Имплантация раковых клеток в органе происхождения могут служить в качестве полезного доклинической модели для оценки новых методов лечения. MB49 карциномы мочевого пузыря клетки могут быть выращены в мочевом пузыре следующие внутрипузырного введения. Этот протокол демонстрирует катетеризации мочевого пузыря мыши с целью имплантации опухоли и аденовирусной доставки.
Рак мочевого пузыря является второй наиболее распространенной формой рака из урогенитального тракта и новых терапевтических подходов, которые могут снизить рецидив и прогрессирование необходимы. Микросреда опухоль может значительно влиять на развитие опухоли и ответ терапии. Поэтому часто бывает желательно выращивать опухолевые клетки в органе, из которого они произошли. Этот протокол описывает Ортотопическая Модель рака мочевого пузыря, в котором MB49 мышиные клетки карциномы мочевого пузыря закапывают в мочевой пузырь через катетеризации. Успешной имплантации опухолевых клеток в этой модели требуется разрушение защитного слоя гликозаминогликанов, который может быть достигнуто физическими или химическими средствами. В нашем протоколе мочевой пузырь обрабатывали трипсином до клеток закапывания. Катетеризации мочевого пузыря может также использоваться для доставки терапевтических средств после того, как опухоли установлено. Этот протокол описывает доставку аденовирусной конструкции, которая выражает люциферазы ген-репортер. В то время как оПротокол ур была оптимизирована для краткосрочных исследований и фокусируется на доставки генов, методология мыши катетеризации мочевого пузыря имеет широкое применение.
Рак мочевого пузыря является второй наиболее распространенной формой рака из урогенитального тракта с почти 75 000 новых случаев заболевания и 15 000 случаев смерти, ожидаемых в 2012 г. 1. Высокие темпы повторения требуют пожизненной последующей деятельности, что делает рак один из самых дорогостоящих видов рака для лечения мочевого пузыря. Рак мочевого пузыря, который захвачена мышечный слой может метастазировать в печень, легкие или кости через лимфатическую систему. Мультимодальные терапия опухолей на поздних стадиях приводит только 20-40% выживания после 5 лет. Таким образом, эффективные стратегии лечения, направленные на снижение рецидивов и прогрессирования поверхностного рака мочевого пузыря, а также улучшения терапевтического эффекта у пациентов с прогрессирующим заболеванием срочно необходимы.
Разработка новых терапии требуется доклинических моделей для оценки эффективности после первоначальной оценки в пробирке. Микросреда опухоль может значительно влиять на развитие рака и отзывчивость, в котором подчеркивается необходимость preclinicаль модели, в которых опухоли возникают или могут быть установлены в органе происхождения. Один из подходов является разработка трансгенных моделей, в которых опухоли возникают спонтанно или могут быть вызваны в форме конкретных органов. Отличным протокол из трансгенной модели рака мочевого пузыря был недавно опубликован 2. Недостатком трансгенных моделей является то, что опухоли, как правило, развиваются медленно и с меньшим однородности, чем хотелось бы. Кроме того, расходы на содержание гнездовой колонии должен быть рассмотрен. Альтернативой трансгенных моделей ортотопическая имплантации опухолевых клеток, который имеет преимущество коротких сроков для установления опухоли в коммерчески доступных мышей. Хотя некоторые линии рака мочевого пузыря клеток человека могут быть выращены ортотопически (мы успешно использовали UM-UC-3), может быть желательно установить опухолей у иммунокомпетентных мышах. Два мышиные рак мочевого пузыря клеточные линии, которые растут ортотопически являются MBT-2 и MB49 3. С MBT-2 клетки загрязнены тиражированиеТип C ретровирус 4, мы выбрали MB49 клетки для наших исследований. Важно отметить, что MB49 клетки выделяли из самца мыши и ортотопической имплантации предназначены для анатомических причин, выполненных в самок мышей. Это имеет то преимущество, легкой идентификации имплантированных клеток по маркеров Y-хромосомы, но гендерный несоответствие может быть недостатком для иммунологических исследований.
Эпителий мочевого пузыря выстлана гликозаминогликаны (ГАГ слоя), который функционирует как барьер для инфекции микроорганизмов. Этот барьер может также помешать имплантации опухолевых клеток и нескольких методов были разработаны, чтобы преодолеть эту трудность (табл. 1). Электрокоагуляции широко используется как физическими средствами сорвать кляп слой 5-13 и протокол демонстрируя электрокоагуляция был недавно опубликован в Юпитер 14. Тем не менее, следует электрокоагуляция устройство не доступны, химические средства для уничтожения GAG слой, такой как нитрат серебра или поли-L-лизина можно также использовать 15-24. Опухоли установлены эффективно с помощью кратковременной мочевого пузыря до небольшого объема нитрата серебра (5-10 мкл, 0.15-1.0 M, ~ 10 сек) или более контакт с поли-L-лизина (100 мкл 0,1 мг / мл в течение 20 мин) (табл. 1). Здесь мы опишем метод, который использует трипсин для облегчения имплантации MB49 клеток.
В попытке улучшить терапевтические подходы для рака мочевого пузыря, генная терапия привлекло значительное внимание. С клинической точки зрения, рак мочевого пузыря является идеальным объектом для генной терапии вследствие легкой доступности органа и способность к локально доставки полезной нагрузки. Вирусные векторы, которые были изучены для генной терапии рака мочевого пузыря включают онколитический вирус простого герпеса 25, 26 ретровирус, вирус оспы канареек 27, вирус коровьей оспы, AAV, и adenoviruS 28. Во второй части нашего протокола, мы опишем метод для вирусной доставки, которая практически не отличается от закапывания опухолевых клеток. Интересны в нашей лаборатории является разработка новых подходов к доставки генов, которые мы оцениваем с помощью биолюминесценции с помощью аденовирусного вектора, который выражает люциферазы трансген. Тем не менее, методика катетеризации мочевого пузыря может быть использован для доставки различных агентов и, следовательно, имеет широкое применение.
Основная методика, описанная в этом протоколе является катетеризация пузырей мыши, который имеет широкое применение для закапывания клеток или любого агента, предназначенного для локальной доставки в эпителии мочевого пузыря. Конкретный протокол указано выше была оптимизирована дл?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIH R21 CA143505 Кристине Voelkel-Джонсон.
Name of reagent |
Company |
Catalog number |
Comments |
6-8 week old female mice |
Jackson Laboratories |
Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664 |
|
Trypsin* |
MediaTech |
MT25-053-CI |
Obtained through Fisher |
DMEM* |
MediaTech |
MT10-017-CV |
Obtained through Fisher |
FBS |
Hyclone |
SH30071.03 |
Heat-inactivated |
T25 flasks* |
Corning Costar |
Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 |
Obtained through Fisher |
MB49 cells |
N/A |
N/A |
Obtained from Dr. Boehle (see reference11) |
Puralube Vet Ointment* |
Pharmaderm |
Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869 |
Obtained through Fisher |
Depilatory cream: Veet |
local pharmacy |
||
Lubricant: K-Y Jelly |
local pharmacy |
||
Catheters* |
Exel International |
Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21 |
Obtained through Fisher |
Isoflurane |
Terrell |
NDC 66794-011-25 |
Obtained though hospital pharmacy |
1 ml slip tip TB syringes |
Becton Dickinson |
BD309659 Fisher:14-823-434 |
|
D-Luciferin |
Gold Biotechnologies |
L-123-1 |
|
Ad-CMV-Luc |
VectorBiolabs |
1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use |
Infectious agent that requires BSL2 containment |
Steady-Glo Luciferase Assay System |
Promega |
E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml) |
*available through multiple vendors
EQUIPMENT
Material name |
Company |
Catalog number |
Comments |
Anesthesia system |
E-Z Systems, Euthanex Corporation |
Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109 |
Obtained through Fisher |
Xenogen IVIS 200 |
Caliper Life Sciences |
http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm |
|
FLUOstar Optima |
BMG Labtech |
http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |