Summary
RNA tüm montaj yöntemleri birleştirerek
Abstract
Adaptif bağışıklık var ve osmoregülasyon 1-3 için benzersiz mekanizmalara sahip en ilkel omurgalılar olarak Deniz elasmobranchs biyomedikal ve genomik çalışmalar için hayvan modellerinin değerlenir. Eşleştirilmiş ekleri ile en ilkel canlı çeneli-omurgalılar olarak elasmobranchs özellikle evrim ve gelişme çalışmaları için, evrimsel önemli bir model vardır. Deniz elasmobranchs ayrıca iklim değişikliğinin 4 ilişki sucul toksikoloji ve stres fizyolojisi incelemek için kullanılmıştır. Böylece, metodolojilerin geliştirilmesi ve adaptasyonu kolaylaştırmak ve çoklu biyolojik disiplinlerin bu ilkel omurgalıların kullanımını yaygınlaştırmak için gereklidir. İşte situ hibridizasyon ve gen ekspresyonu ve elasmobranchs hücre histolojisi çalışma histolojik teknikler RNA bütün mount başarılı uyum sunuyoruz.
Gen ekspresyonu İzleme gelişimsel başina bir işaretidir araçtırogists ve yaygın olarak gelişim süreçleri 5 incelemek için kullanılır. In situ hibridizasyon RNA bütün montaj gelişen embriyonun dokularda görselleştirme ve belirli bir gen transkript lokalizasyonu için izin verir. Bir genin mesajının ifade desen gelişimsel süreçler ve hücre kaderini belirleyen bir gen kontrol edebilir ne içgörü sağlayabilir. Farklı gelişim aşamalarında bir genin ekspresyonu desen karşılaştırarak, içgörü gelişimi sırasında gen değişikliklerinin nasıl rolüne elde edilebilir.
In situ 's tüm montaj dokuya gen ekspresyonu yerelleştirmek için bir araç sunarken, histolojik teknikler farklılaşmış hücre tipleri ve dokuların tespiti için izin verir. Histolojik lekeleri çeşitli işlevlere sahiptir. Genel lekeleri hücre morfolojisi vurgulamak için kullanılır, örneğin sırasıyla hematoksilen ve çekirdek ve sitoplazma genel boyama için eozin,. Vardır Diğer lekeleri spesifik hücre vurgulayabilirsiniztürleri. Örneğin, alcian mavi mucosaccharides belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir katyonik leke bu yazıda leke. Alcian mavisi ile sindirim sistemi Boyanması mucosaccharides üreten goblet hücrelerinin dağılımının tespit edebilirsiniz. Kısa peptidler üzerine mucosaccharide bileşenlerinin değişimleri sindirim sistemi 6 içinde işlevi tarafından goblet hücreleri ayırt. Eşzamanlı in situ 's ve histokimyasal yöntemlerle RNA bütün montaj kullanarak, hücre kaderini belirleyen gen-spesifik ekspresyonu ile bağlantılı olabilir.
RNA in situ 's ve histokimyası yaygın olarak araştırmacılar tarafından kullanılıyor olmasına rağmen, deniz elasmobranchs onların uyum ve kullanımı sınırlı ve çeşitli başarı tanıştım. İşte elasmobranchs için geliştirilen ve benim laboratuvarda düzenli olarak kullanılan protokoller mevcut. In situ 'in hibridizasyon metodu ile de RNA daha fazla değişiklik farklı türler uyum için gerekli olsa da, burada p açıklanan protokolonların bilimsel araştırmalar için deniz elasmobranchs kullanımı uyarlamak isteyen araştırmacılar için güçlü bir başlangıç noktası rovide.
Protocol
Deniz Elasmobranchs in situ Hibridizasyon I. RNA Tüm Dağı
1. Embriyo Fiksasyon ve Hazırlık
- Skate embriyolar Ballard 7'ye göre düzenledi olabilir. Gen ifadesinin saptanması için en uygun aşamada ilgili doku bağlıdır. Paten sindirim sisteminde gen ekspresyonu izlemek için, aşamaları 27-30 Temmuz optimaldir.
- Yolk kesesi gelen embriyolar ayıran, PBS içine embriyo teşrih.
- 4'e bir 50 ml konik boru ° C'de hafif sallama ile taze olarak yapılmış% 4 paraformaldehit (PFA), 30 ml düzeltildi. 24 saat için düzelt.
- Iki kez oda sıcaklığında 15 dakika dönen için, PBT embriyonlar yıkayın. In situ 's RNA bütün montaj için tüm çözüm tarifler (Tablo 1) dahildir.
- Oda sıcaklığında, PBT sallanan: metanol% 25 oranında dizi, en az% 50 ve% 75 metanol içinde yıkama ile embriyolar kurutmak. Yıkama süresi embriyo evresine bağlıdır. Ön-N içineurulation embriyolar aşamalı, metanol seride her yıkamadan 5 dakika yeterlidir. Aşamada 30 daha eski embriyolar için, yıkama 30 dk kadar sürebilir. Embriyolar yeterince nüfuz ve her yıkama için acclimated olup olmadığını belirlemek için, elinizde dik tüp tutun. Embriyoların tüpün dibine çöker varsa, o zaman bir sonraki yıkama için hazır. Embriyoların çözüm üst şamandıra, çözüm değiştirmek ve o belirli dehidratasyon adımı tekrarlayın.
- Nazikçe sallanan 10 dakika boyunca% 100 metanol içinde iki kere yıkayın.
- % 100 metanol kez susuz, embriyolar protokol ile devam etmeden önce en az 24 saat boyunca -20 ° C'de muhafaza edilmelidir. Embriyolar başarıyla -20 ° C'de saklanabilir ve en fazla 1 yıl için RNA bütün bağlar için kullanılmıştır.
2. RNA Prob Sentezi
- Ifade algılamak istediğiniz genin doğrusal bir parçası oluşturun. Bu PCR amplifikasyonu yoluyla yapılabilir ya da gen içeren bir plazmid doğrusallaştırma edilebilirilgi. PCR ile yükseltmek için, kimin bağlayıcı siteleri kanadını geni amplifiye bölgede RNA polimeraz bağlayıcı siteleri eklemek ve korumak primerler seçin. Böyle PBS veya pGEM, M15 ileri ve geri primerleri gibi yaygın olarak kullanılan plazmidler için idealdir. Alternatif olarak, genin 5 'ucunda parçalayarak bir enzim ile QIAGEN miniprep DNA 15 ul sindirilmesi ile linearize bir plazmid. Jel ayıklamak ve uygun QIAquick kiti kullanılarak arındırmak.
- Uygun RNA polimeraz (transkripsiyon reaksiyonu için bakınız Tablo 2) ile, bir şablon olarak doğrusal PCR ürününün plazmid ya da 100 ng 8 ul kullanılarak RNA probu uyarlamak Ters.
- 37 °, 2 saat boyunca ters transkripsiyon reaksiyon ° C. inkübe
- Reaksiyon doğrulamak için, bir% 1 agaroz / TAE jeli üzerinde transkripsiyon reaksiyon 1 ul çalıştırın. Boya sadece jel çalıştırmak kadar 100 mVolts jel çalıştırın. Tek bir belirgin bant görünür olmalıdır. Lineer DNA şablonu fragmanı yüksek Moleküler azından belli belirsiz görünür olabilirlar ağırlığı.
- 15 dakika boyunca 37 ° C 'de transkripsiyon reaksiyonu ve inkübe RNAse serbest DNAz I 1 ul ekle.
- Çökelti etmek için, en az 60 dk ya da gece boyunca -20 ° C'de 100 ul TE pH 8, 10 ul 4 M LiCI, 300 ul% 100 EtOH ve inkübe edin.
- 14.000 rpm, 4 ° C de 10 dakika mikrofüj için Spin.
- % 70 EtOH ve kuru hava ile pelet yıkayın.
- DH 2 O 20 ul yeniden süspanse RNA probu Hibridizasyon tamponu 80 ul (hibridizasyon tamponu 70 ° C ile ön ısıtmaya tabi olmalıdır) ekleyin. Prob -80 -20 ° C veya daha az birkaç ay için% 80 hibridizasyon tamponu saklanabilir ° C
3. Embriyo Tedavi öncesi ve Hibritleşme
- -20 ° C ila% 100 metanol içinde saklanan embriyolar kaldırma Genç embriyolar için adım (3.2) ile devam edin. Daha sonra sahneye embriyolar (evre 29/30 <) Eğer embriyonun vücudu kapalı 'kaldırdı' olan bir epidermis tabakası görebilirsiniz. İçin Mikroskop altında, dikkatle dissprob penetrasyonu maksimize etmek epidermal tabakasını ect.
- Temiz cam sintilasyon şişeleri Yeri embriyolar. Yukarıda tarif ters metanol seride embriyolar rehidrate: (% 75,% 50,% 25 metanol: PBT), oda sıcaklığında 5-30 dakika için hafifçe her biri her bir çözelti ile sallanan. 10 dakika her PBT iki yıkamadan, hafifçe sallanan ile komple rehidrasyon.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBT% 6 oranında hidrojen peroksit, sallama ile herhangi bir pigment, ağartıcı embriyolar kaldırmak için.
- , PBT içinde üç kere yıkama ile hidrojen peroksit çıkarın (oda sıcaklığında, 10 dakika sallama her biri).
- Hibridizasyon sırasında sondanın penetrasyonu sağlamak için proteinaz K ile embriyolar davranın. Proteinaz K miktarı ve tedavi süresine incelemek istediğiniz doku ve embriyonun yaşına bağlıdır. Derin dokulara ve yaşlı embriyolar daha yüksek bir konsantrasyon ve uzun tedavi tim gerektiren süre daha yüzeyel doku ve genç embriyolar, daha kısa ve daha az proteinaz K gerektirire tam prob hibridizasyon için embriyo geçirgenliği. Örneğin, 29, aşama paten embriyoların bağırsak endodermal içinde Shh tespit etmek için, 30 ug / proteinaz K / PBT mL, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
- Hızla proteinaz K. uzak yıkamak için PBT embriyoların durulama
- % 4 PFA, 20 dakika boyunca PBT% 0.2 glutaraldehit, hafifçe sallanan proteinaz K, postfix embriyolar devre dışı bırakmak için.
- PBT ile 10 dakika boyunca iki kez yıkanır.
- Ön hibridizasyon için, embriyolar onları karşılamak için yeterli önceden ısıtılmış hibridizasyon çözeltisi 2-3 ml ekleyin. 1 saat boyunca 70 ° C 'de ısıtılmış bir su banyosu içinde yavaşça sallayın.
- ° C 10 dk ve buz üzerinde serin için 70 hibridizasyon çözüm, ön ısıtma RNA probu hazırlamak. 0.5-1.0 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için, taze, önceden ısıtılmış hibridizasyon çözeltisi, 2 ml RNA probu 15-20 ul seyreltin. Önceden hybe çıkarın ve embriyolar için seyreltilmiş RNA probu ekleyin. Embriyolar adil bir çözüm ile kaplanmış olmalıdır, birdd daha hibridizasyon çözüm gerekiyorsa. Sintilasyon flakon Sıkıca güvenli kapak. 70 ° C'da gece boyunca bir sıcak su banyosu içinde yavaşça sallanarak ile melezleşir.
4. Hibritleşme Yıkama ve Antikor Hibridizasyon Ver
- Taze bir sintilasyon flakon veya Eppendorf tüp içinde embriyo ve yerden probu ile hibridizasyon çözüm çıkarın. Prob -20 ° C'de saklanan ve ileride yeniden kullanılabilir. Post-hibridizasyon yıkar, bir Netwell yer embriyolar 6-iyi doku kültürü plaka oturmuş.
- 30 dakika önceden ısıtılmış Çözelti içinde her # 1, 70 ° C 'de sallanan için 3 kere yıkayın
- 30 dakika önceden ısıtılmış Çözelti içinde her bir # 2, 70 ° C 'de sallanan için 3 kere yıkayın
- Oda sıcaklığında sallanan TBST içinde 5 dakika her biri için 3 kere yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca sallanan TBST içinde% 10 ısı ile inaktive edilmiş koyun serum ile yapılan ön blok.
- Netwell bir bardak taze sintilasyon flakon embriyolar transfer. Anti-DIG ekle% 1 ısı inaktive koyun serum / embriyoların TBST Fab Fragments (1:5,000). 4 ° C'de gece boyunca sallayın
5. Mesaj Antikor Hibridizasyon yıkar
- Antikor çıkartın ve atın. Yıkama için geri Netwell içine yerleştirin embriyolar.
- Oda sıcaklığında, sallanan TBST içinde 5 dakika her biri için 3 kere yıkayın
- Oda sıcaklığında sallanan, 1 saat her biri için en az 6 kez yıkayın.
- 4 ° C'de, sallanan TBST gecede yıkayın Sonrası antikor yıkar plan boyama azaltmak yardımcı olarak, yıkama sayısını ve süresini maksimize tercih edilir. Embriyolar rutin bir hafta sonu boyunca, 4 ° C de TBST yıkanır.
6. Prob Algılama
- Taze NTMT çözüm Makyaj ve sterilize filtre.
- Temiz bir bardak sintilasyon flakon TBST yıkama solüsyonu ve yerde embriyolar atın. Oda sıcaklığında, sallanan 10 dakika her biri için taze NTMT embriyoların 3 kere yıkayın.
- NTMT reaksiyon karışımı yıkayın ve Kaldır eklentisi1 x NBT / NTMT 1 x BCIP arasında. Bu reaktifler ışığa duyarlı olduğundan, oda sıcaklığında folyo ve kaya sintilasyon şişenin kapağı.
- İstenilen gen ekspresyonu açıkça görünür oluncaya kadar renk reaksiyonu her 15 dk izleyin. Güçlü probları geliştirmeye kadar az 10 dakika sürebilir. Zayıf probları 1-2 saat sürebilir. Reaksiyon çok uzun veya arka plan boyama (bütün embriyo donuk mor ya da kahverengi rengini açmak için başlar) görünmeye başlayacaktır için gitmesine izin vermeyin.
- Oda sıcaklığında, sallanan at PBT her birinde 10 dk için 2 kez yıkayın.
- % 4 paraformaldehit içinde Postfix embriyolar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.1 glutaraldehid. Embriyolar 4 ° C'de fiksatif süresiz mağaza olabilir
- Diseksiyon steriomikroskop embriyolar görselleştirin. Ön sertleştirilmiş% 1 agaroz / PBS ile bir tabak resimleri, yer embriyolar için açık mavi arka plan üretmek için.
7. Deniz elasmobranchs in situ hibridizasyon I. RNA Tüm Mount Temsilcisi Sonuçlar
Sonic hedgehog (Shh) ve paten embriyolar Hoxa13 in situ 'in ekspresyonu gösteren bütün RNA bağlama Şekil 1' de gösterilmiştir. Yüksek omurgalılarda Şşş İfade Notokordun ve gut endoderm bulunur ve bu ifade deseninin paten (Şekil 1a) 8,9 korunur. Deniz elasmobranchs salgılar tuzları rektal bezi kullanan osmoregülasyon benzersiz bir yöntem var. Hoxa13 ifade (Şekil 1b) 10 gelişmekte olan rektal bezinde yüksek. Rektal bezi bilinmemektedir desenleme Hoxa13 gen ürünü rolü.
II. Parafin Gömme ve Elasmobranch Doku Kesit
1. Hasat ve Doku hazırlanması
- İstenilen doku inceleyin ve oda sıcaklığında sallanan, 24-48 saat süreyle% 10 formalin içinde düzeltmek. % 4 paraformaldehit (PFA), aynı zamanda, bir tespit maddesi olarak kullanılabilirler(Tartışma bakın).
- 30 dakika her biri için, 3 kere PBS ile yıkanarak fiksatif yıkayın. Doku ve boyutuna bağlı olarak, yıkama kere 10 dakika için azaltılabilir ya da 1 saat için artmıştır.
- Oda sıcaklığında PBS sallanan:% 25,% 50 ve% 75 etanol, etanol dizi yıkama ile embriyolar kurutmak. Yine, her bir yıkama için zaman doku boyutuna bağlı olacaktır. 0.5 cm doku 3 için, 15 dakika için her bir yıkama inkübe edilir. Büyük parçalar için süreyi artırın. Doku ve uzun süreli depolama arzu edilirse, bir yıla kadar -20 ° C'de% 75 etanol ve depo içinde ek bir iki kere yıkayın. Aksi takdirde bir sonraki adıma geçin.
- Ayrıca sallanan, her biri için 15 dakika% 100 etanol içinde 3 kere yıkama ile kurutmak.
2. Gömülmesi ve Kesit Parafin
- Vidalı kapaklı kapaklı cam sintilasyon şişeleri 5 dk her ksilen 2 kez yıkanarak doku netleştirin. Ksilen doku kırılgan hale getirecek, tabii ki için 10 dakikalık bir toplam aşmayanhes. Eğer bir ışık o kadar tuttuğunuzda doku saydam bakmak gerekir. Doku iki yıkamadan sonra hala çok opak ise, protokol ile devam sonra 5 dakika için ksilen içinde ek bir yıkama yapmak ve. Sadece eldiven ile bir davlumbaz içine ksilen anlaştım.
- Ksilen çıkarın ve erimiş parafin ile 2/3 dolu sintilasyon flakon doldurun. 30 dakika için bir 60 ° C fırın içinde inkübe edin. Şişenin içine parafin koyarak zaman, parafin flakon kenarları boyunca katılaşmaya göreceksiniz. Fırında şişeye yerleştirin ve parafin, bir kaç dakika için yeniden çözmek için izin verir. Fırından çıkardığınız flakon çıkarın ve çözüm inkübasyon kalanı için fırında karıştırmak ve değiştirmek için hızlı girdap verir.
- Tekrar parafin 30 dakika boyunca iki kez daha inkübasyonlar.
- Bir saat her iki parafine inkübe edin. Parafin son bir kez değiştirin ve 60 ° C fırında gece inkübe.
- Ertesi gün, 2-3 saat için vakum altında ısıtılmış bir parafin haznesi ve yerinde doku yerleştirmek. Bu doku içine parafin geçişlerini kolaylaştırmak ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak olacaktır. Ince doku bazı tipleri için bir vakum adım gerekli değildir, ancak bu insan embriyosu ya da sindirim sistemi ve lümen bölmeli diğer organlar için gerekli olabilir.
- Erimiş parafin ve bir buz plaka üzerinde serin bir metal kalıp içinde doku, yer doku infiltrasyonu vakum kolaylaştırdı sonra. Kalıptan doku çıkarmak için çalışmadan önce buz üzerinde ya da 4 ° C'da gece boyunca bekletin. Dokusunun parafin blokları 4 ° C'de süresiz olarak saklanabilir
- Sıra parafin bir mikrotom üzerine blok ve 8 mikron bölümleri kesmek. Bölümler ° C 48 ısıtılmış bir su banyosu üzerinde süzülüyor ve cam Superfrost * Plus slaytlar monte edilmelidir.
- Bir 37 ° C fırın içinde gece boyunca kurumaya kayar.
- Ihtiyaç ° C ye kadar 4 Mağaza bölümleri.
III. Alsiyan Mavi / Nükleer Hızlı Kırmızı Elasmobranch Doku Leke
1. Alsiyan Mavi Mukinler için Leke
- Sıra sıcak bir slayt üzerinde yukarı bakacak bölümleri ile slaytlar. 45 dakika eritin.
- Sıra bir slayt tutucunun içine kayar. Tüm sonucu çözümleri davlumbaz içine küvetler bulunur. Slaytlar başka bir solüsyon ile bir küvet arasında transfer ile yıkanır. Küvetler çözüm düzeyleri slaytları kapsar emin olun; slaytlarda dokuların tamamen su altında. 5 dakika her ksilen slaytları 2 kez yıkanarak parafin eritilir.
- 1 dakika her biri için% 100 etanol ile slaytlar iki kez yıkayın.
- 1 dakika için her çözüm yıkama bir etanol dizi slaytları (% 75,% 50,% 25 etanol) rehidrate. 1 dakika dH 2 O yıkayın.
- 15 dakika Alsiyan Mavi Çözüm, pH 2.5 Leke.
- 3 dakika süreyle akan su ile yıkama ile leke geliştirin. DH 2 O zamanlar batırın
- 10 dakika için Nükleer Fast Red Counterstain çözelti içinde Counterstain.
- 3 dakika süreyle akan su içinde yıkayın ve dH 2 O bir kez daldırma.
- Dehidrnateeğimler 20 her biri, ya da 1 dakika her biri için bir dizi etanol (% 25,% 50,% 75,% 100,% 100) halinde aminoasit, karbonhidrat. 5 dakika her ksilen 2 kez yıkayın. DPX montaj orta ve lamelleri ile monte edin. Slaytlar manipüle önce davlumbaz 48 saat süreyle kuru ve sertleşmeye orta montaj izin ver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L. farklı bölgelerinde alcian blue boyama örnekleri erinacea sindirim sistemi Şekil 2 'de gösterilmiştir. Globlet hücreleri içeren Asit musin sindirim sistemi boyunca leke alcian blue tarafından net bir şekilde görülebiliyor. Asit müsin dağılımı dolayısıyla fonksiyon farklılıkları yansıtan, sindirim sisteminin farklı bölgelerinde farklıdır. Asit müsin yüksek konsantrasyon distal barsakta (2b Şekil 2a ve 2c karşılaştırın) tespit edilirken Asidik müsin seyrek, spiral bağırsak ve kloaka üretilmektedir.
| PBT | 1 x PBS |
| % 0.1 Tween-20 | |
| Nalgene tipi doku kültürü filtre üniteleri filtre sterilize. | |
| 20 x SSC, pH 4.5 </ Td> | 3 M NaCl |
| 0.3 M NaCitrate | |
| Sitrik asit ile pH ayarlayın. | |
| Hibridizasyon çözümü | % 50 formamid |
| 1.3 x SSC, pH 4.5 | |
| 5 mM EDTA, pH 8 | |
| 50 mg / ml tRNA | |
| % 0.2 Tween-20 | |
| % 0.5 Chaps | |
| 100 mg / ml heparin | |
| Bir yıla kadar -20 ° C'de kısım ve mağaza. | |
| Proteinaz K | 10 mg / ml stok çözeltisi |
| -20 ° C'de 0.5 ul Eppendorf benzeri tüpler ve depoya 20 ul alikotları | |
| Çözüm # 1 | % 50 formamid |
| 1.3 x SSC, pH 4.5 | |
| % 0.2 Tween-20 | |
| -20 ° C'de saklayın | |
| Çözüm # 2 | % 50 formamid |
| 1 x SSC, pH 4.5 | |
| % 0.2 Tween-20 | |
| -20 ° C'de saklayın | |
| Koyun serum | 55 ° -20 1 saat ve alikotları mağaza için C ° C'ye ısıtılarak Inactivate |
| 10 x TBS | 80 g NaCl |
| 2 g KCI | |
| 250 mi, 1 M Tris-HCI, pH 7.5 | |
| 1 L su ekleyin | |
| 1 x TBST | 1 x TBS |
| % 0.1 Tween-20 | |
| NTMT | 100 mM NaCl |
| 100 mM Tris-HCI, pH 9.5 | |
| </ Td> | 50 mM MgCl2 |
| % 0.1 Tween-20 | |
| Kullanarak ve filtre önce yaklaşık 100 ml taze olun. | |
| 200 x NBT stok | % 70 dimetil formamid içinde 50 mg / ml NBT |
| 1 ml alikotları -20 ° C'de saklayın. | |
| 200 x BCIP stok | Su içinde 25 mg / ml BCIP |
| 1 ml alikotları -20 ° C'de saklayın. |
Tablo 1. In situ çözümleri bütün montaj RNA.
| Plasmid Doğrusallaştırılmış | 8 ul |
| 10 x transkripsiyon tamponu | 4 ul |
| DIG-UTP nükleotid karışımı | 2 ul |
| RNAse inhibitörü | 0.5 ul |
| RNApolimeraz (SP6, T3 veya T7) | 1 ul |
| RNAse içermeyen steril H 2 0 | 4.5 ul |
| Toplam hacmi | 20 ul |
Tablo 2. Transkripsiyon reaksiyon RNA probu elde edilmektedir.
Şekil 1. Şşş ve Leucoraja erinacea embriyolarda Hoxa13 ekspresyonu in situ hibridizasyon RNA bütün mount tarafından görüntülenmiştir. (A) Şşş ifadesi bir sahne 29 paten embriyo tespit edilir. (A ') Yüksek büyütme (a) içinde Şşş ifade ortaya Notokordun (ok başları) ve gut endoderm (oklar). (b) Hoxa13 exyon bir sahne 29 paten embriyo rektal bezi (ok) lokalize (b) 'de embriyo (b') Dissected sindirim yolu rektal bezine Hoxa13 transkript ifade özgüllük gösterir e, endoderm,.. n, Notokordun ;. rg, rektal bezi büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Asidik müsin üreten goblet hücrelerinin paten sindirim sistemi. (A, c) Düşük miktarda asidik müsin üreten goblet hücrelerinin dağılımı alcian blue (oklar), sırasıyla, spiral bağırsak ve kloakında leke ile tespit edilir. (B)Distal barsakta asidik müsin goblet hücreleri (oklar) daha yüksek yoğunlukta bulunur. Tüm panelleri yılında, çekirdekler leke nükleer hızlı kırmızı açıkça görebilir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan protokoller gen ekspresyonu izlenmesi ve farklılaşmış hücre türleri tespit için klasik yöntemlerdir ve deniz elasmobranchs kullanım için adapte edilmiştir. Bu protokollerin ayrıntılı değişiklikler farklı elasmobranch türlerin uyum için gerekli olabilir.
In situ 's RNA bütün montaj ile ilgili en yaygın endişe RNaz kontaminasyon riski ve böylece RNA probu ve endojen mesajları kayıplardır. İki yönleriyle dikkate alınması gerekir: Spastine Özgü Riboprop sentezi ve hibridizasyon embriyonik mesajları ve RNA işlemek için genel teknikleri. Genel olarak, ribonükleazlar tarafından kontaminasyon açılmamış kaplarda gelen plasticware kullanarak kaçınılması, ve daha önce kullanılmamış cam olabilir. Yeni cam kullanılamıyorsa, RNaz-AWAY (VWR # 17810-491) ile tüm cam tedavi. Yıkama hafifçe delikli bir kaşık ile çözüm dökülen ve flakon taze solüsyon eklenerek yapılır.Alternatif olarak, çok küçük embriyolar ya da organ / doku 6-iyi doku kültürü çanağı içine uyan bir Netwell olarak yerleştirilebilir. Doku sadece bir sonraki ile de bir ikinci Netwell kaldırarak bir çözelti diğerine hareket ettirilebilir. Bu dökerek herhangi bir doku kaybını önlemeye yardımcı olur ve ayrıca doku mimarisi korur. RNA işlenmesi ve RNaz kontaminasyonu önlemek için ek önerileri Moleküler Klonlama bulunabilir; Roche (dahil A Laboratory Manual, ve birçok ilaç web sitelerinde, http://www.roche-applied-science.com/labfaqs/p2_1.htm ) 11 .
RNA probu üretimi ve embriyoların tedavi öncesi ve hibridizasyon ribonükleazlar ile kontaminasyona en savunmasız adımlardır. Yerli mRNA transkript tamamlayacak antisens RNA problar pr in vitro ters transkripsiyon tarafından sentezlenendigoxigenin-UTP aroması. Kısaca, plazmit olan cDNA yer geninin 5 'sonunda bulunan bir benzersiz kısıtlama enzimi ile doğrusallaştırılmış. RNA polimeraz gen sonunda düşmek için bu sağlar. Plasmid, sadece 3 'stop kodonu için mevcut olan RNA polimeraz promotörünü tespit ederek bir RNA polimeraz seçin. T3 ve T7 RNA polimeraz çoğu pBluescript için kullanılsa da, SP6 yönlü pGEM plazmidler alt klonlandı genler için bir seçimdir. RNaz inhibitörü ek olarak, DEPC işlenmiş su prob transkripsiyon reaksiyonu ve arıtma kullanılır. Hibritleşme çözüm ve embriyoların tedavi öncesi PBT kullanarak adımları tüm DEPC su ile yapılmalıdır. DEPC tedavi su, büyük bir balonda su 1 L DEPC 1 ml ekleyin ve iyice karıştırın. Bir kukuleta gecede bırakın ve ertesi gün otoklavlamayın. , 10 x PBS ve SSC gibi çözümler de DEPC işlenmiş su ile yapılabilir. Melezleştirmeden sonra Spastine Özgü Riboprop ile, RNaz-serbest kullanımı bu yüzdençözümlerle ve benzeri önlemler artık gerekli değildir.
Dikkate değer ek değişkenler konsantrasyonu ve prob penetrasyon etkileyebilir proteinaz K tedavi süresi vardır. Proteinaz K stok dikkatli bir titrasyon farklı embriyonik aşamalarında tedavi süresini optimize etmek için tavsiye edilir. Protokolü Burada anlatılan rutin ve başarıyla aşamalarında 20 embriyolar ile kullanılır olmuştur - Ballard 7'ye göre 31. Çok genç ya da özellikle "yapışkan" Doku için olan embriyolar için, deterjan Tween-20 Triton-X ile değiştirilebilir. Ek olarak, iletişim kuralı için gene özel modifikasyonları transkript çokluğuna bağlı olarak gerekli olabilir. Arka planı azaltmak için,% 10 dimetilformamit rutin olarak çeşitli gruplar tarafından 12 geliştirme çözeltisi (NTMT) ilave edilmiştir.
In situ 's RNA hassas doğası aksine, histoloji sevinç olduğunuhızlı ve oldukça sağlam olduğunu! Boyama herhangi bir değişkenlik olasılıkla yetersiz fiksasyon kaynaklanmaktadır. Doku tamamen sabittir sağlamak için, çok büyük dokular (örneğin bir yetişkin hayvanın sindirim sistemi gibi) küçük parçalara ve taze fiksatif çözüm içine disseke olması tavsiye edilir bir 48 saatlik süre boyunca her 10 saat değiştirilir. Bu tespit için koşulları optimize etmek için gerekli olabilir, her ikisi altında ve üstünde sabit kesit doku zayıf ya da pürüzlü boyama meydana gelebilir. Buna ek olarak, farklı histokimyasal lekeleri farklı fiksatif ile en iyi şekilde çalışır. Bu nedenle, 13 ikinci histokimyasal leke göre sabitleştirici modifiye değer. Yumuşak doku organ veya genç embriyoların düzeltirken% 4 paraformaldehid tavsiye edilir. Büyük embriyolar ya da bütün hayvanlar için% 10 formalin tercih edilir. Bir kez doku parafin kesitleri, bir in situ 'ler de dahil olmak üzere RNA, farklı amaçlar için kullanılabilir. Bu hücresel lev üzerinde gen ekspresyonu çözünürlük sağlarEl. Alternatif olarak, bölümler farklılaşmış hücre türlerini tanımlamak için farklı histokimyasal boyalar ile boyanmıştır olabilir.
Alcian blue ve nükleer hızlı kırmızı boyanma başarıyla paten (Leucoraja erinacea), dogfish (Squalas acanthias), balık asalağı (Myxine glutinosa) ve taşemen (Petromyzon marinus), (yayınlanmamış sonuçlar) 10,14 olarak gerçekleştirilmiştir. Alcian mavi pH ek olarak 2,5 alcian mavi çözeltinin pH farklı mucosaccharides (yani sialo-versus sulfomucins) 13 ayırt edebilir değiştirerek, burada açıklanan leke. Farklı mucosaccharide bileşenlerin sindirim 15,16 içindeki işlevi ve lokalizasyonu ile goblet hücreleri ayırt edebilirsiniz. Alcian mavi gibi Barrett özofagus gibi durumların teşhis ve pankreatik beta hücre granülleri 17,18 boyanma geliştirmek için kullanılır olmuştur sindirim sisteminde leke.
Özetlemary, histokimyası ve birlikte kullanılan in situ 's tüm montaj RNA gen gelişme ve sonuç farklılaşmış hücre tipi sırasında ifade nerede arasındaki bağlantıyı daha iyi anlaşılmasına yol açabilir. Posterior Hox genlerinin ekspresyonu gelişimi sindirim sisteminde 10,19 asit müsin goblet hücrelerinin özellikleri ile bağlantılı olmuştur. Burada, Shh ifadesi ve L. asit müsin üreten goblet hücrelerinin varlığı ile birlikte, bir Hox genin bir örneği sağlamak erinacea sindirim sistemi. Bu teknikler, geniş ölçüde elasmobranchs, farklı gelişimsel modelleme genleri ve farklı histolojik erinın farklı türlere uygulanabilir. Deniz elasmobranchs için sürekli uygulama ve tekniklerinin adaptasyonu fizyolojisi biyomedikal araştırma modelleri için bu hayvanların geniş kullanımı, endokrinoloji, toksikoloji ve genomik ayak uydurmak önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ben ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Benim laboratuvarda çalışmış ve bu protokollerin evrimine katkıda bulunduğu birçok lisans öğrencilerine teşekkür etmek istiyorum. NAT Skidmore-Sendika Ağı, hibe ÖDENEN bir NSF ADVANCE ile kurulmuş bir proje destek aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. | |||
References
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T. Physiology of elasmobranch fishes. Shuttleworth, R. , Springer-Verlag. 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2, Battelle Press. (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
