Implantação de células cancerosas para o órgão de origem pode servir como um modelo pré-clínico útil para avaliar novas terapias. Células de carcinoma da bexiga MB49 pode ser cultivada no interior da bexiga, após a instilação intravesical. Este protocolo demonstra a cateterização da bexiga do rato com a finalidade de implantação do tumor e entrega adenoviral.
O câncer de bexiga é o segundo tipo de câncer mais comum do trato urogenital e novas abordagens terapêuticas que podem reduzir a recorrência ea progressão são necessários. O microambiente do tumor pode influenciar significativamente o desenvolvimento do tumor e a resposta terapia. Por conseguinte, é muitas vezes desejável para crescer as células de tumor no órgão a partir do qual se originou. Este protocolo descreve um modelo ortotópico de cancro de bexiga, em que as células de carcinoma de bexiga de murino MB49 são instilada na bexiga através do cateterismo. Implantação de células de tumor bem sucedida, neste modelo requer a interrupção da camada de glicosaminoglicano de protecção, que pode ser realizada por meios físicos ou químicos. No nosso protocolo da bexiga é tratada com tripsina antes da instilação de células. Cateterização da bexiga podem também ser usados para entregar agentes terapêuticos uma vez que os tumores estão estabelecidos. Este protocolo descreve o fornecimento de uma construção adenoviral que expressa um gene repórter da luciferase. Enquanto our protocolo foi otimizado para estudos de curto prazo e se concentra na entrega gene, a metodologia de rato cateterismo vesical tem amplas aplicações.
O câncer de bexiga é o segundo tipo de câncer mais comum do trato urogenital, com cerca de 75.000 novos casos e 15.000 mortes esperadas em 2012 1. As altas taxas de recorrência ao longo da vida requerem acompanhamento, o que faz com que o câncer de bexiga um dos cancros mais caras para tratar. Cancro da bexiga que invadiu a camada muscular podem metastizar para o fígado, o pulmão ou o osso através do sistema linfático. Terapia Multimodal de tumores avançados resultados em apenas 20-40% de sobrevida após 5 anos. Portanto, as estratégias de tratamento eficazes destinadas a reduzir a recorrência ea progressão do câncer superficial da bexiga, bem como melhorar os resultados terapêuticos em pacientes com doença avançada são urgentemente necessários.
Desenvolvimento de novas terapias requer modelos pré-clínicos para avaliar a eficácia após a avaliação inicial in vitro. O microambiente do tumor pode influenciar significativamente o desenvolvimento do câncer e capacidade de resposta, o que evidencia a necessidade de pré-clínicosal modelos em que os tumores surgem ou pode ser estabelecido no órgão de origem. Uma das abordagens é o desenvolvimento de modelos transgénicos em que os tumores surgem espontaneamente ou pode ser induzida de uma forma específica do órgão. Um excelente protocolo de um modelo de câncer de bexiga transgênico foi recentemente publicado 2. A desvantagem de modelos transgénicos é que os tumores tendem a desenvolver-se lentamente e com menos uniformidade do que o desejado. Além disso, o custo de manutenção de uma colónia de reprodução tem de ser considerado. Uma alternativa aos modelos transgénicos é o implante ortotópico de células tumorais, o que tem a vantagem de prazos curtos para o estabelecimento do tumor em ratinhos disponíveis comercialmente. Enquanto algumas linhas celulares de cancro da bexiga humano pode ser cultivado ortotopicamente (temos utilizado com sucesso UM-UC-3), pode ser desejável estabelecer tumores em ratinhos imunocompetentes. Duas linhas celulares de cancro da bexiga murino, que crescem ortotopicamente são MBT-2 e MB49 3. Desde MBT-2 células estão contaminados com replicandotipo C retrovírus 4, escolhemos MB49 células para os nossos estudos. É importante notar que a MB49 células foram isoladas a partir de um rato macho e implantes ortotópicos são por razões anatómicas realizados em ratos fêmeas. Este tem a vantagem de facilitar a identificação das células implantadas por meio de marcadores do cromossomo Y, mas a incompatibilidade de gênero pode ser um inconveniente para os estudos imunológicos.
O epitélio da bexiga é revestida por um (GAG) da camada de glicosaminoglicano, o qual funciona como uma barreira para a infecção por micro-organismos. Esta barreira também pode interferir com a implantação de células tumorais e de vários métodos têm sido desenvolvidos para superar esta dificuldade (Tabela 1). Eletrocautério tem sido amplamente utilizado como um meio físico para romper a camada de GAG 5-13 e um eletrocautério demonstrando protocolo foi recentemente publicado na Jove 14. No entanto, se uma unidade de electrocautério não estar disponível, meios químicos para destruir o GAG camada tais como nitrato de prata, ou poli-L-lisina também pode ser utilizada 15-24. Os tumores são estabelecidos de forma eficaz através de uma breve exposição da bexiga a um pequeno volume de nitrato de prata (5-10 ul, 0,15-1,0 M, ~ 10 seg) ou mais, o contacto com poli-L-lisina (100 ul de 0,1 mg / ml durante 20 min) (Tabela 1). Aqui, descrevemos um método que utiliza a tripsina para facilitar a implantação de células MB49.
Em uma tentativa de melhorar as abordagens terapêuticas para o câncer de bexiga, a terapia gênica tem atraído atenção significativa. De um ponto de vista clínico, o cancro da bexiga é um alvo ideal para terapia génica devido ao fácil acesso do órgão e a capacidade para distribuir localmente a carga útil. Os vetores virais que foram exploradas para a terapia genética câncer de bexiga incluem um vírus herpes simplex oncolítico 25, 26 retrovírus, vírus de canários 27, o vírus vaccinia, AAV, e adenovirus 28. Na segunda parte do nosso protocolo, que descrevem um método para a entrega viral que é virtualmente idêntico ao da instilação das células tumorais. De interesse no nosso laboratório é o desenvolvimento de novas abordagens para a entrega do gene, que avaliam através bioluminescência, utilizando um vector adenoviral que expressa um transgene da luciferase. No entanto, a metodologia de cateterização da bexiga pode ser utilizada para a entrega dos vários agentes e, portanto, tem ampla aplicabilidade.
A metodologia principal descrito neste protocolo é o cateterismo de bexigas de rato, que tem amplas aplicações para a instilação de células ou qualquer agente destinado para entrega local para o epitélio da bexiga. O protocolo específico descrito acima foi otimizado para estudos de curto prazo (~ 10 dias). Implantar o número exato de células é fundamental, uma vez que um número de células maior resultará em crescimento do tumor e, possivelmente, mais rápida perda de animais devido a grande carga tumoral. …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo NIH R21 CA143505 para Christina Voelkel-Johnson.
Name of reagent |
Company |
Catalog number |
Comments |
6-8 week old female mice |
Jackson Laboratories |
Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664 |
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Trypsin* |
MediaTech |
MT25-053-CI |
Obtained through Fisher |
DMEM* |
MediaTech |
MT10-017-CV |
Obtained through Fisher |
FBS |
Hyclone |
SH30071.03 |
Heat-inactivated |
T25 flasks* |
Corning Costar |
Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 |
Obtained through Fisher |
MB49 cells |
N/A |
N/A |
Obtained from Dr. Boehle (see reference11) |
Puralube Vet Ointment* |
Pharmaderm |
Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869 |
Obtained through Fisher |
Depilatory cream: Veet |
local pharmacy |
||
Lubricant: K-Y Jelly |
local pharmacy |
||
Catheters* |
Exel International |
Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21 |
Obtained through Fisher |
Isoflurane |
Terrell |
NDC 66794-011-25 |
Obtained though hospital pharmacy |
1 ml slip tip TB syringes |
Becton Dickinson |
BD309659 Fisher:14-823-434 |
|
D-Luciferin |
Gold Biotechnologies |
L-123-1 |
|
Ad-CMV-Luc |
VectorBiolabs |
1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use |
Infectious agent that requires BSL2 containment |
Steady-Glo Luciferase Assay System |
Promega |
E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml) |
*available through multiple vendors
EQUIPMENT
Material name |
Company |
Catalog number |
Comments |
Anesthesia system |
E-Z Systems, Euthanex Corporation |
Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109 |
Obtained through Fisher |
Xenogen IVIS 200 |
Caliper Life Sciences |
http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm |
|
FLUOstar Optima |
BMG Labtech |
http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |