Summary
RNA 전체 마운트하는 방법을 결합하여
Abstract
그들은 적응 면역을 가지고 osmoregulation 1-3에 대해 고유 한 메커니즘이 할 수있는 가장 원시적 인 vertebrates만큼 해양 elasmobranchs는 생물 의학 및 게놈 연구에 대한 동물 모델을 가치입니다. 페어링 된 부속과 함께 가장 원시적 인 생활 jawed - vertebrates으로 elasmobranchs 특히 진화 및 개발에 연구를 들어, evolutionarily 중요한 모델입니다. 해양 elasmobranchs는 기후 변화 4 관계에 수산물 독극물과 스트레스 생리학을 연구하는 데 사용되었습니다. 따라서, 방법론의 발전과 적응을 용이하게하고 여러 생물 분야에 이러한 원시적 인 vertebrates의 사용을 확대 할 필요합니다. 난 여기 원위치 하이브리드 화와 유전자 발현과 elasmobranchs의 세포 조직학을 연구하는 조직 학적 기술에 RNA 전체 마운트의 성공적인 적응을 제시한다.
유전자 발현을 모니터링하는 것은 발달 biol의 특징 도구입니다ogists, 널리 발달 과정, 5를 조사하는 데 사용됩니다. 현장 하이브리드 화의 RNA 전체 마운트는 개발 배아의 조직의 시각화 및 특정 유전자 성적의 국산화 할 수 있습니다. 유전자의 메시지의 표현 패턴은 개발 프로세스와 세포 운명 결정 유전자가 제어 할 수 있습니다 무엇에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 다른 발달 단계에서 유전자의 표현 패턴을 비교하여 통찰력은 개발 중에 유전자의 변화가 어떻게 역할을 습득 할 수 있습니다.
현장 's의 전체 마운트가 조직에 유전자 발현을 지역화 할 수있는 수단을 제공하지만, 조직 학적 기술은 차별화 된 세포 유형과 조직의 식별을 위해 수 있습니다. 조직 학적 얼룩은 다양한 기능을 가지고 있습니다. 일반 얼룩은 세포 형태를 강조하는 데 사용, 예를 들어 각각 hematoxylin 및 핵 및 세포질의 일반적인 착색을위한 eosin. 아르 다른 얼룩은 특정 셀을 강조 표시 할 수 있습니다유형입니다. 예를 들어, alcian 파란색은 mucosaccharides을 식별 할 널리 사용되는 양이온 얼룩은이 논문에서보고 청바지. alcian 푸른 색으로 소화 기관의 얼룩은 mucosaccharides을 생산 블렛 세포의 분포를 확인할 수 있습니다. 짧은 펩티드에 mucosaccharide 성분의 변화는 소화 기관 6 안에서 함수에 의해 블렛 셀을 구분합니다. 동시에 현장 's와 histochemical 방법으로 RNA 전체 마운트를 사용하여, 세포 운명의 결정은 유전자 특정 표현에 연결 할 수 있습니다.
RNA는 현장의와 histochemistry에 널리 연구자들에 의해 사용되고 있지만, 해양 elasmobranchs에서의 적응과 사용이 제한하고 다양한 성공을 충족시켜 왔습니다. 난 여기 elasmobranchs 개발과 연구소에서 정기적으로 사용하는 프로토콜을 제시한다. 현장의 하이브리드 방식의 RNA의 추가 수정이 종에 적응하기 위해 필요한 수 있지만, 프로토콜은 여기 P를 설명그들의 과학적인 문의에 해양 elasmobranchs의 사용을 적응하고자 연구자에 대한 강력한 출발점이 rovide.
Protocol
해양 Elasmobranchs의 현장 하이브리드 화에 I. RNA 전체 산
1. 배아 고정 및 준비
- 스케이트 배아는 발라드 7에 따라 조작 할 수 있습니다. 유전자 표현의 탐지를위한 최적의 단계는 관심의 조직에 따라 달라집니다. 스케이트 소화 기관에서 유전자 발현을 추적하려면, 단계 7월 27일에서 30일까지 최적입니다.
- 난황 주머니에서 배아를 분리, PBS로 태아를 해부.
- 4에 50 ML 원뿔 튜브 ° C 부드럽게 흔들와의 갓 만든 4 % paraformaldehyde (PFA)의 30 ML에 수정합니다. 24 시간 수정.
- 두 번 실온에서 회전 15 분을 위해, PBT에서 배아를 씻으십시오. 현장 's의 RNA 전체 마운트에 대한 모든 솔루션 조리법은 (표 1)가 포함되어 있습니다.
- 상온에서 PBT 락 : 메탄올의 25 % 시리즈 50 %와 75 % 메탄올에 세척하여 배아를 탈수. 세차의 기간은 태아의 무대에 따라 달라집니다. 사전-N의 경우eurulation이 배아를 개최, 메탄올 시리즈의 각 세척을 5 분이면 충분합니다. 단계 30 세 배아를 들어, 세차 30 분까지 지속될 수 있습니다. 태아가 충분히 침투 각 세척 적응하는 경우 확인하려면 손에 수직 튜브를 누르고 있습니다. 배아는 튜브의 바닥에 가라 앉을 경우, 당신은 다음 세척을위한 준비가되어 있습니다. 배아는 솔루션의 상단에 떠있는 경우, 솔루션을 변경하고 특정 탈수 단계를 반복합니다.
- 부드럽게 흔들 10 분에 100 % 메탄올에 두 번 씻으십시오.
- 100 % 메탄올로 일단 건조, 배아는 프로토콜하기 전에 최소 24 시간에 -20 ° C에서 보관해야합니다. 태아가 성공적으로 -20 ° C에서 저장하고 최대 1 년에 RNA 전체 마운트에 사용되었습니다.
2. RNA 프로브의 합성
- 표현이 감지하려는 유전자의 선형 조각을 생성 할 수 있습니다. 이것은 PCR 증폭에 의해 중 수행하거나 유전자를 플라스미드를 linearizing 할 수 있습니다관심. PCR에 의해 증폭하기 위해 그의 구속력이 사이트 플랭크 유전자가 증폭 지역의 RNA 중합 효소의 결합 사이트를 삽입하고 유지 프리 머를 선택합니다. 이러한 PBS 또는 pGEM, M15 순방향 및 역방향 프리 머와 같은 일반적으로 사용되는 plasmids에 이상적입니다. 또는 유전자의 5 '끝에 cleaves 효소와 QIAGEN miniprep의 DNA의 15 μl를 소화하여 플라스미드를 linearize. 젤 추출하고 적절한 QIAquick 키트를 사용하여 정화.
- 해당 RNA의 효소를 (전사 반응을 표 2 참조)를 사용하여 템플릿으로 PCR 제품의 선형 플라스미드 또는 100 NG 8 μl를 사용하여 RNA 프로브를 고쳐 쓰다 역.
- 37 번 2 시간에 역 전사 반응 ° C.를 품다
- 반응을 확인하려면 1 % 아가로 오스 / 태 젤의 전사 반응 1 μl를 실행합니다. 염료 그냥 젤로 실행 될 때까지 100 mVolts에 젤을 실행합니다. 한 눈에 잘 띄는 밴드가 표시됩니다. 선형 DNA 템플릿 조각은 높은 molecu의 희미한 표시 될 수 있습니다고맙다 무게.
- 15 분에 37 ° C에서 전사 반응과 부화 RNAse 무료 DNAse I 1 μl를 추가합니다.
- 침전물에, 적어도 60 분이나 야간에 -20 ° C에서 100 μl TE 산도 8, 10 μl 4 M LiCl, 300 μl 백퍼센트 EtOH과 품다를 추가합니다.
- 14,000 rpm으로 4 ° C microfuge에서 10 분에 스핀.
- 70% EtOH하고 건조한 공기 펠렛을 씻으십시오.
- DH 2 O.의 20 μl에 Resuspend RNA 프로브 하이브 리다이 제이션 버퍼의 80 μl (하이브리드 버퍼가 70 ° C로 미리 예열해야합니다)를 추가합니다. 프로브는 -80에서 -20 ° C 이상에서 몇 달 동안 80 % 하이브 리다이 제이션 버퍼에 저장 될 수 있습니다 ° C.
3. 배아 사전 처리 및 하이브리드
- -20 ° C.에서 100 %의 메탄올에 저장된 배아를 제거 젊은 배아의 단계 (3.2)로 진행합니다. 나중에 무대 배아 (무대 30분의 29 <)는 배아의 몸에서 '해제'한 표피 층을 볼 수 있습니다. 들어 현미경에서 신중하게 diss프로브 침투를 극대화 할 수있는 표피 층을 요법.
- 깨끗한 유리 섬광 병에 장소 배아. 위의 설명 역 메탄올 시리즈의 배아를 Rehydrate : (75 %, 50 %, 25 % 메탄올 : PBT) 상온에서 5-30 분마다 부드럽게 각각의 솔루션을 락 음악으로. 10 분 각 PBT의 두 세차, 부드럽게 흔들를 갖춘 rehydration.
- 상온에서 1 시간을위한 PBT의 6 % 과산화수소, 흔들과 아무런 안료, 표백제 배아를 제거하려면 다음과 같이하십시오.
- , PBT에 세 번 세척하여 과산화수소를 제거 (객실 온도, 10 분마다에 흔들).
- 하이브리드 동안 프로브의 침투 수 있도록 proteinase K와 배아를 취급합니다. proteinase K의 금액과 치료 기간은 검사 할 조직과 배의 나이에 따라 달라집니다. 깊은 조직 세 이상 배아는 높은 농도와 더 이상 치료 팀을 필요로하면서 더 많은 외면적인 조직 이하 배아는 짧고 적은 proteinase K를 필요로e는 완전히 프로브 하이브 리다이 제이션에 대한 배아를 permeabilize합니다. 예를 들어, 단계 29 스케이트 배아의 내장 endoderm에 쉬 감지, 30 μg / proteinase K / PBT의 ML은 실온에서 20 분에 incubated 수 있습니다.
- 신속하게 proteinase K.을 멀리 씻어 PBT의 배아를 헹굼
- 4 % PFA, 20 분에 PBT에서 0.2 % 글 루타 알데히드가 부드럽게 흔들와 proteinase K, 접미사의 배아를 비활성화합니다.
- PBT와 10 분에 두 번 씻으십시오.
- 사전 하이브리드를 들어, 배아로 충당 할 충분한 사전 온수 하이브 리다이 제이션 용액로부터 2-3 ML를 추가합니다. 1 시간에 70 ° C에서 온수 물 욕조에 부드럽게 즐겨요.
- ° C 10 분, 얼음의 시원한 70에 하이브리드 솔루션 예열 RNA 프로브를 준비합니다. 0.5-1.0 μg / ML의 최종 농도를 얻기 위해, 신선한 preheated 하이브리드 솔루션 2 ML에 RNA 프로브의 15-20 μl를 희석. 사전 hybe를 제거하고 배아에 희석 RNA 프로브를 추가 할 수 있습니다. 태아는 단지 솔루션이 적용되어야한다,DD 더 하이브 리다이 제이션 용액 필요한 경우. 섬광의 병을 단단히 안전 뚜껑. 70 ° C 야간에 온수 물을 욕조에 부드럽게 흔들 의해 잡종을 만들다.
4. 하이브리드 세차 및 항체 하이브리드를 게시
- 새로운 섬광 유리 병 또는 Eppendorf 튜브에 태아 및 장소에서 프로브와 함께 하이브 리다이 제이션 솔루션을 제거합니다. 프로브가 -20 ° C에 저장하고 나중에 재사용 할 수 있습니다. 포스트 하이브리드 세차를 들어, Netwell의 장소 배아는 6 잘 조직 배양 플레이트에 앉아 있어요.
- 30 분 전 예열 솔루션의 각 # 1, 70에 흔들 ° C.에 대해 3 번 씻으십시오
- 30 분 전 예열 솔루션의 각 # 2, 70에서 흔들 ° C.에 대해 3 번 씻으십시오
- 실온에서 흔들 TBST에 5 분 각각에 대해 3 번 씻으십시오.
- 실온에서 흔들 1 시간에 TBST에서 10 % 열 inactivated 양 혈청과 사전 블록.
- Netwell에서 신선한 유리 섬광 유리 병에 배아를 전송합니다. 안티 파를 추가합니다1퍼센트 열 inactivated 양 혈청 / 태아에 TBST에 팹 조각 (1:5,000). 4 ° C.에서 하루 아침에 흔들
5. 게시물 항체 하이브리드는 목욕 용품
- 항체를 제거하고 폐기합니다. 세차에 다시 Netwell로 장소 배아.
- 실온에서 흔들, TBST에서 5 분마다 3 번 씻으십시오
- 실온에서 흔들, 1 시간마다 적어도 6 번 씻으십시오.
- 4 ° C.에 흔들, TBST에서 하루 아침에 씻어 게시물 항체 세차는 배경 착색을 줄이기 도움으로 세차의 수와 기간을 극대화하는 것이 바람직합니다. 태아도 정기적으로 주말, 4 ° C에서 TBST에 씻어 수 있습니다.
6. 프로브의 감지
- 신선한 NTMT 솔루션을 확인하고 소독 필터링합니다.
- 깨끗한 유리 섬광 병에 TBST 세척 솔루션과 장소 배아를 폐기하십시오. 객실 온도, 요동에서 10 분마다 신선한 NTMT에 태아에게 3 번 씻으십시오.
- NTMT는 반응 믹스를 씻고 추가, 제거1 개 NBT / NTMT에 1 개 BCIP의. 이 반응물은 빛에 민감한에 따라, 실온에서 호일과 바위에 섬광 유리 병을 다룹니다.
- 원하는 유전자 발현 명확하게 보일 때까지 색 반응 할 때마다 15 분을 모니터링합니다. 강력한 프로브 개발 최소 최대 10 분 정도 걸릴 수 있습니다. 약 프로브 1-2 시간이 걸릴 수 있습니다. 반응이 너무 길거나 배경 착색이 (전체 배아가 지루 자주색 또는 갈색의 색상을 설정하는 시작) 표시됩니다에 놓지 마십시오.
- 객실 온도, 락의 PBT에서 10 분마다 2 번 씻으십시오.
- 4 % paraformaldehyde에 접미사의 배아, 실온에서 1 시간에 0.1 % 글 루타 알데히드. 태아는 4 ° C.에 정착액에 무한정 저장 할 수 있습니다
- 해부 stereomicroscope으로 배아를 표시합니다. 사전 강화 1퍼센트 아가로 오스 / PBS와 요리에 사진, 장소 배아의 밝은 파란색 배경을 생성합니다.
7. 해양 elasmobranchs의 현장 하이브리드 화에 I. RNA 전체 산에 대한 대표 검색 결과
소닉 고슴도치 (쉬)와 스케이트 배아의 Hoxa13의 현장의 묘사 표현의 RNA 전체 마운트는 그림 1에 표시됩니다. 높은 vertebrates에서 쉬의 표현은 notochord와 내장 endoderm에서 발견되며,이 표현식 패턴은 스케이트 (그림 1a) 8,9에 보존되어 있습니다. 해양 elasmobranchs이 분비 소금으로 직장 선을 사용 osmoregulation의 독특한 방법이 있습니다. Hoxa13 표현합니다 (그림 1b) 10 개발 항문에 넣는 선 (腺)에서 높다. 직장 선은 알 수없는 상태 패턴에 Hoxa13 유전자 산물의 역할.
II. 파라핀은 삽입과 Elasmobranch 조직을 Sectioning
1. 수확 및 조직의 준비
- 원하는 조직을 해부하고 실온에서 흔들, 24-48 시간에 대한 포르말린 10 % 해결할 수 있습니다. 4 % paraformaldehyde (PFA)도 정착액으로 사용할 수 있습니다(토론 참조).
- 30 분마다, PBS로 3 번 세척하여 정착액을 씻으십시오. 조직의 크기에 따라 세척 시간은 10 분으로 감소 될 수있다 또는 1 시간에 증가했다.
- 실온에서 PBS 흔들 : 25 %, 50 % 및 75 % 에탄올의 에탄올 시리즈에서 세척에 의해 배아를 탈수. 다시 말하지만, 각 세탁의 시간은 조직의 크기에 따라 달라집니다. 0.5 cm 세 조직의 경우, 15 분 각 빨래를 품다. 큰 조각 시간을 향상시킬 수 있습니다. 조직의 장기 보관이 필요한 경우, 최대 1 년에 -20 ° C에서 75 % 에탄올과 저장소에 추가를 두 번 씻는다. 그렇지 않으면 다음 단계로 진행합니다.
- 또한 흔들, 15 분마다 100 %의 에탄올에 3 번 세척하여 탈수.
2. 삽입 및 Sectioning 파라핀
- 나사 캡 뚜껑이있는 유리 섬광 병에 5 분마다 크실렌에 2 번 세척하여 조직을 명확히하십시오. 크실렌은 조직이 부서지기 쉬운 렌더링되므로이었다 10 분의 총을 초과하지 않는HES. 당신은 빛에 수용 할 때 조직은 반투명 보일 것입니다. 조직은 두 세차 후 여전히 불투명 한 경우, 프로토콜을 진행 한 다음 5 분을 위해 크실렌에 추가 세척을합니다. 만 장갑을 같이 퓸 배출 후드 내부 크실렌를 처리합니다.
- 크실렌을 제거하고 녹인 파라핀과 삼분의이 전체 섬광 병을 작성하십시오. 30 분에 60 ° C의 오븐에서 알을 품다. 유리 병에 파라핀를 넣어 때 파라핀 그 병의 측면을 따라 더욱 강화 알 수 있습니다. 오븐에 병을 놓고 파라핀 몇 분 동안 다시 분해 할 수 있습니다. 오븐 밖으로 병을 가지고 솔루션에게 부화의 나머지 오븐에서 혼합 대체 할 수있는 빠른 소용돌이을 제공합니다.
- 반복 파라핀은 30 분에 두 번 incubations.
- 시간마다 두 번 파라핀에 품다. 파라핀에게 마지막 시간을 변경하고 60 ° C의 오븐에 밤새 품다.
- 다음 날, 2-3 시간에 진공 온수 파라핀 욕조 챔버과 장소에 조직을 배치. 이 조직에 파라핀의 침투를 촉진하고 기포를 제거합니다. 얇은 조직의 일부 유형의 진공 단계가 필요하지만, 전체 배아 또는 소화 기관 및 luminal 구획과 다른 기관에 필요한되지 않을 수 있습니다.
- 녹인 파라핀, 그리고 얼음 접시에 시원한있는 금형에 조직, 장소 조직의 침투를 진공 촉진 한 후. 금형의 조직을 제거하기 전에 얼음 또는 4 ° C 하룻밤에 둡니다. 조직의 파라핀 블록은 4 ° C.에서 무한정 저장할 수 있습니다
- 장소 파라핀 마이크로톰로 블록과 8 μm 섹션을 잘라. 섹션 ° C 48 가열 물 목욕에 떠내려와 유리 Superfrost * 플러스 슬라이드에 장착해야합니다.
- 37 ° C의 오븐에 밤새 드라이 슬라이드.
- 필요한 ° C까지 4에 저장 섹션을 제공합니다.
III. Alcian 블루 / 핵 고속 레드 Elasmobranch 조직의 청바지
1. Alcian 블루 Mucins에 청바지
- 장소 따뜻한 슬라이드에 상승에 직면 섹션과 슬라이드. 45 분에 용해.
- 장소 슬라이드 홀더에 슬라이드. 모든 결과의 솔루션은 연기 후드 내부 욕조에 포함되어 있습니다. 슬라이드는 다른 솔루션과 하나가 욕조에서 그들을 전송하여 세척합니다. 욕조에 솔루션 수준 슬라이드를 포함했는지 확인하고, 슬라이드에 조직이 완전히 침수되어 있습니다. 5 분마다 크실렌에서 슬라이드에게 2 번 세척하여 파라핀을 용해.
- 1 분마다 100 %의 에탄올과 슬라이드를 두 번 씻으십시오.
- 1 분 각 솔루션에 세탁기 에탄올 시리즈 슬라이드 (75 %, 50 %, 25 % 에탄올)을 Rehydrate. 1 분에 DH 2 O에 씻으십시오.
- 15 분에 Alcian 블루 솔루션, 산도 2.5 청바지.
- 3 분에 수돗물을 실행에 세척하여 얼룩을 개발합니다. DH 2 O.에 한 번 수영
- 10 분 동안 원자력 빠른 레드 Counterstain 솔루션에 Counterstain.
- 3 분에 수돗물을 실행에 깨끗이 씻어 DH 2 O 한 번에 찍었다.
- Dehy20 딥 각각, 또는 1 분마다 에탄올 시리즈 (25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 100 %)에 drate. 5 분마다 크실렌에 2 번 씻으십시오. DPX 장착 매체와 coverslips를 탑재합니다. 슬라이드를 조작하기 전에 연기 후드에서의 48 시간에 건조하고 굳어 매체를 장착 할 수 있습니다.
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Representative Results
L.의 여러 지역에서 alcian 푸른 색 착색의 예 erinacea의 소화 기관은 그림 2에 표시됩니다. globlet 세포를 포함하는 산성 점액은 소화 기관을 통해 얼룩 alcian 파란색으로 명확하게 볼 수 있습니다. 산 mucins의 배포 따라서 기능의 차이를 반영, 소화 기관의 다른 지역에서 다릅니다. 산 mucins의 높은 농도는 말초 장 (2B와 그림 2a 및 2C을 비교)에 감지하는 동안 산성 mucins는 띄엄 띄엄, 나선 장과 배설강에서 생산하고 있습니다.
| PBT | 1 개 PBS |
| 0.1 % 십대 초반-20 | |
| Nalgene 형 조직 문화 필터 단위로 필터 소독. | |
| 20 X SSC, pH를 4.5 </ TD> | 3 M NaCl |
| 0.3 M의 NaCitrate | |
| 구연산으로 산도를 조정합니다. | |
| 하이브리드 솔루션 | 50 % 포름 아미드 |
| 1.3 X SSC, pH를 4.5 | |
| 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8 | |
| 50 MG / ML tRNA | |
| 0.2 % 십대 초반-20 | |
| 0.5 % 제군들 | |
| 100 MG / ML 헤파린 | |
| 최대 1 년에 -20 ° C에서 나누어지는 및 매장. | |
| Proteinase K | 10 MG / ML 주식 솔루션 |
| -20 ° C.에서 0.5 μl Eppendorf 같은 튜브 및 매장에 20 μl aliquots | |
| 솔루션 # 1 | 50 % 포름 아미드 |
| 1.3 X SSC, pH를 4.5 | |
| 0.2 % 십대 초반-20 | |
| -20 ° C에서 저장 | |
| 솔루션 # 2 | 50 % 포름 아미드 |
| 1 개 SSC, pH를 4.5 | |
| 0.2 % 십대 초반-20 | |
| -20 ° C에서 저장 | |
| 양 혈청 | 55 ° -20에서 1 시간, 그리고 aliquots에서 저장소에 대해 C ° C.에 가열에 의해 비활성화 |
| 10 × TBS | 80g NaCl |
| 2g KCl | |
| 250 ML, 1 M 트리스 - HCL, pH를 7.5 | |
| 1 L에 물을 추가 | |
| 1 개 TBST | 1 개 TBS |
| 0.1 % 십대 초반-20 | |
| NTMT | 100 MM NaCl |
| 100 MM 트리스 - HCL, pH를 9.5 | |
| </ TD> | 50 MM MgCl 2 |
| 0.1 % 십대 초반-20 | |
| 사용하고 필터까지 약 100 ML 신선한하십시오. | |
| 200 X NBT 재고 | 디메틸 포름 아미드 70% 50 MG / ML NBT |
| 한 ML의 aliquots에서 -20 ° C에서 저장합니다. | |
| 200 X BCIP 재고 | 물에 25 밀리그램 / ML BCIP |
| 한 ML의 aliquots에서 -20 ° C에서 저장합니다. |
표 1. 원위치 솔루션에 전체 마운트를 RNA.
| 플라스미드 선형화 | 8 μl |
| 10 × 스크립트 버퍼 | 4 μl |
| 파 - UTP 염기 혼합 | 2 μl |
| RNAse 억제제 | 0.5 μl |
| RNA중합 효소 (SP6, T3 또는 T7) | 1 μl |
| RNAse 무료 멸균 H 2 0 | 4.5 μl |
| 총 볼륨 | 20 μl |
표 2. 스크립트가 반응 RNA 프로브를 생성합니다.
그림 1. 쉬와 Leucoraja erinacea의 배아에서 Hoxa13 표현이 원위치 하이브리드 화의 RNA 전체 마운트하여 시각화합니다. (가) 쉬 표현은 단계 29 스케이트의 배아에서 검출된다. ( ')가 높은 배율이 (가)에서 쉬 표현을 나타 notochord (화살촉)와 내장 endoderm (화살표). (B) Hoxa13 예pression는 무대 29 스케이트 배아의 항문에 넣는 선 (화살표)로 지역화 (B)의 배아에서 (B ') 해부하는 소화 기관은 직장 선에 Hoxa13 성적 표현의 특이성을 보여줍니다 전자, endoderm,.. N, notochord는 ,. RG, 직장 선은 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 산성 점액 - 생산 고 블렛 셀의 스케이트 소화 기관이. (A, C) 낮은 숫자 산성 점액 - 생산 고 블렛 셀의 유통은 alcian 파란색 (화살표) 각각 나선 장과 배설강에 얼룩에 의해 감지됩니다. (B)말초 소장은 산성 점액의 블렛 세포 (화살표)의 높은 밀도를 포함하고 있습니다. 모든 패널에서 핵은 얼룩 핵 빠른 붉은 색으로 명확하게 볼 수 있습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
제시 프로토콜은 유전자 발현을 모니터링하고 차별화 된 세포 유형을 식별하기 위해 고전 방법이며, 해양 elasmobranchs에서 사용에 맞게 조정되었습니다. 이러한 프로토콜의 추가 수정이 다른 elasmobranch 종에 적응하기 위해 필요한 수 있습니다.
현장 's의 RNA 전체 마운트에 대한 가장 일반적인 문제는 RNase 오염의 위험함으로써 RNA 프로브 및 내생 메시지의 저하입니다. 두 측면이 고려 될 필요가 : riboprobe의 합성 및 하이브리드 배아 메시지와 RNA를 처리하기위한 일반적인 기법입니다. 일반적으로 ribonucleases에 의한 오염 열지 않은 용기에서 plasticware를 사용하여 피할 수 있으며, 이전에 사용하지 않은 유리 할 수 있습니다. 새로운 유리를 사용할 수없는 경우, RNase - 멀리 (VWR # 17810-491)으로 모든 유리를 취급합니다. 세차는 부드럽게 구멍 스푼을 통해 솔루션을 주입하고 유리 병에 신선한 솔루션을 추가하여 이루어집니다.또는 아주 작은 배아 나 장기 / 조직은 6 잘 조직 배양 접시에 맞는 Netwell에 배치 할 수 있습니다. 조직은 단순히 다음에 잘 하나 Netwell을 리프팅하여 한 솔루션에서 다음으로 이동 할 수 있습니다. 이 붓는하여 조직의 손실을 방지하는 데 도움이, 또한 조직의 구조를 보존합니다. RNA를 취급하고 RNase의 오염을 방지하기위한 추가 제안 사항은 분자 복제에서 찾을 수 있습니다, 로슈 (포함 실험실 설명서, 그리고 몇 가지 제약 웹 사이트에서, http://www.roche-applied-science.com/labfaqs/p2_1.htm ) 11 .
RNA 프로브의 생성 및 배아의 사전 처리 및 하이브리드는 ribonucleases에 의한 오염에 가장 취약한 단계입니다. 기본 mRNA 기록을 보완 안티센스 RNA 프로브는 PR에 체외 역 스크립트에 의해 합성 아르digoxigenin-UTP의 esence. 간단히, cDNA plasmids은 누구의 사이트 유전자의 5 '끝 부분에 위치하고 있으며 고유 한 제한 효소로 선형화되어 있습니다. RNA의 효소는 유전자의 끝에서 떨어질하기 위해이 있습니다. 플라스미드, 단 3 '중지 코돈에에서 사용할 수있는 RNA의 효소 프로모터을 식별하여 RNA 중합 효소의를 선택합니다. T3와 T7 RNA의 polymerases은 종종 pBluescript에 사용되는 반면, SP6는 방향 pGEM의 plasmids에 subcloned 유전자에 대한 선택입니다. RNase 저해제뿐만 아니라, DEPC - 처리 된 물은 프로브의 전사 반응과 정화에 사용됩니다. 하이브리드 솔루션과 태아의 전처리에서 PBT를 사용하는 단계는 모든 DEPC 물하여야한다. DEPC의 살게요 물에, 대형 플라스크에 물 1 L에 DEPC의 1 ML을 추가하고 잘 섞는다. 후드에서 하룻밤두고 다음날 압력솥. 이러한 10 × PBS와 SSC와 같은 솔루션도 DEPC - 처리 물로 만든 될 수 있습니다. 하이브리드 후 riboprobe와 함께 RNase-자유의 사용하도록lutions와 유사한 조치가 더 이상 필요하지 않습니다.
고려 가치가 추가 변수는 농도와 프로브의 침투에 영향을 미칠 수 proteinase K 처리의 길이입니다. proteinase K 주식의주의 적정 서로 다른 배아 단계의 치료 시간을 최적화하는 것이 좋습니다. 프로토콜은 여기에 설명 정기적으로 성공적으로 단계 20에서 배아와 함께 사용되었습니다 - 발라드 7에 따라 31. 아주 어린이나 특히 "끈적"입니다 조직에 대한 아르 배아를 들어, 세제 십대 초반 - 20 트리톤-X로 대체 할 수 있습니다. 또한, 프로토콜에 대한 유전자 관련 수정은 성적 증명서의 풍부한에 따라 필요할 수 있습니다. 배경을 줄이기 위해 10 % dimethylformamide는 정기적으로 여러 그룹 12 개발 솔루션 (NTMT)에 추가되었습니다.
현장 's의 RNA의 민감한 대조적으로, 조직학의 기쁨은 있습니다그것은 빠르고 아주 절대 안전한입니다! 얼룩의 모든 변화 가능성이 불충분 한 고정 때문입니다. 그 조직이 완전히 고정되어 있는지 확인하려면, 매우 큰 조직 (예 : 성인 동물의 소화 기관 등) 작은 조각과 신선한 정착액 솔루션으로 해부하는 것이 좋습니다는 48 시간 기간 동안 매 10 시간을 대체. 그것은 고정에 대한 조건을 최적화해야 할 수도 있습니다, 모두에 따라 이상 - 고정 조직은 가난한 sectioning 또는 고르지 착색 될 수 있습니다. 또한, 다른 histochemical 얼룩은 다른 fixatives과 가장 적절하게 작동합니다. 그러므로, 13을 사용 histochemical 얼룩에 따라 정착액을 수정 가치가있다. 부드러운 조직 기관 또는 젊은 배아를 해결하는 경우 4 % paraformaldehyde을 권장합니다. 이전 배아 또는 전체 동물에 대한 포르말린 10 % 선호합니다. 일단 조직이 파라핀 포함하고 sectioned입니다, 그것은 현장 's의 RNA를 포함하여 여러 목적으로 사용할 수 있습니다. 이것은 세포 레바의 유전자 표현의 해상도를 허용엘. 또한, 섹션은 차별화 된 세포 유형을 식별하기 위해 다른 histochemical 얼룩 물들 일 수 있습니다.
alcian 파란색과 핵 빠른 붉은 착색이 성공적으로 스케이트 (Leucoraja erinacea), 돔 발상 어 (Squalas의 acanthias), hagfish (Myxine glutinosa)와 칠성 장어 (Petromyzon marinus), (게시되지 않은 결과) 10,14에서 수행되었습니다. alcian 푸른 산도에 추가 2.5는 alcian 블루 솔루션의 pH가 다른 mucosaccharides (예 sialo-대 sulfomucins) 13를 구별 할 수 있습니다 수정, 여기에 설명 청바지. 다른 mucosaccharide 성분은 소화 기관 15,16 내 기능 및 현지화하여 블렛 세포를 구별 할 수 있습니다. Alcian 파란은 배럿의 식도 등의 조건을 진단하고 췌장 베타 세포 과립 17,18의 착색을 향상하는 데 사용 된 소화 기관에 얼룩.
요약해서 말하면메리, histochemistry와 함께 사용 시츄 's에 전체 마운트를 RNA는 유전자가 개발하고 그 결과 차별화 된 세포 유형 중에 표현되는 사이의 링크의 더 나은 이해로 이어질 수 있습니다. 뒤쪽 Hox 유전자의 표현은 개발 소화 기관 10,19의 산성 점액의 고 블렛 셀의 사양에 연결되어 있습니다. 난 여기 쉬의 표현과 L.의 산 점액 - 생산 고 블렛 세포의 존재와 함께 Hox 유전자의 예를 제공합니다 erinacea의 소화 기관. 이 기술은 널리 elasmobranchs, 다른 발달 패턴의 유전자와 다른 조직 학적 얼룩의 다른 종에 적용 할 수 있습니다. 해양 elasmobranchs에 대한 지속적인 응용 프로그램 및 기술의 적응은 생리학의 바이오 메디컬 연구 모델이 동물의 광범위한 사용, 내분비학, 독성학 및 게놈과 속도를 유지하는 것이 중요합니다.
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Disclosures
나는 공개 할 아무 것도 없습니다.
Acknowledgments
내 연구실에 근무하고 이러한 프로토콜의 발전에 공헌 한 많은 학부 학생을 감사하고 싶습니다. NAT는 Skidmore - 연합 네트워크 교부금을 지불 NSF 사전으로 설립 프로젝트에서 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. | |||
References
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