائح في حامل الشرائح. وترد جميع الحلول يترتب على ذلك في أحواض داخل غطاء الدخان. تغسل الشرائح عن طريق نقل ملكيتها من الحوض مع حل لآخر. تأكد من أن مستويات حل في أحواض تغطي الشرائح، ويتم مغمورة تماما الأنسجة على الشرائح. حل البارافين عن طريق الغسيل الشرائح 2 مرات في الزيلين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- غسل الشرائح مرتين مع الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة لكل منهما.
- ترطيب الشرائح في سلسلة الايثانول (75٪، 50٪، 25٪ إيثانول) الغسيل في كل حل ل1 دقيقة. يغسل في DH 2 O لمدة 1 دقيقة.
- وصمة عار في الحل الأزرق Alcian، ودرجة الحموضة 2.5 ل 15 دقيقة.
- تطوير وصمة عار عن طريق الغسيل في ماء الصنبور تشغيل لمدة 3 دقائق. تراجع مرة واحدة في DH 2 O.
- ملون مباين النووية في حل سريع ملون مباين الأحمر لمدة 10 دقيقة.
- يغسل في إدارة مياه الصنبور لمدة 3 دقائق وتراجع في 2 درهم مرة واحدة O.
- Dehydrate في سلسلة الايثانول (25٪، 50٪، 75٪، 100٪، 100٪) لمدة 20 الانخفاضات لكل منهما، أو 1 دقيقة لكل منهما. غسل 2 مرات في الزيلين لمدة 5 دقائق لكل منهما. جبل مع تصاعد والمتوسطة DPX coverslips. السماح لتصاعد المتوسطة الجافة وتتصلب لمدة 48 ساعة في غطاء الدخان قبل التلاعب الشرائح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أمثلة على تلطيخ الأزرق alcian في مناطق مختلفة من L. وتظهر erinacea الجهاز الهضمي في الشكل 2. الميوسين حمض تحتوي على خلايا globlet مرئية بوضوح من خلال وصمة عار الأزرق alcian في جميع أنحاء الجهاز الهضمي. توزيع mucins حمض يختلف في مناطق مختلفة من الجهاز الهضمي، مما يعكس الاختلافات في وظيفة. ويتم إنتاج قليلة الحمضية mucins في الأمعاء ودوامة مجرور، في حين يتم الكشف عن تركيز عال من حمض mucins في الأمعاء القاصي (قارن الشكل 2A 2C ومع 2B).
| PBT | 1 × PBS |
| 0.1٪ توين-20 | |
| في Nalgene من نوع وحدات زراعة الأنسجة تصفية تصفية تعقيم. | |
| 20 × SSC، ودرجة الحموضة 4.5 </ TD> | 3 M كلوريد الصوديوم |
| 0.3 متر NaCitrate | |
| ضبط درجة الحموضة مع حمض الستريك. | |
| التهجين الحل | 50٪ الفورماميد |
| 1،3 X SSC، ودرجة الحموضة 4.5 | |
| 5 ملم EDTA، 8 أس هيدروجيني | |
| 50 ملغ / مل الحمض الريبي النووي النقال | |
| 0.2٪ توين-20 | |
| 0.5٪ الفصول | |
| 100 ملغ / مل الهيبارين | |
| قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة. | |
| بروتين K | 10 ملغ / مل محلول المخزون |
| 20 ميكرولتر مأخوذة في أنابيب إيبندورف 0،5 ميكرولتر مثل وتخزينها في -20 درجة C. | |
| حل رقم 1 | 50٪ الفورماميد |
| 1،3 X SSC، ودرجة الحموضة 4.5 | |
| 0.2٪ توين-20 | |
| المحل في -20 درجة مئوية | |
| الحل رقم 2 | 50٪ الفورماميد |
| 1 × SSC، ودرجة الحموضة 4.5 | |
| 0.2٪ توين-20 | |
| المحل في -20 درجة مئوية | |
| مصل الأغنام | تعطيل عن طريق التسخين إلى 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، وتخزينها في -20 درجة مأخوذة في C. |
| 10 × TBS | 80 جم كلوريد الصوديوم |
| 2 غرام بوكل | |
| 250 مل، 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5 | |
| إضافة الماء إلى 1 L | |
| 1 × TBST | 1 × TBS |
| 0.1٪ توين-20 | |
| NTMT | 100 ملي مول كلوريد الصوديوم |
| 100 ملي مول تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 9.5 | |
| </ TD> | 50 ملم MgCl 2 |
| 0.1٪ توين-20 | |
| جعل حوالي 100 مل الطازجة قبل استخدام والتصفية. | |
| 200 X الأسهم NBT | 50 ملغ / مل NBT في الفورماميد ثنائي ميثيل 70٪ |
| مخزن في -20 درجة مئوية في مليلتر مأخوذة 1. | |
| 200 X الأسهم BCIP | 25 ملغ / مل في الماء BCIP |
| مخزن في -20 درجة مئوية في مليلتر مأخوذة 1. |
الجدول 1. الحمض النووي الريبي جبل كامل في حلول الموقع.
| خطي البلازميد | 8 ميكروليتر |
| 10 × العازلة النسخ | 4 ميكرولتر |
| DIG-UTP مزيج النوكليوتيدات | 2 ميكرولتر |
| ريبونوكلياز المانع | 0،5 ميكروليتر |
| RNAالبلمرة (SP6، T3 أو T7) | 1 ميكرولتر |
| ريبونوكلياز عقيمة خالية من H 2 0 | 4،5 ميكروليتر |
| اجمالى حجم التداول | 20 ميكرولتر |
الجدول 2. رد فعل لتوليد النسخ RNA التحقيق.
الشكل 1. SHH وHoxa13 التعبير في الأجنة erinacea Leucoraja هي تصور من قبل RNA جبل بأكمله في الموقع التهجين (أ) تم الكشف عن SHH التعبير في الجنين تزلج المرحلة 29. (A ') التكبير العالي (أ) يكشف عن التعبير في SHH القردود (النصال) والقناة الهضمية الأديم الباطن (الأسهم). (ب) السابقين Hoxa13يتم ترجمة pression في الغدة المستقيم (السهم) لتزلج مرحلة الجنين 29 (ب ') الجهاز الهضمي مشرح من الجنين في (ب) يدل على خصوصية التعبير نص Hoxa13 في الغدة المستقيم ه، الأديم الباطن؛ غ، القردود ؛ RG، الغدة المستقيم اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 2. تم الكشف عن توزيع الحمضية الخلايا الكأسية الميوسين المنتجة في الجهاز الهضمي تزلج. (أ، ج) أعداد قليلة من الخلايا الكأسية الحمضية الميوسين المنتجة من قبل زرقاء alcian وصمة عار في الأمعاء ودوامة مجرور، على التوالي (الأسهم). (ب)الأمعاء القاصي يحتوي على أعلى كثافة من الخلايا الكأسية الحمضية الميوسين (السهام). في كل اللوحات، نواة واضحة للعيان من قبل الأحمر الصيام النووية وصمة عار. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكولات المقدمة من الطرق الكلاسيكية لرصد وتحديد التعبير الجيني أنواع الخلايا المتمايزة، والتي تم تكييفها للاستخدام في elasmobranchs البحرية. قد تكون هناك حاجة لإجراء المزيد من التعديلات هذه البروتوكولات على التكيف مع أنواع مختلفة صفيحية الخياشيم.
القلق الأكثر شيوعا فيما يتعلق RNA جبل كامل في ليالي 'الوضع الطبيعي هو خطر التلوث ريبونوكلياز وبالتالي تدهور التحقيق RNA والرسائل المحلية. جانبين تحتاج إلى النظر فيها: تجميع للriboprobe والتهجين لرسائل الجنينية، وتقنيات التعامل مع عامة ل RNA. بشكل عام، يمكن تجنب التلوث ribonucleases باستخدام الحاويات دون فتحها من بلستيكور، والأواني الزجاجية المستخدمة سابقا. إذا الأواني الزجاجية الجديدة غير متوفرة، يتعامل مع جميع الأواني الزجاجية مع ريبونوكلياز-AWAY (VWR # 17810-491). تتم عن طريق سكب يغسل بلطف من خلال حلول ملعقة مثقوبة وإضافة جديدة لحل القارورة.وبدلا من ذلك، يمكن وضع الأجنة صغيرة جدا أو الأجهزة / الأنسجة في Netwell التي تناسبها في طبق نسيج الثقافة 6 أيضا. يمكن نقل الأنسجة من حل واحد لآخر من خلال رفع ببساطة Netwell من بئر واحد إلى آخر. هذا يساعد على منع فقدان أي نوع من الأنسجة عن طريق سكب، ويحافظ أيضا على بنية الأنسجة. ويمكن الاطلاع على اقتراحات إضافية للتعامل مع RNA ومنع التلوث ريبونوكلياز في الاستنساخ الجزيئي؛ دليل مختبر، وعلى مواقع عدة الصيدلانية، بما في ذلك روش ( http://www.roche-applied-science.com/labfaqs/p2_1.htm ) 11 .
جيل من التحقيق RNA وقبل العلاج والتهجين من الأجنة هي الخطوات الأكثر عرضة للتلوث من قبل ribonucleases. وقد تم تجميع مضاد تحقيقات RNA التي تكمل الأم نسخة مرنا من النسخ العكسي في المختبر في العلاقات العامةesence من digoxigenin-UTP. لفترة وجيزة، وخطي [كدنا] البلازميدات مع انزيم تقييد فريدة من نوعها التي موقع يقع في نهاية 5 'من الجين. وهذا يسمح للبوليميراز RNA لتسقط في نهاية هذا الجين. بوليميراز RNA اختيار عن طريق تحديد المروج بوليميراز RNA المتاحة في "البلازميد فقط 3، إلى كودون التوقف. في حين غالبا ما تستخدم T3 وT7 بلمرة RNA لpBluescript، SP6 هو الخيار لجينات البلازميدات subcloned في pGEM الاتجاه. بالإضافة إلى ريبونوكلياز المانع، يتم استخدام المياه المعالجة DEPC في رد فعل النسخ وتنقية التحقيق. ينبغي لجميع حل التهجين والخطوات باستخدام PBT في علاج ما قبل الأجنة تكون مع الماء DEPC. لعلاج المياه DEPC، إضافة 1 مل من DEPC إلى 1 L من الماء في دورق كبير وتخلط جيدا. ترك بين عشية وضحاها في غطاء محرك السيارة والأوتوكلاف في اليوم التالي. ويمكن أيضا حلول مثل PBS × 10 وSSC ان تتخذ في DEPC المعالجة المائية. بعد التهجين مع riboprobe، واستخدام ذلك ريبونوكلياز خاليةlutions والاحتياطات مماثلة لم تعد ضرورية.
متغيرات إضافية تستحق النظر هي التركيز وطول فترة العلاج K بروتين، والتي يمكن أن تؤثر على الاختراق من التحقيق. ينصح الحذر المعايرة للسهم K بروتين الوقت لتحسين العلاج لمراحل جنينية مختلفة. وصف بروتوكول هنا تم بشكل روتيني وبنجاح استخدامها مع الأجنة في مراحل 20 حتي 31 وفقا لبالارد 7. لأجنة التي هي صغيرة جدا أو لالأنسجة التي هي خاصة "لزجة"، يمكن استبدال المنظفات توين-20-X مع تريتون. وبالإضافة إلى ذلك، قد تكون هناك حاجة إلى الجين محددة تعديلات على بروتوكول اعتمادا على وفرة النص. للحد من الخلفية، وقد تم ثنائي ميثيل فورماميد 10٪ وأضاف روتيني في حل التنمية (NTMT) من قبل عدة مجموعات 12.
وعلى النقيض من الطبيعة الحساسة للRNA في ليالي الموقع، فرحة هو أن الأنسجةانها سريعة ومضمونة جدا! أي تقلب في تلطيخ هو الأرجح بسبب تثبيت غير كافية. استبدال لضمان ثابتة تماما أن الأنسجة، فمن المستحسن أن يتم تشريح الأنسجة كبيرة جدا (مثل الجهاز الهضمي للحيوان بالغ) إلى أجزاء أصغر والحل مثبت الطازج كل ساعة أكثر من 10 فترة 48 ساعة. قد يكون من الضروري لتحسين شروط التثبيت، يمكن كل من الأنسجة تحت وفوق الثابتة يؤدي إلى باجتزاء الفقراء أو تلطيخ متفاوتة. وبالإضافة إلى ذلك، البقع النسيجية المختلفة تعمل على النحو الأمثل مع مثبتات مختلفة. وهكذا، فإن الأمر يستحق تعديل مثبت وفقا لوصمة عار النسيجية يستخدم 13. ويوصى بارافورمالدهيد 4٪ عند تحديد الأجهزة أو الأنسجة الرخوة الأجنة الشباب. لكبار السن أو أجنة الحيوانات كلها، ويفضل 10٪ الفورمالين. مرة واحدة هو البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج ومقطوع، قد يتم استخدامها لأغراض متعددة، بما في ذلك الحمض النووي الريبي في ليالي الموقع. وهذا يسمح لقرار من التعبير الجيني على ليف الخلويةش. وبدلا من ذلك، قد يتم ملطخة الأقسام مع البقع النسيجية المختلفة لتحديد أنواع الخلايا المتمايزة.
وقد الأزرق وسريع النووية alcian تلطيخ الأحمر أجريت بنجاح في تزلج (Leucoraja erinacea)، كلب البحر (acanthias Squalas)، hagfish (Myxine glutinosa) وامبرى (Petromyzon مارينوس)، (نتائج غير منشورة) 10،14. بالإضافة إلى الرقم الهيدروجيني الزرقاء وصمة عار وصف alcian 2،5 هنا، وتعديل الرقم الهيدروجيني من الحل الزرقاء alcian يمكن تمييز mucosaccharides مختلفة (أي اللعاب مقابل sulfomucins) 13. يمكن التمييز بين مختلف مكونات mucosaccharide الخلايا الكأسية حسب الوظيفة والتعريب في الجهاز الهضمي 15،16. زرقة الألسيان وصمة عار في الجهاز الهضمي وقد استخدم لتشخيص أمراض مثل سرطان المريء باريت، وتعزيز تلطيخ من حبيبات بيتا خلايا البنكرياس 17،18.
باختصاريمكن مريم، والكيمياء النسيجية الحمض النووي الريبي جبل كامل في ليالي الموقع 'عند استخدامها معا يؤدي إلى فهم أفضل للعلاقة بين حيث يتم التعبير عن الجينات خلال التنمية ونوع من الخلايا الناتجة متباينة. وقد تم ربط التعبير عن الجينات Hox الخلفي لمواصفات من الخلايا الكأسية حمض الميوسين في تطوير الجهاز الهضمي 10،19. هنا سأقدم مثالا للتعبير عن SHH والجين Hox جنبا إلى جنب مع وجود خلايا الحمض القدح الميوسين المنتجة في L. erinacea الجهاز الهضمي. ويمكن تطبيق هذه التقنيات على نطاق واسع لأنواع مختلفة من elasmobranchs، مختلفة الجينات الزخرفة التنموية والبقع النسيجية المختلفة. استمرار تطبيق وتكييف التقنيات لelasmobranchs البحرية من المهم لمواكبة استخدام الواسع لهذه الحيوانات لنماذج البحوث الطبية الحيوية في علم وظائف الأعضاء، علم الغدد الصماء، علم السموم وعلم الجينوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدي ما تكشف.
Acknowledgments
وأود أن أشكر العديد من الطلاب الجامعية الذين عملوا في مختبري وساهم في تطور هذه البروتوكولات. وقد تلقت الدعم من NAT شبكة سكيدمور، الاتحاد، وهو مشروع إنشاء ADVANCE مع NSF المدفوعة المنحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. | |||
References
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T. Physiology of elasmobranch fishes. Shuttleworth, R. , Springer-Verlag. 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2, Battelle Press. (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
