השתלה של תאים סרטניים לתוך האיבר ממוצא יכולה לשמש מודל פרה שימושי כדי להעריך את הטיפולים חדשניים. ניתן לגדל תאי קרצינומה של שלפוחית השתן MB49 בתוך שלפוחית השתן בעקבות החדרת שלפוחית. פרוטוקול זה מדגים צנתור של שלפוחית השתן בעכבר לצורך השתלת גידול ואספקת adenoviral.
סרטן שלפוחית השתן הוא הסרטן השני בשכיחותו בדרכי השתן ואברי המין וגישות טיפוליות חדשניות שיכול להפחית את ההישנות והתקדמות נדרשות. Microenvironment הגידול יכול להשפיע באופן משמעותי את התפתחות גידול ותגובה לטיפול. לכן לעתים קרובות רצוי לגדל תאים סרטניים באיבר שממנו הם מקורו. פרוטוקול זה מתאר מודל orthotopic של סרטן שלפוחית השתן, שבו תאי סרטן שלפוחית השתן עכבריים MB49 הם החדירו לתוך שלפוחית השתן באמצעות צנתור. השתלת תאים סרטניים מוצלחת במודל זה דורשת שיבוש של שכבת glycosaminoglycan מגן, שיכול להתבצע על ידי אמצעים פיזיים או כימיים. בפרוטוקול שלנו מטפל בשלפוחית השתן עם טריפסין לפני החדרת תא. גם צנתור של שלפוחית השתן יכול לשמש כדי לספק תרופות פעם הגידולים מבוססים. פרוטוקול זה מתאר את המסירה של מבנה adenoviral שמבטא את גן כתב לוציפראז. בעוד oפרוטוקול ur כבר מותאם למחקרים לטווח קצר ומתמקד במסירת הגן, יש לו את המתודולוגיה של צנתור שלפוחית השתן עכבר יישומים רחבים.
סרטן שלפוחית השתן הוא הסרטן השני בשכיחותו בדרכי השתן ואברי מין עם כמעט 75,000 מקרים חדשים ו -15,000 מקרי מוות צפוי ב2012 1. שיעור גבוה של הישנות דורש מעקב לאורך כל חייהם, מה שהופך את סרטן שלפוחית השתן אחד מסוגי הסרטן היקרים ביותר לטיפול. סרטן שלפוחית השתן שפלש לשכבת השריר עלול לשלוח גרורות לכבד, ריאות או עצם באמצעות מערכת הלימפה. טיפול multimodal של תוצאות גידולים מתקדמים בהישרדות רק 20-40% אחרי 5 שנים. לכן, אסטרטגיות טיפול יעילות שנועדו להקטין את ההישנות והתקדמות של הסרטן השטחי של שלפוחית השתן, כמו גם לשפר את התוצאות טיפוליות בחולים עם מחלה מתקדמת יש צורך דחוף.
פיתוח הרפוי רומן מחייב מודלים פרה כדי להעריך את היעילות הבאה הערכה ראשונית במבחנה. Microenvironment הגידול משמעותי יכול להשפיע על התפתחות סרטן והיענות, אשר מדגישה את הצורך בpreclinicדגמי אל שבגידולים להתעורר או ניתן להקים באיבר המוצא. גישה אחת היא הפיתוח של מודלים מהונדסים שבו גידולים להתעורר באופן ספונטני או יכולים להיגרם באופן איבר ספציפי. לאחרונה פרוטוקול מצוין של מודל בסרטן שלפוחית השתן מהונדס כבר פורסם 2. החסרון של מודלים מהונדסים הוא שגידולים נוטים להתפתח באיטיות ועם פחות אחיד מרצוי. בנוסף, העלות של שמירה על מושבת רבייה צריכה להילקח בחשבון. אלטרנטיבה למודלים מהונדסים היא השתלת orthotopic של תאים סרטניים, אשר יש את היתרון של מסגרות זמן קצר להקמת גידול בעכברים זמינים מסחרי. אמנם ניתן לגדל כמה שורות תאי סרטן שלפוחית השתן אנושיות orthotopically (אנחנו השתמשנו בהצלחה UM-UC-3), זה עשוי להיות רצוי להקים גידולים בעכברים עם מערכת חיסון. שתי שורות תאי סרטן שלפוחית השתן Murine, אשר גדלות orthotopically הן MBT-2 וMB49 3. מאז MBT-2 תאים מזוהמים במשכפליםהקלד רטרווירוס C 4, בחרנו MB49 תאים ללימודים שלנו. חשוב לציין כי MB49 תאים היו מבודדים מעכבר זכר והשתלות orthotopic הן מסיבות אנטומיות שבוצעו בעכברים ממין נקבה. זו יש את היתרון של זיהוי קל של התאים המושתלים על ידי סמנים של כרומוזום Y, אבל חוסר ההתאמה בין המינים יכול להיות חסרון ללימודים חיסוניים.
אפיתל שלפוחית השתן הוא בשורה של שכבת glycosaminoglycan (GAG), המתפקדת כמחסום לזיהום על ידי מיקרואורגניזמים. מכשול זה יכול גם להפריע להשתלה של תאי גידול ומספר שיטות פותחו כדי להתגבר על קושי זה (טבלת 1). Electrocautery כבר נעשה שימוש נרחב כאמצעי פיזי כדי לשבש את שכבת GAG 5-13 ולאחרונה electrocautery הוכחת בפרוטוקול שפורסמה ב14 יופיטר. עם זאת, יש יחידת electrocautery לא תהיה זמינה, אמצעים כימיים כדי להרוס את Gגם שכבת AG כגון כסף חנקה או פולי-L-ליזין ניתן להשתמש בם 15-24. גידולים מוקמים ביעילות על ידי חשיפה קצרה של שלפוחית השתן לנפח קטן של כסף חנקתי (5-10 μl, 0.15-1.0 M, ~ 10 שניות) או קשר ארוך יותר עם פולי-L-ליזין (של 0.1 מ"ג / מיליליטר 100 μl עבור 20 דקות) (טבלה 1). כאן אנו מתארים שיטה שמשתמשת בטריפסין כדי להקל על השתלה של MB49 תאים.
בניסיון לשפר את הגישות טיפוליות לטיפול בסרטן שלפוחית השתן, טיפול גנטי צבר תשומת לב משמעותית. מנקודת המבט קלינית, סרטן שלפוחית השתן הוא יעד אידיאלי לריפוי גנטי בשל נגישות קלה של האיבר והיכולת מקומי לספק את המטען. וקטורים ויראליים שנחקרו לריפוי גנטי של סרטן שלפוחית השתן כוללים וירוס הרפס סימפלקס oncolytic 25, רטרווירוס 26, וירוס canarypox 27, וירוס vaccinia, AAV, וadenoviruזה 28. בחלקו השני של הפרוטוקול שלנו, אנו מתארים שיטה למסירת ויראלי כי הוא כמעט זהה להחדרה של התאים הסרטניים. עניין במעבדה שלנו הוא הפיתוח של גישות חדשות למסירת גן, אשר אנו מעריכים באמצעות פליטת אור באמצעות וקטור adenoviral שמבטא transgene לוציפראז. עם זאת, המתודולוגיה של צנתור שלפוחית השתן יכולה לשמש למשלוח של סוכנים שונים, ולכן יש תחולה רחבה.
המתודולוגיה העיקרית שתוארה בפרוטוקול זה היא צנתור של שלפוחיות עכבר, שבה יש יישומים רחבים להחדרה של תאים, או כל סוכן שנועד למשלוח מקומי לאפיתל שלפוחית השתן. הפרוטוקול הספציפי שתואר לעיל כבר מותאם למחקרים לטווח קצר (~ 10 ימים). להשתיל את המספר מדויק של תאים הוא קריטי, ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R21 CA143505 לכריסטינה Voelkel-ג'ונסון.
Name of reagent |
Company |
Catalog number |
Comments |
6-8 week old female mice |
Jackson Laboratories |
Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664 |
|
Trypsin* |
MediaTech |
MT25-053-CI |
Obtained through Fisher |
DMEM* |
MediaTech |
MT10-017-CV |
Obtained through Fisher |
FBS |
Hyclone |
SH30071.03 |
Heat-inactivated |
T25 flasks* |
Corning Costar |
Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 |
Obtained through Fisher |
MB49 cells |
N/A |
N/A |
Obtained from Dr. Boehle (see reference11) |
Puralube Vet Ointment* |
Pharmaderm |
Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869 |
Obtained through Fisher |
Depilatory cream: Veet |
local pharmacy |
||
Lubricant: K-Y Jelly |
local pharmacy |
||
Catheters* |
Exel International |
Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21 |
Obtained through Fisher |
Isoflurane |
Terrell |
NDC 66794-011-25 |
Obtained though hospital pharmacy |
1 ml slip tip TB syringes |
Becton Dickinson |
BD309659 Fisher:14-823-434 |
|
D-Luciferin |
Gold Biotechnologies |
L-123-1 |
|
Ad-CMV-Luc |
VectorBiolabs |
1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use |
Infectious agent that requires BSL2 containment |
Steady-Glo Luciferase Assay System |
Promega |
E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml) |
*available through multiple vendors
EQUIPMENT
Material name |
Company |
Catalog number |
Comments |
Anesthesia system |
E-Z Systems, Euthanex Corporation |
Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109 |
Obtained through Fisher |
Xenogen IVIS 200 |
Caliper Life Sciences |
http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm |
|
FLUOstar Optima |
BMG Labtech |
http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |