Summary
Комбинируя методы РНК целом креплением
Protocol
I. РНК Всего горы в гибридизация в морских хрящевых рыб
1. Фиксация эмбрионов и подготовка
- Skate эмбрионы могут быть организованы в соответствии с Ballard 7. Оптимальное этапы для выявления экспрессии генов в зависимости от ткани интерес. Для отслеживания экспрессии генов в пищеварительном тракте кататься на коньках, этапы 27-30 оптимальные 7.
- Проанализируйте эмбрионов в PBS, отделяя эмбрионы из желточного мешка.
- Исправить в 30 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида (PFA) в 50 мл коническую трубку при 4 ° С с нежным качалки. Исправить в течение 24 часов.
- Промойте эмбрионы в PBT, дважды в течение 15 мин, вращающаяся при комнатной температуре. Все рецепты решения для РНК целом крепления на месте "с включены (табл. 1).
- Высушить эмбрионов промывкой в метаноле серия 25%, 50% и 75% метанола: PBT качалке при комнатной температуре. Продолжительность промывки зависит от стадии эмбрионов. Для Pre-Neurulation поставил эмбрионов, 5 мин каждого мытья в метаноле серии является достаточным. Для эмбрионами старше этапе 30, моет может длиться до 30 минут. Чтобы определить, если эмбрионы достаточно проникла и приспособиться к каждой стирки, удерживая трубу в вертикальном положении в ваших руках. Если зародыши опускаются на дно пробирки, то вы готовы к следующей стирки. Если эмбрионы плавают в начало решения, изменить решение и повторяю, что особенно обезвоживание шаг.
- Мыть два раза в 100% метаноле в течение 10 минут нежно качалке.
- Как только обезвоженный до 100% метанола, эмбрионы должны храниться при температуре -20 ° C в течение не менее 24 часов, прежде чем приступить к протоколу. Эмбрионы были успешно хранят при температуре -20 ° C и используется для РНК весь транспорт на срок до 1 года.
2. Синтез РНК-зонда
- Создание линейного фрагмента гена, экспрессия которого вы хотите обнаружить. Это может быть сделано либо путем ПЦР-амплификации или линеаризации плазмиды с геноминтерес. Чтобы усилить с помощью ПЦР, выбрать праймеры которого сайтов связывания фланга ген вставить и сохранить РНК-полимеразы сайтов связывания в регионе усиливается. Для часто используемых плазмиды, такие как PBS или pGEM, M15 прямого и обратного праймеров являются идеальным выбором. Кроме того, линеаризации плазмиды путем расщепления 15 мкл ДНК QIAGEN Miniprep с ферментом, который расщепляет на 5 'конце гена. Гель извлечь и очистить помощью соответствующего комплекта QIAquick.
- Обратный транскрибировать РНК с использованием зонда 8 мкл линейные плазмиды или 100 нг ПЦР-продукт в качестве шаблона, используя соответствующие РНК-полимеразы (см. Таблицу 2 для транскрипции реакции).
- Инкубируйте реакции обратной транскрипции в течение 2 часов при температуре 37 ° C.
- Для подтверждения реакции, запустить 1 мкл транскрипции реакции на 1% агарозном / TAE геля. Выполнить геля при 100 mVolts, пока краситель просто запустить в гель. Один видный группа должна быть видна. Линейный фрагмент ДНК-матрицы может быть слабым видимым при более высокой молекулярнойLAR веса.
- Добавить 1 мкл РНКазы без ДНКазы реакции транскрипции и инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин.
- Для осадок, добавляют 100 мкл TE рН 8, 10 мкл 4 М LiCl, 300 мкл 100% этанола и инкубировать при температуре -20 ° С в течение не менее 60 минут или на ночь.
- Спин в течение 10 мин в 4 ° C микроцентрифуге при 14000 оборотах в минуту.
- Вымойте гранул с 70% этанола и сухой воздух.
- Ресуспендируют РНК-зонд в 20 мкл дН 2 O. Добавить 80 мкл буфера гибридизации (гибридизации буфер должен быть предварительно нагревают до 70 ° C). Зонд может быть сохранен в 80% гибридизации буфер в течение нескольких месяцев при температуре -20 ° C или больше при температуре -80 ° C.
3. Эмбрион предварительной обработки и гибридизация
- Удалить эмбрионы хранятся в 100% метанола от -20 ° C. Для молодых эмбрионов переходите к шагу (3,2). Для дальнейшего поставил эмбрионов (этап 29/30 <) вы можете увидеть слой эпидермиса, который "поднял" от тела эмбриона. Под микроскопом, тщательно диссECT от эпидермального слоя, чтобы максимально проникающий зонд.
- Место эмбрионов в чистом флаконы сцинтилляционного стекла. Увлажняет эмбрионов в обратном серии метанола описано выше: (75%, 50%, 25% метанола: PBT) по покачиваясь каждое решение в течение 5-30 мин каждый при комнатной температуре. Полное регидратации с двумя промывками ПБТ в течение 10 минут каждый, мягко покачиваясь.
- Для удаления пигмента, отбеливание эмбрионов с 6% перекиси водорода в PBT в течение 1 часа при комнатной температуре, покачиваясь.
- Удалить перекиси водорода стиральная три раза в PBT, (покачивание при комнатной температуре 10 мин каждая).
- Лечить эмбрионов с протеиназы К, чтобы обеспечить проникновение зонда при гибридизации. Количество протеиназы К и продолжительность лечения зависит от ткани вы хотите проверить и возраст эмбриона. Более поверхностные ткани и младшего эмбрионы требуют более коротких и менее протеиназы К, в то время как более глубокие ткани и старше эмбрионы требуют более высокой концентрации и длительном лечении Тимомэлектронной полностью permeabilize эмбриона для зонда гибридизации. Например, для обнаружения Shh в кишечнике энтодермы стадии 29 эмбрионов кататься на коньках, 30 мкг / мл протеиназы К / PBT инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Быстро промыть эмбрионов в PBT, чтобы смыть протеиназы К.
- Чтобы отключить протеиназы К, Postfix эмбрионы с 4% PFA, 0,2% глутарового альдегида в PBT в течение 20 мин, мягко покачиваясь.
- Мыть два раза в течение 10 мин с PBT.
- Для предварительной гибридизации, добавить 2-3 мл подогретого гибридизации решение эмбрионов, достаточно, чтобы покрыть их. Рок мягко подогревом водяной бане при температуре 70 ° С в течение 1 часа.
- Чтобы подготовить раствор для гибридизации, разогрейте РНК-зонд до 70 ° С в течение 10 мин и прохладной на льду. Развести 15-20 мкл РНК-зонд до 2 мл свежей предварительно нагретый раствор гибридизации для получения конечной концентрации 0,5-1,0 мкг / мл. Удалите предварительно Hybe и добавить разбавленный зонд РНК эмбрионов. Эмбрионы должны быть просто покрыта раствором,дд более гибридизации решение, если это необходимо. Плотно закрыть крышкой сцинтилляционный флакон. Гибридизации по покачиваясь в отапливаемом водяной бане при температуре 70 ° С в течение ночи.
4. Сообщение Гибридизация автомойки и антител Гибридизация
- Удалите раствор для гибридизации с зондом из эмбрионов и место в свежей флаконе сцинтилляционный или Eppendorf трубки. Зонд можно хранить при температуре -20 ° C и повторно использовать в будущем. Для пост-гибридизации моет, место эмбрионов в Netwell сидит в 6-луночный планшет для культивирования тканей.
- Промыть 3 раза по 30 минут в каждом из подогретого Решение № 1, раскачиваясь при 70 ° C.
- Промыть 3 раза по 30 минут в каждом из подогретого Решение № 2, раскачиваясь при 70 ° C.
- Промыть 3 раза по 5 мин в TBST, раскачиваясь при комнатной температуре.
- Предварительно блок с 10% инактивированной сыворотки овец в TBST в течение 1 часа, покачиваясь при комнатной температуре.
- Трансфер эмбрионов из Netwell на свежий флакон сцинтилляционного стекла. Добавить анти-DIGFab фрагментов (1:5000) в 1% инактивированной сыворотки овец / TBST для эмбрионов. Рок течение ночи при 4 ° C.
5. Гибридизация Сообщение антител Моет
- Удалить антител и выбросить. Место эмбрионов обратно в Netwell для мытья.
- Промыть 3 раза по 5 мин в TBST, раскачиваясь при комнатной температуре
- Мыть не менее 6 раз в течение 1 часа каждый, раскачиваясь при комнатной температуре.
- Мыть на ночь в TBST, раскачиваясь при 4 ° C. Как моет сообщение антител помочь сократить на фоне окрашивание, максимальное количество и продолжительность мытья предпочтительнее. Эмбрионы регулярно мыть в TBST при 4 ° C, в минувшие выходные.
6. Обнаружение Probe
- Макияж свежий раствор NTMT и фильтрации стерилизации.
- Откажитесь TBST промывочного раствора и место эмбрионов в чистую пробирку сцинтилляционного стекла. Промойте эмбрионы 3 раза в свежем NTMT в течение 10 минут каждый при комнатной температуре, качалки.
- Удалить NTMT вымыть и добавить реакционной смеси1 х NBT / 1 х BCIP в NTMT. Поскольку эти реагенты являются светочувствительными, накрыть сцинтилляционных флаконов в фольгу и рок-при комнатной температуре.
- Монитор цветной реакции каждые 15 мин до желаемой экспрессии гена ясно видно. Сильные зондов может занять всего 10 минут, чтобы развиваться. Слабые зондов может занять 1-2 часа. Не позволяйте реакции идут слишком долго или фоновое окрашивание начнут появляться (весь эмбрион начинает превратить скучный фиолетовый или коричневый цвет).
- Промойте 2 раза по 10 минут в каждом из PBT при комнатной температуре, качалки.
- Postfix эмбрионов в 4% параформальдегид, 0,1% глутарового альдегида в течение 1 часа при комнатной температуре. Эмбрионы могут быть магазина на неопределенный срок в фиксаторе при 4 ° C.
- Визуализация эмбриона с рассекает стереомикроскопа. Для получения светло-голубой фон для фотографий, место эмбрионов в чашке с предварительно закаленной 1% агарозном / PBS.
7. Представитель Результаты I. РНК Всего горы в гибридизация в морских хрящевых рыб
РНК целые горы на месте "с изображающих выражение Еж Соник (Shh) и Hoxa13 в эмбрионах конька показано на рисунке 1. Экспрессия Shh у высших позвоночных находится в энтодерме хорда и кишечник, и это выражение шаблон сохраняется в конька (рис. 1а) 8,9. Морские хрящевых рыб имеют уникальный метод, который использует осморегуляции ректальные железы выделяют соли. Hoxa13 выражение высокой в развивающихся ректальные железы (рис. 1b) 10. Hoxa13 продукт гена роль в формировании паттерна ректальные железы остается неизвестной.
II. Парафин вложения и секционирования пластиножаберных тканей
1. Урожая и подготовка ткани
- Проанализируйте нужную ткань и закрепите в 10% формалине в течение 24-48 часов, раскачиваясь при комнатной температуре. 4% параформальдегида (PFA) также может быть использована в качестве закрепителя(См. Обсуждение).
- Промойте фиксатором промывкой в PBS 3 раза в течение 30 минут каждый. В зависимости от размера ткани, стиральные раз может быть уменьшено до 10 мин или увеличить до 1 часа.
- Высушить эмбрионов промывкой в этаноле серия 25%, 50% и 75% этанола: PBS качалке при комнатной температуре. Опять же, время для каждой стирки будет зависеть от размера ткани. Для 0,5 см 3 ткани, инкубировать каждого мытья в течение 15 мин. Увеличение времени для больших кусков. Если длительном хранении ткани желательно, мыть еще два раза с 75% этанола и хранят в -20 ° C на срок до одного года. В противном случае переходите к следующему шагу.
- Дальнейшая обезвоживанию промыванием 3 раза в 100% этаноле в течение 15 минут каждый, покачиваясь.
2. Парафин вложения и секционирования
- Уточнить ткани, стиральные 2 раза в ксилоле в течение 5 мин в стеклянные сцинтилляционные флаконы с крышками винтовой крышкой. Ксилол будет оказывать ткани хрупкими, поэтому не превышает в общей сложности 10 мин былоГЭС. Ткань должна выглядеть полупрозрачными, когда вы держите его к свету. Если ткань по-прежнему очень непрозрачная после двух стирок, делать дополнительные мыть в ксилоле в течение 5 мин, а затем приступить протокол. Только обрабатывать ксилол внутри вытяжного шкафа в перчатках.
- Удалить ксилол и заполнить сцинтилляционный флакон на 2/3 с расплавленным парафином. Инкубируйте в 60 ° C духовке в течение 30 мин. При установке парафин во флакон, вы заметите, парафин укрепить по бокам флакона. Поместить флакон в духовку и дайте парафин повторно растворяется в течение нескольких минут. Возьмите пузырек из духовки и дать решение быстрый водоворот, чтобы смешивать и заменить в духовке в течение оставшейся части инкубации.
- Повторите парафин инкубации еще два раза в течение 30 мин.
- Инкубируйте в парафин два раза в течение часа каждый. Изменение парафина в последний раз и инкубировать в течение ночи в 60 ° C духовке.
- На следующий день, поместить ткань в ванну с подогревом камеру парафин и место под вакуумом в течение 2-3 часов. Это будет способствовать проникновению парафина в ткани и удалить пузырьки воздуха. Для некоторых типов тонких тканей, вакуумные шаг может и не потребоваться, но это необходимо для целого эмбриона или желудочно-кишечного тракта и других органов просвета отсеков.
- После вакуумной способствовало проникновению ткани, места ткани в металлическую форму с расплавленным парафином, и прохладно на ледяной пластины. Оставить на льду или при температуре 4 ° С в течение ночи, прежде чем пытаться удалить ткань из формы. Парафиновые блоки ткани могут храниться неопределенно при 4 ° C.
- Место парафинового блока на микротома и сократить 8 мкм разделов. Разделы должны быть размещены на водяной бане нагревают до 48 ° С и установлены на стекло Superfrost * слайды Plus.
- Сухие горки на ночь в духовку на 37 ° C.
- Магазин разделов при 4 ° С до необходимости.
III. Alcian Blue / Ядерная Быстрый красное пятно из ткани пластиножаберных
1. Alcian синевы для Муциньш
- Место слайды с разделами вверх на слайде теплее. Растопить в течение 45 мин.
- Место скользит в держателе слайдов. Все последующие решения, содержащиеся в кадках внутри вытяжного шкафа. Слайды промывают путем перевода их из одной ванны с раствором в другой. Убедитесь в том, что решение уровня в ваннах охватывает слайдов; ткани на слайдах они полностью погружены. Растворите парафина стиральная слайды 2 раза в ксилоле в течение 5 минут каждый.
- Вымойте слайды в два раза со 100%-ным этанолом в течение 1 мин каждая.
- Увлажняет слайды в серии этанола (75%, 50%, 25% этанола) мытье в каждом решении в течение 1 мин. Стирать в дН 2 O в течение 1 мин.
- Пятно в Alcian синий раствор, рН 2,5 в течение 15 мин.
- Разработка пятно промывкой в проточной воде в течение 3 мин. Опустите один раз в дН 2 O.
- Контрастирующая в ядерной Fast Red решение контрастирующая в течение 10 мин.
- Промыть в проточной воде в течение 3 мин и окунуться в дН 2 O один раз.
- Дегидратацииdrate в серии этанола (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) в течение 20 провалов каждый, или 1 мин каждая. Промойте 2 раза в ксилоле в течение 5 минут каждый. Установить с DPX монтажа средних и покровные. Разрешить монтажа средних сухой и затвердеть в течение 48 часов в вытяжном шкафу до манипулирования слайдов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Примеры альциановым синего окрашивания в различные регионы L. erinacea тракта пищеварительного показано на рисунке 2. Кислота муцина содержащие globlet клеток четко видны на альциановым синие пятна на всем протяжении пищеварительного тракта. Распределение кислоты муцин отличается в различных регионах желудочно-кишечного тракта, таким образом, отражает различия в функцию. Кислотные муцинов которые редко производятся в кишечнике спирали и клоаки, в то время как высокая концентрация кислоты муцин обнаруживаются в дистальных отделах кишечника (ср. рис 2а и 2в с 2б).
| PBT | 1 х PBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| Фильтр-стерилизовать в Nalgene типа культуры ткани фильтровальные установки. | |
| 20 х SSC, рН 4,5 </ TD> | 3 М NaCl |
| 0,3 М NaCitrate | |
| Отрегулируйте рН с лимонной кислотой. | |
| Раствор для гибридизации | 50% формамида |
| 1,3 х SSC, рН 4,5 | |
| 5 мМ ЭДТА, рН 8 | |
| 50 мг / мл тРНК | |
| 0,2% Tween-20 | |
| 0,5% Chaps | |
| 100 мг / мл гепарина | |
| Аликвоты и хранят при -20 ° C на срок до одного года. | |
| Протеиназы K | 10 мг / мл маточного раствора |
| 20 мкл аликвоты в 0,5 мкл Eppendorf, как трубы и хранить при температуре -20 ° C. | |
| Решение № 1 | 50% формамида |
| 1,3 х SSC, рН 4,5 | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Хранить при -20 ° C | |
| Решение № 2 | 50% формамида |
| 1 х SSC, рН 4,5 | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Хранить при -20 ° C | |
| Овцы сыворотке | Деактивировать при нагревании до 55 ° C в течение 1 часа, и хранить в аликвоты при -20 ° C. |
| 10 х TBS | 80 г NaCl |
| 2 г KCl | |
| 250 мл, 1 М Трис-HCl, рН 7,5 | |
| Добавить воды до 1 л | |
| 1 х TBST | 1 х TBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| NTMT | 100 мМ NaCl |
| 100 мМ Трис-HCl, рН 9,5 | |
| </ TD> | 50 мМ MgCl 2 |
| 0,1% Tween-20 | |
| Сделать примерно 100 мл свежего перед использованием и фильтр. | |
| 200 х НБТ складе | 50 мг / мл НБТ в 70% диметилформамиде |
| Хранить в -20 ° C в 1 мл аликвоты. | |
| 200 х BCIP складе | 25 мг / мл BCIP в воде |
| Хранить в -20 ° C в 1 мл аликвоты. |
Таблица 1. РНК целые горы на месте решений.
| Линеаризованной плазмиды | 8 мкл |
| 10 х транскрипции буфер | 4 мкл |
| DIG-UTP нуклеотидные смеси | 2 мкл |
| РНКазы ингибитора | 0,5 мкл |
| РНКполимеразы (SP6, Т3 или Т7) | 1 мкл |
| РНКазы стерильной H 2 0 | 4,5 мкл |
| Общий объем | 20 мкл |
Таблица 2. Расшифровка реакции для получения РНК-зонда.
Рисунок 1. Shh и Hoxa13 выражение в Leucoraja эмбрионов erinacea визуализируются с помощью РНК целые горы в гибридизация. (А) Shh выражение обнаружен в стадии 29 коньков эмбриона. (А ') Высшая увеличения () показывает, Shh выражение в хорды (наконечники стрел) и энтодермы кишечника (стрелки). (б) Hoxa13 бывшихВыражение локализуется в ректальной железы (стрелка) этапе 29 коньков эмбриона (б ') расчлененный пищеварительного тракта от эмбриона в (б) демонстрирует специфичность Hoxa13 стенограммы выражение ректальные железы е, энтодермы;.. п, хорда ,. Р.Г., ректальные железы Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Распределение кислой муцин-производителей бокаловидных клеток в желудочно-кишечном коньках пищеварения. (А, с) Низкое количество кислых муцин-продуцирующие клетки кубок обнаруживаются альциановым синевы в кишечнике спирали и клоаки, соответственно (стрелки). (Б)Дистального кишечника содержит более высокую плотность кислой муцин бокаловидных клеток (стрелки). Во всех панелей, ядра хорошо видны по ядерной быстрый красные пятна. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протоколы представлены классические методы мониторинга экспрессии генов и определения дифференцированных типов клеток, и были адаптированы для использования в морских хрящевых рыб. Дальнейшие модификации этих протоколов могут быть необходимы для адаптации к различным видам пластиножаберных.
Наиболее распространенными озабоченность по поводу РНК целом крепления на месте "с собой риск загрязнения РНКазы и тем самым деградацию зонда РНК и эндогенных сообщений. Два аспекта необходимо учитывать: синтез riboprobe и его гибридизации с эмбриональными сообщений, а также общие методы для работы с РНК. В общем, загрязнение рибонуклеазы можно избежать с помощью пластиковой посуды из закрытых емкостях, и ранее не использовавшиеся посуды. Если новая посуда недоступен, обращаться со всеми посуду РНКазой-AWAY (VWR # 17810-491). Моет сделано, мягко слива решений на основе перфорированной ложкой и добавить свежий раствор во флакон.Кроме того, очень маленький эмбрионов или органов / тканей могут быть размещены в Netwell, что вписывается в 6-а блюдо культуры ткани. Ткани могут быть перемещены с одного решения на следующем просто сняв Netwell из одной ямы в другую. Это помогает предотвратить потерю любых тканей при заливке, а также сохраняет архитектуру ткани. Дополнительные предложения для обработки РНК и предотвращения загрязнения РНКазой можно найти в Molecular Cloning, руководство лаборатории, так и на нескольких фармацевтических веб-сайтов, в том числе Roche ( http://www.roche-applied-science.com/labfaqs/p2_1.htm ) 11 .
Поколение РНК зонд и предварительной обработки и гибридизации эмбрионов являются наиболее уязвимыми шагов к загрязнению рибонуклеазы. Антисмысловой РНК-зонды, которые дополняют родной стенограммы мРНК синтезируются в обратной транскрипции пробирке в прesence дигоксигенином-UTP. Короче говоря, ДНК плазмиды линеаризовать с уникальным ферментом рестрикции, чей сайт находится на 5 'конце гена. Это позволяет РНК-полимеразы падать в конце гена. Выберите РНК-полимеразы путем определения промотора РНК-полимеразы доступны в плазмиды, всего в 3 'в стоп-кодон. В то время как Т3 и Т7 РНК-полимеразы часто используются для pBluescript, SP6 является лучшим выбором для гены субклонировали в направленности плазмиды pGEM. В дополнение к РНКазы ингибитор, DEPC обработанной воды используется в реакции транскрипции и очистки зонда. Решение гибридизации и действия, используя PBT в предварительной обработке эмбрионов все должны быть сделаны с DEPC воды. Для очистки воды DEPC, добавляют 1 мл DEPC в 1 л воды в большой колбе и хорошо перемешать. Оставить на ночь в капюшоне и автоклав на следующий день. Такие решения, как 10 х PBS и SSC также может быть сделано с DEPC обработанной воды. После гибридизации с riboprobe, использование РНКазы такрастворов и подобные меры предосторожности не нужны.
Дополнительные переменные стоит учесть, являются концентрация и продолжительность лечения протеиназы К, которые могут повлиять на проникновение зонда. Осторожны титрования фондовом протеиназы К рекомендуется для оптимизации времени обработки для различных эмбриональных стадиях. Протокол, описанный здесь было регулярно и успешно используется с эмбрионы на стадии 20 - 31 в соответствии с Ballard 7. Для эмбрионов, которые являются очень молодыми или ткани, что особенно "липкие", моющие средства Tween-20 может быть заменен на Triton-X. Кроме того, ген-специфического изменения в протокол могут быть необходимы в зависимости от обилия стенограммы. Для уменьшения фона, 10% диметилформамида было регулярно добавляются к развитию решения (NTMT) на несколько групп 12.
В отличие от деликатного характера РНК на месте 'ю.ш., радость гистологии является то, чтоэто быстро и довольно надежный! Любая изменчивость окраски, вероятно, из-за недостаточной фиксации. Для того, чтобы ткань полностью фиксировано, то рекомендуется очень большой тканях (например, в пищеварительном тракте взрослого животного) быть разбит на более мелкие куски и свежий фиксатор решение менять каждые 10 ч в течение 48 ч период. Это может быть необходимо для оптимизации условий для фиксации, как над и под фиксированные ткани может привести к снижению срезов или неровной окраски. Кроме того, различные гистохимические пятна оптимально работать с различными фиксаторов. Таким образом, стоит изменить фиксатора в соответствии с гистохимические окраски использовали 13. 4% параформальдегида рекомендуется при фиксации мягких тканей или органов, молодые эмбрионы. Для более старых эмбрионов или целых животных, 10% формалин является предпочтительным. После тканей парафином и разрезом, она может быть использована для различных целей, в том числе РНК в месте с. Это позволяет для решения экспрессии генов на клеточном левэл. Кроме того, разделы могут быть окрашены различными гистохимических пятна для определения дифференцированных типов клеток.
Альциановым синий и ядерной быстрый красные пятна, была успешно выполнена в коньках (Leucoraja erinacea), акулы (Squalas acanthias), миксины (миксины клейкой) и миноги (Petromyzon Маринус), (неопубликованные результаты) 10,14. В дополнение к альциановым синего рН 2,5 пятно описано здесь, изменении рН альциановым синий раствор можно выделить различные mucosaccharides (т.е. sialo-против sulfomucins) 13. Различные составляющие mucosaccharide можно выделить бокаловидные клетки по функциям и локализации в желудочно-кишечном тракте 15,16. Alcian синевы в пищеварительном тракте был использован для диагностики заболеваний, таких как пищевод Барретта и повышения окрашивания панкреатических бета-клеток гранулы 17,18.
В общемМария, гистохимия и РНК целом крепления на месте Вот когда используется вместе может привести к более глубокому пониманию взаимосвязи между где ген экспрессируется во время разработки и в результате дифференцированного типа клеток. Экспрессия гена Hox задних был связан с уточнением кислоты муцин клеток кубок в урочище развития пищеварительной 10,19. Здесь я приведу пример выражения Shh и ген Hox наряду с наличием кислоты муцин-продуцирующие клетки кубок в L. тракте erinacea пищеварения. Эти методы могут быть широко применяется для различных видов хрящевых рыб, различные гены развития паттерна и различных гистологических пятна. Продолжение применения и адаптации методов морских хрящевых рыб очень важно идти в ногу с широким использованием этих животных для медико-биологических исследований моделей в физиологии, эндокринологии, токсикологии и геномики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мне нечего раскрывать.
Acknowledgments
Я хотел бы поблагодарить многих студентов, которые работали в моей лаборатории и внесли свой вклад в эволюцию этих протоколов. NAT получил поддержку от Skidmore-Союз сети, проект создан с ADVANCE NSF ПЛАТНЫЕ гранта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. | |||
References
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T. Physiology of elasmobranch fishes. Shuttleworth, R. , Springer-Verlag. 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2, Battelle Press. (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
